翼核果素對肝癌HepG2細胞凋亡及細胞骨架蛋白F-actin的影響?

劉 瑛,陸國壽,盧文杰,王 麗,黃周鋒,胡筱希

(廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧 530022)

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【實驗研究】

翼核果素對肝癌HepG2細胞凋亡及細胞骨架蛋白F-actin的影響?

劉 瑛,陸國壽△,盧文杰,王 麗,黃周鋒,胡筱希

(廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，南寧 530022)

目的:研究翼核果素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響，并探討其可能的機制。方法:以不同濃度的翼核果素作用于體外培養(yǎng)的HepG2細胞，采用MTT法檢測細胞生長抑制率，HE、吖啶橙染色觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率和周期，激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架蛋白F-actin形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:翼核果素可明顯抑制人肝癌HepG2細胞的增殖且呈劑量依賴性，作用于HepG2細胞24 h的IC50值為124.77 μmol·L-1。顯微鏡可見細胞核變形、染色體聚集等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，60、90 μmol·L-1翼核果素給藥組細胞凋亡的百分率顯著高于對照組，G2/M期細胞比例顯著高于對照組，細胞骨架蛋白F-actin呈現(xiàn)解聚斷裂狀態(tài)。結(jié)論:翼核果素可抑制HepG2細胞的增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，其機制可能與細胞周期阻滯、細胞骨架蛋白F-actin解聚有關(guān)。

翼核果素；HepG2細胞；增殖抑制；凋亡；細胞骨架蛋白

廣西是肝癌高發(fā)區(qū)，作為常見病和多發(fā)病，肝癌的死亡率占廣西惡性腫瘤死亡率的40.04%，嚴(yán)重危害人們的生命健康。目前治療肝癌的化療藥物大多為細胞毒性藥物，易產(chǎn)生耐藥性，效果不佳。天然植物來源的抗腫瘤藥物因其作用機制獨特，抗癌療效顯著，目前已逐步在臨床上占據(jù)主導(dǎo)地位[1]。

翼核果素(Ventilagolin)提取自廣西傳統(tǒng)瑤藥材紫九牛[2]，是本研究團隊首次發(fā)現(xiàn)，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定屬于1,4-萘醌類化合物。研究報道，萘醌類化合物具有良好的抗腫瘤作用[3-5]，但目前針對翼核果素抗腫瘤活性的研究仍是空白。為研究翼核果素對肝癌發(fā)生發(fā)展的影響，本研究建立了人肝癌HepG2細胞體外模型，通過測定翼核果素對HepG2細胞增殖、凋亡相關(guān)生物學(xué)指標(biāo)的變化，探討其抗腫瘤作用及機制，為其深入開發(fā)利用提供一定的實驗支撐和理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞株

人肝癌細胞株HepG2購于湘雅醫(yī)學(xué)院細胞庫。

1.1.1 藥物及試劑 翼核果素由廣西中醫(yī)藥研究院化學(xué)所提供，紫紅色針狀結(jié)晶，二甲基亞砜(DMSO)溶解成10 μmol·mL-1儲備液，過濾除菌備用；DMEM高糖培養(yǎng)基，博士德公司；胎牛血清、DMSO，Giobco公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)，biotopped公司；HE染色試劑盒、吖啶橙染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；Annexin V FITC-PI細胞凋亡檢測試劑盒，life公司；細胞周期檢測試劑盒，聯(lián)科公司；4%多聚甲醛、Triton X-100，成都科龍化工試劑廠；ActinGreen 488 Reddyprobes reagent染液、DAPI染液，life公司；抗熒光淬滅封片劑，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.1.2 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo；全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo；EVOS FL Auto熒光顯微鏡，美國Life；流式細胞儀，美國BD；高速常溫離心機，德國Eppendorf；激光共聚焦掃描顯微鏡，日本Nikon A1。

2 方法

2.1 HepG2細胞的培養(yǎng)

細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基在培養(yǎng)瓶內(nèi)常規(guī)單層傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率

