銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制

鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建 福州 350001)

銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制

鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科，福建 福州 350001)

目的 探討銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的作用及其可能的抗氧化機制。方法 30只Wistar 雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、銀杏葉藥物組(GBE組)，每組10只，銀杏葉灌胃1 w后制備心肌缺血模型。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠形態(tài)學改變；心肌梗死面積利用TTC染色測定；根據(jù)試劑盒說明測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。結(jié)果 Sham組可見心肌細胞排列整齊，各結(jié)構(gòu)完整，細胞核均勻分布；模型組部分心肌細胞壞死，細胞之間界限欠清，細胞水腫，排列紊亂；GBE組細胞小部分結(jié)構(gòu)模糊，細胞界限尚清晰，輕度水腫。GBE組大鼠心肌梗死面積明顯低于I/R組。同時，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著低于Sham組，MDA水平高于I/R組(均P<0.05)，GBE組血清SOD、GSH-Px含量明顯高于I/R組，MDA水平低于I/R組(P<0.05)。結(jié)論 GBE對大鼠MIRI具有明顯的保護作用，其可能與抑制氧化應激作用有關(guān)。

銀杏葉提取物；心肌缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)在血流恢復重建的再灌注過程加劇代謝紊亂，引起心肌超微結(jié)構(gòu)破壞的損傷過程〔1〕。關(guān)于MIRI的病理生理及機制較為復雜，包括氧自由基機制，炎癥反應浸潤，能量代謝障礙、微血管通透性機制等。

銀杏葉提取物(GBE)是較為安全的草藥補充劑，研究表明其可明顯改善外周及腦的微循環(huán)〔2〕，甚至在MIRI過程中具有明顯的保護作用。目前標準化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內(nèi)酯和其他化學物質(zhì)〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護微血管內(nèi)皮細胞。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護作用及其具可能的機制目前尚未研究，本文依據(jù)參考文獻建立大鼠MIRI模型，并利用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)來反映機體氧化還原水平，探討銀杏葉提取物對大鼠MIRI的作用及可能的抗氧化應激機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠30只，體重(220±20)g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。

1.2 藥品、試劑及儀器 GBE購自中國藥品生物鑒定研究所(純度99%)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、伊文思藍、三苯基氯化四氮唑購于sigma公司；由TaKaRa大連寶生物有限公司提供Trizol試劑、熒光定量檢測試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；由上海生工生物工程有限公司完成引物設計與合成。由廈門慧嘉生物有限公司提供SOD、MDA、GSH-Px試劑盒。

1.3 分組 應用隨機數(shù)字表法將30只健康Wistar雄性大鼠隨機分為假手術(shù)組(Sham)，缺血再管組(I/R組)，GBE組，每組10只。GBE組：造模前1 w給予0.5% GBE 50 mg/kg灌胃，而對Sham組及I/R組給予灌服0.5%CMC-Na 10 ml/kg。

1.4 MIRI模型制備 參考文獻〔4〕的方法建立MIRI模型。各組大鼠術(shù)前禁食6 h。對大鼠實施腹腔注射麻醉(20%烏拉坦按8 ml/kg)，仰臥位固定，利用Medlab采集系統(tǒng)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。正中切口切開頸部后氣管插管，并連接小動物呼吸機進行機械通氣，選擇頻率65次/min，呼∶吸比為2∶1，選擇潮氣量為8 ml/kg。剪開胸部皮膚后暴露3～4肋間肌肉，剪斷第4肋骨，刺破胸膜進入胸腔，暴露心臟，將心包膜剪開后將心臟擠出胸腔，結(jié)扎冠脈左前降支，造成急性心肌缺血模型。心電圖提示心率減慢，并出現(xiàn)寬大畸形的QRS波群，大鼠左室前壁出現(xiàn)充血、發(fā)紺，表示結(jié)扎成功。缺血30 min后給予恢復血流，心電圖提示QRS波群回落，提示再灌注成功。給予再灌注120 min。Sham組只穿線不結(jié)扎冠脈，其余操作均與余兩組相同。再灌注結(jié)束后，從腹主動脈取血，離心，凍存，進行后期血清學檢測。

1.5 利用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定心肌梗死面積 再灌注結(jié)束時，注入2 ml 2%伊文藍向左心室，離體取標本后凍存，橫向切片后，置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中浸泡，37℃條件下孵化染色20 min，4%多聚甲醛中固定，采用圖像分析軟件image-proplus6.0測定藍色、紅色、白色區(qū)域面積。藍紅白的面積之和為左心室面積(LV)，紅白之和為缺血面積(AAR)，白色面積為梗死面積(IS)。AAR百分比=AAR/LV；IS百分比=IS/AAR。

1.6 血清SOD、MDA含量的檢測 采用硫代巴比妥酸法測定血清中MDA 的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測SOD含量；采用二硫代二硝基甲苯胺法測定血中GSH-Px含量。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠形態(tài)學比較 Sham組可見心肌細胞排列整齊，各結(jié)構(gòu)完整，細胞核均勻分布；I/R組部分心肌細胞壞死，細胞之間界限欠清，細胞水腫，排列紊亂；GBE組細胞小部分結(jié)構(gòu)模糊，細胞界限尚清晰，輕度水腫。見圖1。I/R組、GBE組大鼠心肌梗死面積〔(22.130 5±2.023 9)%、(13.721 1±0.766 2)%〕，顯著高于Sham組(0%)，且GBE組低于I/R組(均P<0.01)。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA及GSH-Px水平比較 與Sham組比較，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著降低，MDA水平顯著增高，GBE組與I/R組比較，血清SOD、GSH-Px含量升高，MDA水平降低(均P<0.05)；GBE與Sham組相比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠心肌組織組織形態(tài)學比較(×400)

