白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸組織c-kit的影響及其作用機(jī)制

林仁敬，魯海燕*，何永恒，聶 晶

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸組織c-kit的影響及其作用機(jī)制

林仁敬1，魯海燕1*，何永恒1，聶 晶2

目的 研究白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型慢傳輸型便秘(STC)模型大鼠結(jié)腸組織c-kit的影響，探討其可能作用機(jī)制。方法 2015年9—11月，將70只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分成空白組20只、模型組50只，雌雄各半。模型組大鼠皮下注射鹽酸嗎啡注射液2.5 mg/kg，空白組注射等量0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)注射45 d。模型組大鼠皮下注射鹽酸嗎啡注射液15 d后，灌服(青皮、枳殼、附子，劑量13 g/kg)，連續(xù)30 d，建立氣陰兩虛型STC大鼠模型。模型建立成功后，將模型組剩下的40只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組，白術(shù)七物顆粒高、低劑量組和莫沙必利組，每組10只，雌雄各半。除空白組、模型對(duì)照組外，白術(shù)七物顆粒高、低劑量組和莫沙必利組給予相應(yīng)的藥物灌胃。應(yīng)用RT-PCR、免疫組化法檢測白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型STC模型大鼠結(jié)腸組織c-kit影響。結(jié)果 模型組樣本大鼠腸道推進(jìn)率低于空白組樣本(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒低劑量組、白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組大鼠小腸推進(jìn)率高于模型對(duì)照組(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組c-kit mRNA表達(dá)水平高于模型對(duì)照組(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒低劑量組c-kit mRNA表達(dá)水平低于白術(shù)七物顆粒高劑量組(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組c-kit表達(dá)水平高于模型對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論 白術(shù)七物顆粒劑治療氣陰兩虛型STC模型大鼠的作用機(jī)制是通過增加結(jié)腸組織中c-kit表達(dá)水平來實(shí)現(xiàn)的。

便秘；氣陰兩虛；大鼠；c-kit

林仁敬，魯海燕，何永恒，等.白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型慢傳輸型便秘模型大鼠結(jié)腸組織c-kit的影響及其作用機(jī)制[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(21)：2640-2643,2648.[www.chinagp.net]

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慢傳輸型便秘(STC)屬于功能性便秘，主要表現(xiàn)為排便次數(shù)減少，便意減弱甚至消失并伴有腹脹，約占慢性便秘的42.0%[1]。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不清楚，癥狀頑固，病程較長，近年來的研究熱點(diǎn)主要集中在探討STC的發(fā)病機(jī)制及有效治療方面。

白術(shù)七物顆粒劑為本院何永恒教授的專利方(專利號(hào)201210057943.9)，廣泛應(yīng)用于STC的臨床治療，療效顯著[2]。本研究旨在探討白術(shù)七物顆粒劑對(duì)氣陰兩虛型STC模型大鼠結(jié)腸組織c-kit水平的影響及其作用機(jī)制，為STC的中藥治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2015年9—11月，SD大鼠70只，SPF級(jí)，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.43004700017298。飼養(yǎng)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境3 d后，隨機(jī)分為兩組：空白組20只、模型組50只，雌雄各半。造模45 d后在兩組各隨機(jī)抽取10只作為觀察樣本，驗(yàn)證STC模型是否成功，再將模型組剩下的40只大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組,白術(shù)七物顆粒高、低劑量組，莫沙必利組，每組10只，雌雄各半。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑 鹽酸嗎啡注射液(東北制藥集團(tuán)沈陽第一制藥有限公司，1 ml∶10 mg，批號(hào)：20150105)，白術(shù)七物顆粒劑(藥物組成：檳榔、沉香、木香、烏藥、生白術(shù)、生地黃、升麻，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供,全方生藥量125 g)，中藥顆粒劑(藥物組成：青皮、枳殼、附子，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供，生藥量51 g)，枸櫞酸莫沙必利片(成都康弘藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號(hào)：150413)。Trizol試劑(BIOMIGA)；焦碳酸二乙酯(DEPC，Amresco)；SYBR Green qRCR Mix、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(GeneCopoeia)；c-kit一抗、二抗，DAB(北京博奧森生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)器材 與參考文獻(xiàn)[3]相同。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 造模方法：造模組50只大鼠皮下注射鹽酸嗎啡注射液2.5 mg·kg-1·d-1，空白組20只大鼠皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)注射45 d。造模組50只大鼠皮下注射鹽酸嗎啡注射液15 d后，灌服中藥顆粒劑溶液13 g/kg，1次/d，連續(xù)30 d，建立氣陰兩虛型[4]STC大鼠模型。造模組、空白組大鼠糞便每日稱重并記錄，采用Bristol糞便性狀評(píng)分(BSFS)[5]觀察各組大鼠糞便性狀，STC大鼠的糞便性狀改變標(biāo)準(zhǔn)：分離的硬團(tuán)狀或團(tuán)塊狀糞便；正常大鼠的糞便性狀：香腸狀或團(tuán)塊狀光滑軟便。造模成功后觀察10只樣本大鼠一般體征變化；計(jì)算大鼠腸道推進(jìn)率〔造模45 d后在空白組、模型組各隨機(jī)抽取10只作為觀察樣本，禁食不禁水24 h，10%活性炭懸液2 ml灌胃30 min后頸椎脫臼處死。剖腹取出直腸末端到幽門的全部腸道，擺正拉直，在無張力狀態(tài)下測量腸道全長和墨汁在腸道的推進(jìn)距離，計(jì)算墨汁推進(jìn)距離占腸道全長的百分比并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。腸道推進(jìn)率(%)=墨汁推進(jìn)距離(cm)/腸道全長(cm)×100%〕。氣陰兩虛型STC大鼠模型成功標(biāo)準(zhǔn)：造模組大鼠糞便質(zhì)量明顯減小，造模組大鼠腸道推進(jìn)率較正常組降低且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則認(rèn)為造模各組大鼠腸道傳輸功能降低，符合STC的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，造模成功。