細胞消化計數(shù)， 105個/孔接種于96孔板，貼壁生長24 h。加入不同濃度的翼核果素，200、150、100、50 μmol·L-1，每個濃度平行4孔；空白對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)基，溶劑對照組加入相應(yīng)濃度的DMSO，作用24 h。每孔加入20 μL MTT(5 g·L-1)溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h棄上清，每孔加入100 μL DMSO溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀490 nm檢測吸光度OD值，按公式計算細胞生長抑制率(IR)、細胞存活率和半數(shù)抑制濃度(IC50)。細胞存活率=實驗組OD值/對照組OD值 ×100%。增殖抑制率=1-(實驗組OD值/對照組OD值) ×100%。

2.3 HE、吖啶橙染色觀察細胞形態(tài)

消化細胞5×105個/孔爬片，貼壁24 h后加入不同濃度的翼核果素作用24 h。HE染色棄上清，95%乙醇固定20 min，PBS清洗2次。取出蓋玻片，蘇木素染色5 min，伊紅染色2 min，甘油封片，顯微鏡下觀察。吖啶橙染色棄上清，95%乙醇固定20 min，取出蓋玻片，1%醋酸作用30 s，0.02%吖啶橙染色1 min，CaCl2作用2 min PBS漂洗，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

2.4 FCM檢測細胞凋亡率

不同濃度翼核果素作用24 h后收集上清液和細胞，1000 rpm·min-1離心5 min去上清，PBS洗滌，將細胞重懸于100 μl loading buffer至106個/mL。每管加入5 μL Annexin V-FITC和1 μL PI混勻，避光孵育15 min，加入400 μL loading buffer混勻，過篩網(wǎng)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。同時設(shè)置凋亡誘導(dǎo)刺激的熒光補償組：只加5 μL AnnexinV-FITC；只加1 μL PI；不加任何染料，只加500 μL的loading buffer。

2.5 FCM檢測細胞周期

不同濃度翼核果素作用24 h后收集細胞，1300 rpm·min-1離心5 min棄上清，加入1mLPBS重懸洗滌細胞，1 300 rpm·min-1離心5 min棄上清，重復(fù)洗滌1次棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇4℃固定過夜。1300 rpm·min-1離心15 min棄去固定液，加入1 mLPBS洗滌1次，1300 rpm·min-1離心20 min棄上清，留100 μLPBS重懸細胞，加入10 μL RNasA酶(10 mg·ml-1)，37℃水浴30 min，加入300 μL PI染色，4℃染核30 min過篩網(wǎng)，流式細胞儀檢測細胞周期。

2.6 免疫熒光法檢測細胞骨架蛋白

取對數(shù)生長期的細胞106個接種于共聚焦專用培養(yǎng)皿中，貼壁24 h。加入不同濃度的翼核果素作用24 h。4%多聚甲醛固定20 min PBS清洗，0.2% Triton X-100透化15 min PBS清洗，封閉30 min PBS清洗，ActinGreen 488 Reddyprobes reagent 20-25℃孵育30 min PBS清洗，DAPI避光孵育5 min PBS清洗，抗熒光淬滅封片劑封片。激光共聚焦掃描顯微鏡采用完美對焦系統(tǒng)動態(tài)雙向掃描模式，選擇激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，激光功率9.0 mW，光電倍增管電壓110 V條件下攝圖。

3 結(jié)果

3.1 翼核果素對HepG2細胞的增殖抑制作用

圖1顯示，翼核果素在50～200 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)對HepG2細胞的增殖有抑制作用，抑制作用隨藥物濃度的增加逐漸增強，呈劑量依賴性。翼核果素作用于HepG2細胞24 h的IC50值為124.77 μmol·L-1。

圖1 不同濃度翼核果素對HepG2細胞的抑制作用，±s

3.2 翼核果素對HepG2細胞形態(tài)學(xué)的影響

圖2顯示，細胞經(jīng)HE染色，空白對照組HepG2細胞呈梭形，胞體大，胞漿豐富，多見核分裂像。經(jīng)翼核果素作用后HepG2細胞數(shù)明顯減少，細胞皺縮變細長，胞漿減少，可見明顯空泡化，細胞核固縮濃染，可見凋亡小體。

