蘇亞楠 張曉波 姚海濤 陳立強
(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)
山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠認知能力和海馬磷酸化-tau蛋白表達的影響
蘇亞楠 張曉波1姚海濤1陳立強1
(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154002)
目的 觀察山茱萸多糖對阿爾茨海默病(AD)大鼠認知能力的影響及作用機制。方法 100只Wistar大鼠隨機分為青年組、假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組各20只。采用D-半乳糖聯(lián)合β-淀粉樣蛋白(Aβ)1~40注射建立AD模型。水迷宮實驗觀察大鼠認知能力,免疫組化(SABC)法檢測大鼠海馬CA4區(qū)磷酸化tau(p-tau)蛋白表達量。結(jié)果 藥物干預(yù)后,山茱萸多糖組平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05);120 s穿越原平臺次數(shù)較模型組明顯增加(P<0.05)。山茱萸多糖組海馬區(qū)p-tau蛋白陽性染色較模型組明顯減弱(P<0.05)。結(jié)論 山茱萸多糖對AD大鼠認知能力有改善,可能與降低海馬區(qū)p-tau蛋白表達量相關(guān)。
山茱萸多糖;阿爾茨海默病;磷酸化tau蛋白;認知能力
山茱萸多糖是我國傳統(tǒng)中藥材山茱萸生物學活性物質(zhì)的重要成分,現(xiàn)已明確其成分主要有木糖和葡萄糖組成的多糖(PFCC),鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成的多糖(PFCAⅢ)等〔1〕。研究顯示〔2〕多糖有抗氧化、調(diào)節(jié)和增強免疫功能、抗衰老、保護心腦血管系統(tǒng)等作用。本實驗觀察β-淀粉樣蛋白(Aβ)1~40誘導制備阿爾茨海默病(AD)大鼠模型經(jīng)山茱萸多糖干預(yù)后學習記憶能力改變、磷酸化tau(p-tau)蛋白表達變化及其作用機制。
1.1 實驗動物和分組 清潔級Wistar大鼠100只,3月齡,體重(137.4±12.7)g。常規(guī)飼養(yǎng),隨機分為青年組、假手術(shù)組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組,每組20只。
1.2 主要試劑 山茱萸多糖提取物(4∶1)購自朗林生物制品有限公司;Aβ1~40購自無錫亞肽生物科技有限公司;多奈哌齊由法國輝瑞公司生產(chǎn);兔抗大鼠p-tau抗體(pSer422)由Sigma-Aldrich公司生產(chǎn);免疫組化(SABC)試劑盒、化學發(fā)光底物(ECL)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產(chǎn)。
1.3 模型制備和給藥 按60 mg·kg-1·d-1給大鼠腹腔連續(xù)注射D-半乳糖。6 w后,山茱萸多糖組、多奈哌齊組、模型組大鼠固定在腦立體定位儀上,依據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》〔3〕行海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1~40溶液1 μl;假手術(shù)組海馬區(qū)注射等量無菌生理鹽水。術(shù)后7 d,山茱萸多糖組以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃,多奈哌齊組以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃,模型組、假手術(shù)組以等量生理鹽水灌胃,1次/d,連續(xù)30 d。
1.4 Morris水迷宮檢測 造模后第8天、藥物灌胃30 d各組進行Morris水迷宮實驗。每次共6 d。①定位航行試驗:共5 d,上午和下午兩時段,每個時段訓練4次,以水池4個象限作為大鼠的入水點至找到平臺為止,如大鼠在120 s內(nèi)找到平臺,平臺停留30 s;如在120 s未找到平臺,將其引至平臺停留30 s。記錄大鼠軌跡路線圖,4個不同象限平均值是該次的逃避潛伏期。②空間探索試驗:第6天撤除平臺,記錄大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺位置次數(shù)及在原平臺所在象限停留時間。
1.5 取材和檢測 大鼠灌胃30 d,麻醉后固定于木板平臺上,打開胸腔暴露心臟,將灌注針沿左心室插入主動脈,剪開右心耳,0.9%生理鹽水灌注心臟,至大鼠四肢蒼白;換4%多聚甲醛溶液行心臟灌注。斷頭取腦,腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定。于海馬處取材,SABC法檢測海馬p-tau蛋白表達。胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)陽性的顆粒為陽性表達,圖像采集后用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件來計算圖像中陽性染色的平均光密度值。