1.5 給藥方法 造模成功后，停藥7 d，白術(shù)七物顆粒高、低劑量組、莫沙必利組給予相應(yīng)藥物灌胃，給藥體積10 ml/kg；模型對(duì)照組、空白組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃；1次/d，14 d為1個(gè)療程。根據(jù)大鼠體表面積換算，白術(shù)七物顆粒低、高劑量組分別予白術(shù)七物顆粒10.5 g生藥/kg、21.0 g生藥/kg；莫沙必利組給予莫沙必利2.5 mg/kg。

1.6 標(biāo)本采集 各組停止灌胃1周后，均禁食不禁水24 h，10%活性炭懸液2 ml灌胃30 min后頸椎脫臼處死。立即剖腹，取結(jié)腸組織4 cm，分成兩段，一段用于RT-PCR檢測c-kit mRNA表達(dá)水平；一段用于免疫組化法觀察c-kit 表達(dá)情況(用平均光密度表示)。

2 結(jié)果

2.1 空白組樣本、模型組樣本大鼠一般體征變化 與空白組樣本比較，模型組樣本大鼠倦怠少動(dòng)，糞便干結(jié)、水分減少，糞便干結(jié)。

2.2 空白組樣本、模型組樣本大鼠小腸推進(jìn)率比較 模型組樣本大鼠腸道推進(jìn)率低于空白組樣本，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 空白組樣本、模型組樣本大鼠小腸推進(jìn)率比較±s，%)

2.3 各組大鼠一般體征變化 與模型對(duì)照組比較，白術(shù)七物顆粒高、低劑量組和莫沙必利組大鼠倦怠少動(dòng)癥狀改善，糞便水分增多。

2.4 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對(duì)照組小腸推進(jìn)率低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白術(shù)七物顆粒低劑量組、白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組小腸推進(jìn)率高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白術(shù)七物顆粒低劑量組、白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組間小腸推進(jìn)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

表2 各組大鼠小腸推進(jìn)率比較±s,%)

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05

2.5 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對(duì)照組、白術(shù)七物顆粒低劑量組c-kit mRNA表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組c-kit mRNA表達(dá)水平高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒低劑量組c-kit mRNA表達(dá)水平低于白術(shù)七物顆粒高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒高劑量組與莫沙必利組c-kit mRNA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)。

