新疆地區(qū)老年真菌性角膜炎致病鐮刀菌的基因型和體外藥物敏感性

魏 華 楊 煒 趙新榮 樊凌花 王 娟

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，新疆 石河子 832008)

新疆地區(qū)老年真菌性角膜炎致病鐮刀菌的基因型和體外藥物敏感性

魏 華 楊 煒 趙新榮 樊凌花 王 娟

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，新疆 石河子 832008)

目的 研究新疆地區(qū)老年真菌性角膜炎分離鐮刀菌的基因型和藥物敏感性。方法 老年真菌性角膜炎患者角膜中分離得到的鐮刀菌758株，采用部分EF1-α基因序列比對鑒定鐮刀菌菌種和基因型；采用CLSI研究所M38方案測定鑒定出的鐮刀菌對兩性霉素B、氟康唑等11種常用抗真菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)。結(jié)果 758株鐮刀菌中經(jīng)EF1-α基因序列共鑒定出644株，本地區(qū)以腐皮鐮刀菌種復(fù)合體(FSSC)最多，共包括15個菌種，43個基因型，最常見基因型為FSSC5-d。赤霉菌種復(fù)合體(GFSC)位居第2，有3個菌種；尖孢鐮刀菌復(fù)合體(FOSC)位居第3，有6個基因型。植物性外傷、眼部手術(shù)引起的外傷GFSC角膜炎發(fā)生率明顯高于FSSC角膜炎(P<0.01)。物理、化學(xué)因素引起的外傷GFSC角膜炎發(fā)生率明顯低于FSSC角膜炎(P<0.05)。體外藥敏試驗顯示，鐮刀菌對那他霉素、兩性霉素B、伏立康唑敏感；對5-FC、制霉菌素、咪康唑、克霉唑耐藥；FSSC感染的真菌性角膜炎對伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的MIC50高出GFSC約2倍。結(jié)論 新疆地區(qū)老年真菌角膜炎患者中感染鐮刀菌主要位于3個復(fù)合體FSSC、GFSC、FOSC中；植物性外傷、眼部手術(shù)易引起GFSC角膜炎，物理、化學(xué)因素外傷易引起FSSC角膜炎；不同種鐮刀菌對伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的藥敏有差異。

真菌性角膜炎；鐮刀菌；基因型；藥物敏感性

真菌性角膜炎是一種發(fā)病率較高的致盲性角膜疾病，18%～25%的真菌性角膜炎患者因病情惡化需接受角膜移植等外科手術(shù)治療〔1〕。我國以鐮刀菌屬為主。鐮刀菌屬菌種數(shù)量多，形態(tài)差異明顯，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定將該菌屬分為22個型，65個種，50個變種，由于該方法主要通過種間細(xì)微差異來鑒定，由于鐮刀菌生長中發(fā)生的變異可影響鑒定的準(zhǔn)確性〔2〕。近年來研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌EF1-α、ITS、β-tubulin等基因并以EF1-α基因編碼蛋白翻譯機(jī)制為必要組成，有學(xué)者以此為依據(jù)設(shè)計出鐮刀菌屬的通用引物，對比其基因序列，可快速準(zhǔn)確地鑒定鐮刀菌種〔3〕。本次研究擬分析老年患者外傷史等危險因素與鐮刀菌基因型的關(guān)系，測定鐮刀菌體的抗真菌藥物敏感性。

1 資料與方法

1.1 實驗菌株 新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科自2011年1月至2015年12月收治的來自省內(nèi)各地區(qū)的老年真菌性角膜炎患者角膜中分離的鐮刀菌株758株。標(biāo)準(zhǔn)對照為2010年從我國普通微生物菌種保護(hù)中心購買的腐皮鐮刀菌、串珠鐮刀菌各1株。