圖3顯示，細胞經(jīng)吖啶橙熒光染色，空白對照組HepG2細胞膜完整光滑，細胞核形態(tài)飽滿呈均勻綠色，染色較淺。經(jīng)翼核果素作用后HepG2細胞數(shù)量減少，胞膜皺縮，細胞核體積相對變小，染色質(zhì)濃集，熒光明顯增強，可見凋亡小體。

圖2 翼核果素對HepG2細胞形態(tài)的影響(HE×100)

圖3 翼核果素對HepG2細胞形態(tài)的影響(吖啶橙×100)

3.3 翼核果素對HepG2細胞凋亡和周期影響

表1顯示，流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，隨翼核果素濃度的增加，細胞凋亡率增大，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示翼核果素能誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡且呈劑量依賴性。翼核果素作用HepG2細胞后，細胞周期各時相分布有差異，主要表現(xiàn)為G2/M期細胞比例增多，G0/ G1期細胞比例減少，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，提示翼核果素能將HepG2細胞阻滯于細胞分裂的G2/M期，從而抑制細胞的分裂增殖。

表1 翼核果素對HepG2細胞凋亡和周期的影響

注：與空白對照組比較：**P<0.01

圖4 翼核果素對HepG2細胞骨架蛋白F-actin的影響

3.4 翼核果素對HepG2細胞骨架蛋白F-actin的影響

圖4顯示，Actingreen 488能與細胞內(nèi)的纖維肌動蛋白F-actin特異性結(jié)合，與異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) 偶聯(lián)呈綠色熒光，主要分布在細胞膜和細胞質(zhì)內(nèi)。激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察，空白組HepG2細胞伸展良好，形狀不規(guī)則，可見大量毛刺偽足，細胞質(zhì)內(nèi)F-actin纖維蛋白呈長條細絲狀，結(jié)構(gòu)完整，排列規(guī)則，綠色熒光較強。翼核果素作用細胞后，細胞體積縮小，毛刺偽足減少，胞質(zhì)中F-actin纖維蛋白數(shù)量明顯減少，絲狀結(jié)構(gòu)斷裂，排列紊亂，胞漿可見明顯空泡化改變，破損的F-actin纖維斷裂端呈堆積狀，綠色熒光強弱不均。

4 討論

惡性腫瘤發(fā)生和無限發(fā)展的關(guān)鍵因素是諸多原因誘發(fā)的細胞增殖失控和凋亡受阻[6]，針對這一機制，惡性腫瘤的全新治療手段是有效地抑制腫瘤細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡，這也是目前腫瘤治療的熱點和靶點之一[7]。

本研究以人肝癌HepG2細胞為體外模型，觀察中藥單體翼核果素對腫瘤細胞的影響。結(jié)果顯示，翼核果素可顯著抑制肝癌HepG2細胞的增殖并呈劑量依賴性；HE染色、吖啶橙染色后熒光顯微鏡觀察到翼核果素給藥組細胞出現(xiàn)典型的凋亡改變；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，翼核果素作用細胞后凋亡率顯著高于對照組，HepG2細胞被特異性的阻滯在G2/M期且呈劑量依賴性，證實翼核果素可通過阻滯細胞周期而誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡，說明其抑制腫瘤細胞增殖作用可能與誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。

細胞骨架是由蛋白纖維構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，包括微管、微絲和中間纖維構(gòu)成的細胞形態(tài)和運動協(xié)調(diào)系統(tǒng)，在細胞生命周期中發(fā)揮著重要作用[8-9]，同時與細胞的凋亡、分化等生理功能改變有著密切聯(lián)系[10-11]。微絲是細胞骨架結(jié)構(gòu)中最細的，主要由肌動蛋白(actin)組成，以游離球狀actin(G-actin)和聚合纖維狀actin(F-actin)2種形式存在。研究表明，actin是細胞早期凋亡的調(diào)控物之一，通過改變actin的穩(wěn)定狀態(tài)，觸發(fā)F-actin的解聚，可以導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生[12-13]。