表1 各組大鼠血清SOD、MDA和 GSH-Px水平比較

與Sham組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05

3 討 論

目前關(guān)于MIRI的病理生理及機制較為復雜，包括氧自由基機制、炎癥反應浸潤、能量代謝障礙、微血管通透性機制等。近來微血管通透機制方面成為研究熱點，成為預防MIRI損傷性疾病新的治療方向。

最近研究發(fā)現(xiàn)，在MIRI過程，氧化應激是心臟內(nèi)皮細胞障礙的主要原因，氧化應激引起活性氧簇(ROS)增加，從而導致脂質(zhì)過氧化反應，氧化蛋白質(zhì)失活及DNA損傷等〔5〕，同時亦可刺激下游信號通路誘導各種生物效應，如促發(fā)凋亡、促發(fā)炎癥反應等。既往體外實驗研究證實〔6〕，細胞低氧復氧后也有發(fā)生這一病理生理反應。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由ROS誘導的DNA損傷可以通過增加自身磷酸化激活毛細血管擴張共濟失調(diào)癥突變蛋白(ATM)激酶〔1〕，反過來觸發(fā)的磷酸化啟動后磷酸化p53基質(zhì)蛋白〔7～9〕。從而抑制氧化應激的損傷。缺血再灌注激活了ROS相關(guān)的酶，從而激活腺嘌呤——次黃嘌呤代謝途徑，增加氧自由基的病理產(chǎn)生含量異常。而氧自由基對組成生物膜的不飽和脂肪酸具有很高的親和力，從而激發(fā)鏈式脂質(zhì)過氧化反應，細胞膜性結(jié)構(gòu)等發(fā)生脂類過氧化反應，引起線粒體酶活性降低，而細胞膜、溶酶體膜的通透性升高，引起細胞膨脹破裂。當這一反應遇到抗氧化物時，損傷效應就會終止。MDA是一種在缺血再灌注損傷病理過程中產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物，其含量高低可直接反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度。而SOD是清除氧自由基的最主要物質(zhì)，其高低可反映機體清除氧自由基的能力。GSH-Px可以清除由活性氧和·OH誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化物，保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，其活力大小可以反映機體氧化還原反應。GBE是一種草藥補充劑，可明顯改善外周及腦的微循環(huán)，甚至在MIRI過程中，具有明顯的保護作用。目前標準化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內(nèi)酯和其他化學物質(zhì)〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護微血管內(nèi)皮細胞〔10～12〕。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護作用及其對機體抗氧化反應目前尚未研究。本研究結(jié)果表明，GBE 761對大鼠MIRI具有明顯保護作用。血清學結(jié)果表明，GBE可明顯抑制大鼠體內(nèi)的氧化應激反應，并提高大鼠血清中SOD活性。

1 Bencokova Z，Kaufmann MR，Pires IM，etal.ATM activation and signaling under hypoxic conditions〔J〕.Mol Cell Biol，2009；29(2)：526-37.

2 Ribatti D，Nico B，Vacca A，etal.Endothelial cell heterogeneity and organ specificity〔J〕.J Hematother Stem Cell Res，2002；11(1)：81-90.

3 〔No authors listed〕.EGb 761：ginkgo biloba extract，Ginkor〔J〕.Drugs，2003；4(3)：188-93.

4 Gerritsen ME.Functional heterogeneity of vascular endothelial cells〔J〕.Biochem Pharmacol，1987；36(17)：2701-11.

5 Holt RR，Actis-Goretta L，Momma TY，etal.Dietary flavanols and platelet reactivity〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2006；47(2)：S187-96.

6 Kawano H，Hayashida T，Ohtani H，etal.Histopathological findings of the no-reflow 309phenomenon following coronary intervention for acute coronary syndrome〔J〕.Int Heart J，2005;46(2):327-32.

7 Makovski A，Yaffe E，Shpungin S，etal.Down-regulation of Fer induces ROS levels accompanied by ATM and p53 activation in colon carcinoma cells〔J〕.Cell Signal,2012;24(7):1369-74.

8 Maulik SK，Kumari R，Maulik M，etal.Effect of flavone in a canine model of myocardial stunning〔J〕.Indian J Exp Biol，1999；37(10)：965-70.

9 McDouall RM，Batten P，McCormack A，etal.MHC class Ⅱ expression on human heart microvascular endothelial cells：exquisite sensitivity to interferon-gamma and natural killer cells〔J〕.Transplantation，1997；64(8)：1175-80.

10 Miyashita T，Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene〔J〕.Cell，1995；80(2)：293-9.

11 Ning XH，Chi EY，Buroker NE，etal.Moderate hypothermia (30 degrees C) maintains myocardial integrity and modifies response of cell survival proteins after reperfusion〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007；293(4)：H2119-28.

12 Olmez I，Ozyurt H.Reactive oxygen species and ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Neurochem Int，2012；60(2)：208-12.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吳黎明(1956-)，男，主任醫(yī)師，碩士生導師，主要從事心臟內(nèi)科疾病研究。

鄢曉平(1972-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床醫(yī)學研究。

R54

A

1005-9202(2017)13-3177-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.023