2.6 免疫組化法 將結(jié)腸組織切片DAB染色后，選擇染色良好區(qū)域進(jìn)行圖像采集和分析。對(duì)每張切片選取 5 個(gè)互不重疊視野在顯微鏡下(×400)觀察，測定平均光密度，即在單位面積的陽性細(xì)胞表達(dá)，代表其表達(dá)情況。c-kit陽性細(xì)胞染色后胞質(zhì)中染色顆粒多呈淺棕色、棕黃色或棕褐色。模型對(duì)照組結(jié)腸組織中c-kit陽性細(xì)胞表達(dá)減少，分布稀疏，白術(shù)七物顆粒低劑量組、白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組結(jié)腸組織中c-kit陽性細(xì)胞表達(dá)呈不同程度的增加，分布密集(見圖1)。各組c-kit表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型對(duì)照組c-kit表達(dá)水平低于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；白術(shù)七物顆粒高劑量組、莫沙必利組c-kit表達(dá)水平高于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。白術(shù)七物顆粒低、高劑量組與莫沙比利組c-kit表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)。

Table3Expressionlevelsofc-kitmRNAincolontissuesofratsinthefivegroups

組別只數(shù)c-kitmRNA空白組100.84±0.12模型對(duì)照組100.72±0.22a白術(shù)七物顆粒低劑量組100.73±0.18ac白術(shù)七物顆粒高劑量組100.81±0.18b莫沙必利組100.82±0.13bF值3.201P值0.015

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型對(duì)照組比較，bP<0.05；與白術(shù)七物顆粒高劑量組比較，cP<0.05

表4 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit表達(dá)水平

注：為與空白組比較，aP<0.05；為與模型對(duì)照組比較，bP<0.05

3 討論

STC是一類以結(jié)腸傳輸減慢為特點(diǎn)的頑固性便秘，其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，治療方法多種多樣，但療效不顯著，且藥物治療時(shí)間過長患者對(duì)藥物會(huì)產(chǎn)生依賴性。手術(shù)治療不能解決其腸道的神經(jīng)性病變和動(dòng)力障礙，只是切除傳輸遲緩的病變結(jié)腸，未從根本上糾正STC的發(fā)病病因，且結(jié)腸切除術(shù)是有創(chuàng)性的不可逆性的手術(shù)治療方法，選擇時(shí)應(yīng)非常慎重。近年來，隨著新型藥物及非藥物治療方法的應(yīng)用，STC的治療得到迅速發(fā)展，如現(xiàn)代的生物反饋治療[6]、心理治療、針灸治療[7]、手術(shù)治療[8]及中藥復(fù)方治療。

注：A為空白組 ， B為模型對(duì)照組，C為白術(shù)七物顆粒低劑量組，D為白術(shù)七物顆粒高劑量組，E為莫沙必利組

圖1 免疫組化分析圖(DAB染色，×400)

Figure 1 Expression levels of c-kit in the colon tissue samples stained by immunohistochemistry with DAB

在對(duì)中藥復(fù)方制劑作用機(jī)制研究時(shí)，要選擇療效明確、有效成分的結(jié)構(gòu)和活性基本清楚的中藥復(fù)方。白術(shù)七物顆粒完全符合這一要求。白術(shù)七物顆粒是經(jīng)多年的臨床研究，針對(duì)氣陰兩虛型老年便秘、并以中醫(yī)理論為指導(dǎo)研制的一種中藥復(fù)方制劑，并取得了良好的臨床療效[9]。該復(fù)方制劑提取檳榔、沉香、木香、烏藥、生白術(shù)、生地黃、升麻的有效成分，諸藥配伍,共奏“益氣養(yǎng)陰、行氣運(yùn)下”之功，使腑氣得暢，脾滯得運(yùn)，便秘自除。利用藥物化學(xué)分析手段組合成白術(shù)七物顆粒，以此來探尋中藥復(fù)方制劑治療STC的機(jī)制研究，成為臨床亟需解決的一大課題。研究表明，白術(shù)七物顆?？赏ㄟ^影響STC大鼠結(jié)腸組織神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)[10]、P物質(zhì)(SP)和血管活性腸肽(VIP)[11]治療STC。另外Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的異常也可以導(dǎo)致STC的發(fā)生。

ICC[12]與胃腸運(yùn)動(dòng)關(guān)系密切，主要位于神經(jīng)細(xì)胞和胃腸道平滑肌細(xì)胞之間，可以產(chǎn)生慢波、傳導(dǎo)電興奮、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)。胃腸道原癌基因c-kit是ICC的特異性標(biāo)志物，與配體干細(xì)胞因子(SCF)結(jié)合后，引發(fā)細(xì)胞間信號(hào)的瀑布級(jí)鏈反應(yīng)，繼而調(diào)控包含磷酸肌醇-3激酶(PI-3K)等下游底物的多條信號(hào)通路，最終活化胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，從而控制細(xì)胞增殖、分化和生長和調(diào)節(jié)基因表達(dá)。而本研究結(jié)果表明，白術(shù)七物顆粒高劑量組大鼠結(jié)腸組織中c-kit陽性表達(dá)細(xì)胞增加，分布相對(duì)較密集，c-kit表達(dá)水平升高。

