活血涼血法對氧糖剝奪大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響*

石冬燕 朱 元 常 誠

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

·研究報(bào)告·

活血涼血法對氧糖剝奪大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響*

石冬燕 朱 元 常 誠△

（南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

目的 觀察活血涼血法作用于腦缺血缺氧大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）后的條件培養(yǎng)基對星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT）的影響。方法 采用氧糖剝奪法獲得正常、激活、激活合通絡(luò)救腦注射液處理、損傷、損傷合通絡(luò)救腦注射液處理5個不同狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基。同法建立AS損傷模型并分成7組，加入相應(yīng)BMEC條件培養(yǎng)基：正常對照組（N）、模型組（I）、條件培養(yǎng)基處理的正常組（NCM）、條件培養(yǎng)基處理的激活組（ACM）、條件培養(yǎng)基處理的激活給藥組（ACM-T）、條件培養(yǎng)基處理的損傷組（ICM）、條件培養(yǎng)基處理的損傷給藥組（ICM-T）。觀察AS活性，并檢測BDNF、GDNF的表達(dá)量。結(jié)果 正常、激活和損傷狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基均可提高受損AS活性，并顯著升高其分泌BDNF、GDNF的量，其促進(jìn)程度分別為激活組＞正常組＞損傷組。涼血活血之通絡(luò)救腦注射液作用于激活BMEC后，其條件培養(yǎng)基具有促進(jìn)AS分泌BDNF、GDNF的功能。結(jié)論 活血涼血的通絡(luò)救腦注射液可通過提高受損星型膠質(zhì)細(xì)胞活性并促進(jìn)其分泌NT來減輕腦缺血缺氧時神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞功能的恢復(fù)，其可能是治療腦缺血缺氧的潛在藥物。

活血涼血法 腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)生長因子 通絡(luò)救腦注射液

神經(jīng)營養(yǎng)因子（NT）是一種主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞（AS）產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽分子，它有助于神經(jīng)元的生長和存活，可以促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞體合成相關(guān)的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮支持神經(jīng)元生長、發(fā)育和功能完整性的作用。研究表明，腦組織缺血缺氧時，AS可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子［主要為腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）］以減少神經(jīng)元的損傷，其機(jī)制主要是BDNF、GDNF可減少鈣超載、抗自由基、抑制谷氨酸毒性、減少細(xì)胞毒等從而保護(hù)受損的神經(jīng)元，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)［1-2］。

神經(jīng)血管單元 （NVU）指腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）、周圍的星型膠質(zhì)細(xì)胞突起和由這些突起所支持的神經(jīng)元及其軸突一起構(gòu)成的復(fù)合體。腦缺血缺氧可引起中醫(yī)學(xué)中風(fēng)、癡呆、眩暈等多種疾?。愃朴谖麽t(yī)的腦梗死、血管性癡呆、后循環(huán)缺血等），這些疾病遷延不愈均可導(dǎo)致體內(nèi)瘀血積聚，日久化火，使得疾病的治療更為棘手。那么能否利用NVU之間的關(guān)系減輕腦缺血缺氧所致的后果及利用藥物加強(qiáng)NVU之間的相互作用，促進(jìn)腦保護(hù)，延緩腦缺血缺氧所致疾病的病程，是研究的一個方向。

通絡(luò)救腦注射液是天津紅日藥業(yè)有限公司新研發(fā)的產(chǎn)品，其主要成分為三七總皂苷及梔子苷，旨在通過活血涼血法作用于缺血缺氧的腦組織，以尋求治療腦缺血缺氧的一種新途徑。在此前提下，本研究利用氧糖剝奪法構(gòu)建腦缺血缺氧的體外模型，將活血涼血之通絡(luò)救腦注射液作用于BMEC后制成不同狀態(tài)的培養(yǎng)基，用此培養(yǎng)受損的AS，觀察AS活性及GDNF、BDNF表達(dá)變化，以期探索BMEC在病理狀態(tài)時對AS腦的保護(hù)作用及通絡(luò)救腦注射液可能的作用途徑，從而尋找治療中風(fēng)、癡呆、眩暈等疾病的有效方藥，減輕社會、患者家庭經(jīng)濟(jì)及精神負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SD大鼠，體質(zhì)量60～70 g，雄性；出生48 h內(nèi)的Wistar大鼠，雄性，兩者均購自維通利華動物中心。

1.2 藥物與試劑 DMEM培養(yǎng)基干粉：Gibco公司（美國）。胎牛血清：金馬生物技術(shù)公司。胰蛋白、EDTA、明膠、原酶Ⅱ型：Sigma公司（美國）。通絡(luò)救腦注射液：紅日藥業(yè)有限公司。兔抗大鼠GFAP及鼠ICAM-1單克隆抗體：abcam公司（美國）。山羊抗兔二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記）：北京康為世紀(jì)生物技術(shù)公司。分離膠緩沖液、聚丙烯酰胺溶液、濃縮膠緩沖液、酸性定影粉、上樣緩沖液：普利萊技術(shù)公司。RIPA裂解液：碧云天生物公司。