1.2 鐮刀菌DNA提取 將4℃保存的鐮刀菌轉(zhuǎn)移接種到含葡萄糖的馬鈴薯瓊脂固態(tài)培養(yǎng)基中，在27℃～30℃環(huán)境下培養(yǎng)1 w，之后轉(zhuǎn)移到含葡萄糖的馬鈴薯液態(tài)培養(yǎng)基中，27℃～30℃環(huán)境下培養(yǎng)6～7 d后得到菌絲。菌絲經(jīng)液氮研磨處理后，用微生物DNA提取試劑盒(北京博奧拓達(dá)科技有限公司)提取總DNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 PCR擴(kuò)增及測序 鐮刀菌EF1-α基因的PCR引物序列合成由北京百奧萊博科技有限公司完成。選用50 μl PCR反應(yīng)體系，具體為：鐮刀菌DNA樣本2 μl，引物1、引物2分別1 μl，PCR Master Mix(上海北諾生物科技有限公司)25 μl。將擴(kuò)增出的陽性產(chǎn)物送至北京百奧萊博科技有限公司測定序列。

1.4 外傷史及藥敏測定 調(diào)查基因鑒定為陽性患者的外傷史。選用CLSI研究所M38方案對分離出的鐮刀菌行藥敏測定，質(zhì)控為ATCC10231光滑念珠菌。采用DMEM培養(yǎng)基，將兩性霉素B、氟康唑、制霉菌素等12種常用的抗真菌藥物進(jìn)行倍比稀釋，96孔板每孔加入100 μl。將分離出的菌株轉(zhuǎn)種到培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度至1.0×104～5.0×104個/ml。96孔板每孔加入菌液100 μl，27℃環(huán)境中培養(yǎng)48 h后觀察，計算50%、90%菌株的最低抑菌濃度(MIC50、MIC90)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 鐮刀菌基因型檢測結(jié)果 758株鐮刀菌中EF1-α基因序列共鑒定出644株(84.96%)。陽性EF1-α基因序列比對顯示該基因存在較好的多態(tài)性，與FUSARIUM數(shù)據(jù)庫中的菌株基因序列之間的一致性大于99%。99.38%的鐮刀菌株鑒定為腐皮鐮刀菌種復(fù)合體(FSSC)、赤霉菌種復(fù)合體(GFSC)、尖孢鐮刀菌復(fù)合體(FOSC)，0.62%鑒定為FUSARIUM SP，其中以FSSC最多(386株，59.94%)，有15個菌種，43個基因型，最常見基因型為FSSC5-d，其次為FSSC3+4-eee；GFSC位居第2位(246株，38.20%)包括：F.proliferstum、F.veryicillioides、GFSC 3個菌種；FOSC位居第3位(12株，1.86%)，包括6個基因型。見表1。

2.2 外傷史與FSSC和GFSC感染的真菌性角膜炎關(guān)系 有外傷原因的真菌性角膜炎中，植物性外傷、眼部手術(shù)引起的外傷GFSC角膜炎發(fā)生率明顯高于FSSC角膜炎(P<0.01)。物理、化學(xué)因素引起的外傷GFSC角膜炎發(fā)生率明顯低于FSSC角膜炎(P<0.05)。見表2。

2.3 鐮刀菌的藥敏試驗 644株鐮刀菌體外藥敏試驗顯示，全部鐮刀菌對那他霉素(MIC50、MIC90分別為2、3 mg/L)、兩性霉素B(MIC50、MIC90分別為2、3 mg/L)、伏立康唑(MIC50、MIC90分別為2～4 mg/L)敏感；50%以上的鐮刀菌對酮康唑、益康唑、伊曲康唑、特比萘芬敏感，MIC50、MIC90均為2、4 mg/L；鐮刀菌對5-FC(MIC50、MIC90分別為12、16 mg/L)、制霉菌素(MIC50、MIC90分別為16、32 mg/L)、咪康唑(MIC50、MIC90分別為8、16 mg/L)、克霉唑(MIC50、MIC90分別為8、16 mg/L)不敏感。FSSC感染的真菌性角膜炎對伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的MIC50高出GFSC約2倍。