1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)和S-N-K檢驗。
2.1 各組逃避潛伏期比較 干預(yù)前模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組逃避潛伏時間較青年組和假手術(shù)組明顯延長(均P<0.05);干預(yù)后與模型組比較,青年組、假手術(shù)組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組明顯縮短(均P<0.05)。見表1。
表1 各組干預(yù)前、后平均逃避潛伏期
與青年組、假手術(shù)組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.05
2.2 各組干預(yù)前、后空間探索能力比較 與干預(yù)前比較,多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組干預(yù)后穿越原平臺次數(shù)均明顯增加(P<0.05)。見表2。
2.3 各組海馬p-tau(Ser422)表達 在海馬 CA4區(qū),與青年組(0.316 8±0.011 7)、假手術(shù)組(0.319 9±0.013 0)比較,模型組p-tau(Ser422)蛋白(0.402 2±0.014 3)陽性染色明顯增強(P<0.05)。與模型組比較,多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白(0.372 3±0.012 1)陽性染色均明顯減弱(P<0.05)。而多奈哌齊組,山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白陽性染色無明顯差別(P>0.05)。見圖1。
表2 各組干預(yù)前、后120 s內(nèi)穿越原平臺次數(shù),次,n=20)
與青年組比較:1)P<0.05;與模型組比較:2)P<0.01,3)P<0.05;與干預(yù)前比較:4)P<0.05
圖1 各組海馬CA4區(qū)p-tau(Ser422)蛋白表達情況(SABC法,×400)
AD是一種神經(jīng)退行性疾病,最主要病理特征是老年斑〔4〕和神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)〔5,6〕,AD患者癡呆程度與NFTs數(shù)量密切相關(guān)。tau是神經(jīng)元中含量最高的微管相關(guān)蛋白,tau蛋白被過度磷酸化具有神經(jīng)毒性〔7,8〕。本實驗表明山茱萸多糖在調(diào)節(jié)AD大鼠海馬tau蛋白磷酸化中有積極作用,可改善AD大鼠病理進展,達到防治目的。本實驗觀察到大鼠在Morris水迷宮實驗訓練中形成穩(wěn)定的空間位置認知和空間記憶,從信息加工和提取方式來看屬于陳述性記憶,這種認知和記憶主要儲存在邊緣系統(tǒng)(如海馬)和大腦皮層相關(guān)腦區(qū)。癡呆病人最先受損且損傷重的是陳述性記憶。研究證明〔9〕,功能未受損的海馬區(qū)對空間學習記憶和獲得新信息很重要,Morris〔10〕也證明海馬受損大鼠在水迷宮學習中,隱藏平臺實驗的成績降低。本實驗說明造模大鼠海馬功能受到損害,但這種損害造成海馬區(qū)的神經(jīng)細胞功能性改變和空間學習、記憶間的關(guān)系一直沒得到合理解釋。Knierim等〔11〕認為這種關(guān)系形態(tài)學基礎(chǔ)是由兩種類型神經(jīng)元組成,一種是定位神經(jīng)細胞,是構(gòu)成認知地圖的關(guān)鍵因素;一種是方位神經(jīng)細胞,是構(gòu)成認知特定方位關(guān)鍵因素。有學者〔12〕認為神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的變化是直接影響AD患者學習、認知和記憶的神經(jīng)功能基礎(chǔ)。本實驗說明山茱萸多糖對AD大鼠的學習和記憶能力有改善作用,間接證明對海馬區(qū)受損神經(jīng)元和神經(jīng)突觸功能有修復和保護作用。
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〔2016-07-15修回〕
(編輯 王一涵)
黑龍江省衛(wèi)生廳項目(2013-233);佳木斯大學面上項目(L2012-052);佳木斯大學附屬第一醫(yī)院培育課題(jy2014-005)
陳立強(1979-),男,實驗師,碩士,主要從事神經(jīng)-體液-免疫調(diào)節(jié)機制研究。
蘇亞楠(1978-),女,主管護師,碩士,主要從事老年癡呆研究。
R34
A
1005-9202(2017)13-3152-03;
10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.013
1 佳木斯大學基礎(chǔ)醫(yī)學院