綜上所述，白術(shù)七物顆粒劑通過增加氣陰兩虛型STC模型大鼠結(jié)腸組織的c-kit表達(dá)水平，加快電興奮傳遞，增強(qiáng)結(jié)腸運(yùn)動(dòng)，達(dá)到治療STC的作用。本文不足為未進(jìn)行白術(shù)七物顆粒劑毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究，下一步將進(jìn)行該方面研究；未應(yīng)用更先進(jìn)檢測方法檢測指標(biāo)，進(jìn)一步揭示白術(shù)七物顆粒劑治療STC的作用機(jī)制。

作者貢獻(xiàn)：林仁敬進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；魯海燕、聶晶進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；何永恒進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔莎)

Effect and Mechanism of Atractylodes Qiwu Granules on C-kit Expression Level in Colon Tissues of STC Rats with Qi-yin Deficiency

LINRen-jing1，LUHai-yan1*，HEYong-heng1，NIEJing2

1.AnorectalDepartment,theSecondAffiliatedHospitalofHunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410005,China2.HunanSJALaboratoryAnimalCo.,Ltd，Changsha410100,China

*Correspondingauthor:LUHai-yan,Attendingphysician；E-mail:850157636@qq.com

Objective To investigate the changes of c-kit expression level in colon tissues of STC model rats with qi-yin deficiency under the intervention of Atractylodes qiwu granules,and to explore the possible mechanism of action of Atractylodes qiwu granules in treating the disease.Methods This study was conducted from September to November 2015.A total of 70 SPF grade SD rats were randomized into the blank group(10 males and 10 females) and the model group(25 males and 25 females).Rats in the model group and blank group were subcutaneously injected 2.5 ml/kg of morphine hydrochloride injection,2.5 ml/kg of 0.9% sodium chloride injection,once daily for 45 consecutive days,respectively.The rats in the model group were gavaged with 13 g/kg of the solution with dissolved granules of pericarpium citri reticulatae viride,fructus aurantii and radix aconite carmichaeli on the 16th day of prescribing morphine hydrochloride injection,for 30 consecutive days to establish the STC rat models with qi-yin deficiency.The STC rat models with qi-yin deficiency were verified to be established successfully after the above 45d-intervention by examining the sacrificed 10 of the rats from the model group.The rest 40 rats in the model group were randomized into the model control group,high-dose Atractylodes qiwu granules group,low-dose Atractylodes qiwu granules group,and mosapride group,with 10 evenly composed of males and females in each group.After stopping the previous intervention for 7 days,the model control group,high-dose and low-dose Atractylodes qiwu granules groups,mosapride group and blank group were gavaged with solution of 0.9% sodium chloride injection,high-dose Atractylodes qiwu granules,low-dose Atractylodes qiwu granules,mosapride,0.9% sodium chloride,respectively.RT-PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression levels of c-kit in the colon tissue samples taken from the rats of all the groups.Results The intestinal propulsion rate of model group was lower than that of blank group(P<0.05).The model control group had lower intestinal propulsion rate than low-dose and high-dose Atractylodes qiwu granules groups and mosapride group(P<0.05).The expression levels of c-kit mRNA in the model control group were lower than those in low-dose and high-dose Atractylodes qiwu granules groups and mosapride group(P<0.05).The expression levels of c-kit mRNA in low-dose Atractylodes qiwu granules group were lower than those in high-dose Atractylodes qiwu granules group(P<0.05).The model control group had lower expression levels of c-kit than high-dose Atractylodes qiwu granules group and mosapride group(P<0.05).Conclusion Atractylodes qiwu granules acts by increasing the c-kit level in colon tissues to treat STC with qi-yin deficiency.

Constipation;Qi-yin deficiency;Rats;C-kit

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302977)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(13JJ3101)

R 442.2

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.016

2017-02-11；

2017-05-02)

1.410005湖南省長沙市，湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科

2.410100湖南省長沙市，湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司

*通信作者：魯海燕，主治醫(yī)師；E-mail:850157636@qq.com