表1 新疆地區(qū)老年真菌性角膜炎分離鐮刀菌的基因型分布情況〔n(%)〕

表2 外傷史與FSSC和GFSC感染的真菌性角膜炎關(guān)系〔n(%)〕

3 討 論

傳統(tǒng)鐮刀菌屬的菌種鑒定中主要依據(jù)菌落形態(tài)、顏色，分生形態(tài)和方式等形態(tài)學(xué)特征，但該方法鑒定時間長，鐮刀菌生長過程中產(chǎn)生的孢子和菌落易出現(xiàn)變異使結(jié)果出現(xiàn)誤差〔4，5〕。分子生物學(xué)鑒定具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點，逐漸在臨床分離鐮刀菌的菌種鑒定中得到應(yīng)用。相關(guān)研究顯示，EF1-α、ITS等基因均能夠用于鐮刀菌的基因和菌種鑒定，但大部分鐮刀菌種的ITS存在非直系同源拷貝，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性〔6，7〕，因此本次研究采用EF1-α序列對鐮刀菌種進(jìn)行鑒定。鐮刀菌根據(jù)基因序列分為FSSC、GFSC、FOSC、FCSC等7個復(fù)合體，80種鐮刀菌，每個復(fù)合體包括多種基因型的鐮刀菌種。

本次研究結(jié)果顯示，GFSC在植物相關(guān)損傷老年患者中發(fā)生率明顯高于FSSC，可能原因與GFSC是農(nóng)作物中的主要病害有關(guān)。在無外傷老年患者中FSSC分離率明顯高于GFSC，本地區(qū)真菌性角膜炎老年患者超過80%生活在農(nóng)村，老年患者在日常生活中普遍存在塵土、未察覺的危險損傷等感染因素從而引發(fā)鐮刀菌感染，因此可初步推測FSSC的侵襲力強于GFSC。GFSC在眼部手術(shù)老年患者中的發(fā)生率也明顯高于FSSC，其原因與GFSC易于在接觸鏡保護(hù)液中生長有關(guān)，手術(shù)過程中使用的接觸鏡和手術(shù)器械中GFSC污染的可能性大于FSSC。

本次研究中對目前臨床常用的11種抗真菌藥物進(jìn)行了體外藥敏試驗，結(jié)果顯示鐮刀菌對那他霉素、兩性霉素B、伏立康唑敏感，而對5-FC、制霉菌素、咪康唑、克霉唑敏感性不佳。因此，對于新疆地區(qū)新診出的老年鐮刀菌性角膜炎患者應(yīng)先給予那他霉素、兩性霉素B、伏立康唑治療，等菌種鑒定和藥敏試驗結(jié)果得到后再根據(jù)實際情況調(diào)整治療方案。不同基因型鐮刀菌的藥物敏感性也存在差異，F(xiàn)SSC感染的真菌性角膜炎對伏立康唑、特比萘芬、那他霉素的敏感性明顯低于GFSC，但對治療預(yù)后的影響仍需進(jìn)一步大樣本量的長期隨訪研究。

1 Caroline Z，Marjorie N，Yang FC，etal.Fungal polymerase chain reaction testing in equine ulcerative keratitis〔J〕.Veter Ophthalmol，2013；16(5)：341-51.

2 史偉云，王 婷.我國真菌性角膜炎診斷和治療中的幾個問題〔J〕.中華眼科雜志，2013；49(1)：2-5.

3 Wang N，Zhao GQ，Gao A，etal.Association of TLR2 and TLR4 gene single nucleotide polymorphisms with fungal keratitis in Chinese Han population〔J〕.Curr Eye Res，2014；39(1)：47-52.

4 Pellegrino F，Carrasco MA.Argon laser phototherapy in the treatment of refractory fungal keratitis〔J〕.Cornea，2013；32(1)：95-7.

5 Tananuvat N，Salakthuantee K，Vanittanakom N，etal.Prospective comparison between conventional microbial work-up vs PCR in the diagnosis of fungal keratitis〔J〕.Eye，2012；26(10)：1337-43.

6 王 勇.更昔洛韋眼用凝膠和阿昔洛韋滴眼液治療單皰病毒性角膜炎療效觀察〔J〕.北華大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2014；15(5)：633-6.

7 陳金鵬，汪 榮，徐輝勇，等.兩種手術(shù)方式治療真菌性角膜炎的臨床觀察〔J〕.中國真菌學(xué)雜志，2014；9(1)：36-8，46.

〔2016-10-25修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

新疆兵團(tuán)英才計劃(2013ZX0940-02)；新疆兵團(tuán)科技攻關(guān)項目(2014AB030)

魏 華(1969-)，女，主管護(hù)師，主要從事老年眼科研究。

R772.21

A

1005-9202(2017)13-3148-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.011