本實驗中翼核果素作用HepG2細胞后，細胞內(nèi)細絲狀的F-actin發(fā)生解聚，斷裂的F-actin不規(guī)則地彌漫堆積在細胞內(nèi)，原有的游離-聚合之間的動態(tài)平衡被打破，最終細胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。細胞結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)改變是細胞凋亡的基礎(chǔ)，可以認為翼核果素誘導(dǎo)的F-actin解聚是其抑制HepG2細胞增殖和促凋亡的機制之一。

目前，國內(nèi)外尚無翼核果素藥理活性的相關(guān)報道。本研究首次發(fā)現(xiàn)，其對HepG2細胞有顯著的抑制增殖和促進凋亡的作用，通過對細胞微絲結(jié)構(gòu)的微觀形態(tài)學(xué)觀察，初步了解了翼核果素抗腫瘤作用的內(nèi)在機理。作為一種新穎的有良好活性的抗肝癌中草藥提取化合物，其具有很好的應(yīng)用開發(fā)價值，但其抗腫瘤作用機制還有待進一步的深入研究。

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Effects of Ventilagolin On the Apoptosis of Human Hepatoma HepG2 Cells and Cytoskeletal Protein F-actin

LIU Ying，LU Guo-shou△，LU Wen-jie，WANG Li，HUANG Zhou-feng，HU Xiao-xi

(GuangxiKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicaineQualityStardandsGuangxiInstituteofTraditionalMedicalandPharmaceuticalSciences,Nanning530022,China)

Objective: To study the inhibition effects of ventilagolin and proliferation and apoptosis on human hepatocellular carcinoma cells HepG2, discusses the possible mechanisms. Methods: HepG2 cells in culture medium were treated with different concentrations of ventilagolin. The inhibitory rate of the cells was measured by MTT assay. The morphology of cells was observed by HE and Acridine orange stain. Cell cycle changes and apoptotic rate were detected by Flow Cytometry(FCM). The mophological changes of cytoskeletal protein F-actin were observed by laser confocal microscopy. Results: The growth of HepG2 cells was significantly inhibited by ventilagolin, and the growth inhibitory rate increased with increasing concentration. IC50of ventilagolin was 124.77μmol·L-1after 24 hours. A characteristic apoptosis change including nuclear disintergration and chromatin agglomerate was displayed. The apoptosis rate of HepG2 cell treated with 60, 90 μmol·L-1ventilagolin was significantly higher than that of the control group, and the percentage of G2/M phase of HepG2 cell was also significantly higher than that of the control group. F-actin cytoskeletal protein was showed from polymerization to depolymerization after ventilagolin treatment. Conclusion: Ventilagolin can obviously inhibit the proliferation and induce apoptosis of HepG2 cells. The mechanisms may be due to blocking cell cycle and depolymerizating cytoskeletal protein F-actin.

Ventilagolin; HepG2 cell; Antiproliferation; Apoptosis; Cytoskeletal protein

廣西自然科學(xué)基金系項目(2016GXNSFAA380092)-瑤藥紫九牛中翼核果素衍生物的合成及抗腫瘤活性研究；廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室研究課題(桂中重自201601)-瑤藥紫九牛中翼核果醌-I的初步結(jié)構(gòu)修飾與活性研究；廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室青年骨干創(chuàng)新基金(桂中重自201506)-瑤藥翼核果化學(xué)成分及活性的系統(tǒng)性研究

劉 瑛(1982-)，女，湖北漢川人，助理研究員，醫(yī)學(xué)碩士，從事天然藥物分子藥理學(xué)的臨床與研究。

△通訊作者：陸國壽，男，副主任藥師，從事中藥化學(xué)的臨床與研究，Tel：0771-5868986, E-mail:luguoshou@foxmai.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)06-0791-04

2016-12-11