1.3 BMEC分離及培養(yǎng) 利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的方法［3］。取SD大鼠，收集大腦皮質(zhì)，剪碎、勻漿、過濾，取74 μm濾網(wǎng)上的微血管段，采用0.2%Ⅱ型膠原酶37℃水浴中消化20 min左右，離心（1000 r/min，5 min）所得到的沉淀用沖洗液清洗2次，用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基懸浮后，接種在有明膠覆蓋的25 cm2培養(yǎng)瓶中，放在37℃、5%CO2孵箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，48～72 h后首次更換培養(yǎng)基1次，后每3日進(jìn)行1次更換培養(yǎng)基。細(xì)胞生長至80%～90%時用含0.04%EDTA的0.1%胰蛋白酶消化后繼續(xù)培養(yǎng)。本研究使用第3代細(xì)胞。

1.4 AS分離、純化、培養(yǎng)及鑒定 取Wistar大鼠，收集大腦皮質(zhì)。剪碎，用0.125%胰蛋白酶37℃消化25 min收集在離心管中，2000 r/min離心5 min，去上清，細(xì)口徑吸管吹打至均勻的細(xì)胞懸液后用200目不濾網(wǎng)過濾成為單細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5× 108/L，接種在75 cm2培養(yǎng)瓶中，靜置30 min后吸出重新接種在預(yù)先用0.001%多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)瓶里，放在飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)。1 d后更換全部培養(yǎng)基，以后每2日更換一半培養(yǎng)基。第8日細(xì)胞生長成為單層片狀時，更換全部培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱里孵育2 h，然后放在37℃恒溫?fù)u床上，240 r/min振蕩18 h。去掉所有培養(yǎng)基，采用預(yù)溫解剖液清洗3次，從而去掉小膠質(zhì)細(xì)胞及寡突膠質(zhì)細(xì)胞。繼續(xù)消化傳代，37℃、5%CO2孵育，GFAP染色鑒定后分組及實(shí)驗(yàn)，本研究使用第3代細(xì)胞。

1.5 建立腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞激活及損傷模型 采用氧糖剝奪法［4］，將第3代BMEC分為8組，以D-Hank’s液清洗2次后換成無糖Kreb’s液，分別置37℃、95% N2、5%CO2的缺氧培養(yǎng)箱里培養(yǎng)0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h。1）MTT法檢測每組BMEC的活性，根據(jù)結(jié)果得出造成BMEC激活及損傷的時間分別為0.5 h、2 h。2）Western Blot法分析正常、激活、損傷3個時間點(diǎn)BMEC細(xì)胞間黏附分子 （ICAM-1）的不同表達(dá)，驗(yàn)證BMEC激活及損傷模型。

1.6 制備及收集不同狀態(tài)BMEC條件培養(yǎng)基 將第3代BMEC分為5組：1）正常組：正常培養(yǎng)的BMEC，未進(jìn)行任何處理；2）激活組：根據(jù)前述氧糖剝奪法制成BMEC激活模型；3）激活給藥組：制成激活模型，同時在造模前4 h及造模過程中，以2 μL/mL質(zhì)量濃度加進(jìn)通絡(luò)救腦注射液（已有實(shí)驗(yàn)證明2 μL/mL是最適合質(zhì)量濃度［5］）；4）損傷組：同法制成BMEC損傷模型；5）損傷給藥組：制成損傷模型，同時在造模前4 h及造模過程中，以2 μL/mL濃度加進(jìn)通絡(luò)救腦注射液。每組處理結(jié)束后，換成無血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)6 h，收集各組培養(yǎng)上清，分別作為正常BMEC條件培養(yǎng)基（NCM）、BMEC激活條件培養(yǎng)基 （ACM）、BMEC激活合通絡(luò)救腦注射液給藥條件培養(yǎng)基（ACM-T）、BMEC損傷條件培養(yǎng)基（ICM）、MEC損傷合通絡(luò)救腦注射液給藥B條件培養(yǎng)基（ICM-T）。

1.7 建立大鼠AS模型并用相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理 用前述方法建立AS損傷模型，確定AS激活、損傷造模時間分別為2 h、8 h。將損傷的AS分為7組，并用相應(yīng)條件培養(yǎng)基處理，即正常對照組（N）、模型組（I）、條件培養(yǎng)基處理的正常組（NCM）、條件培養(yǎng)基處理的激活組（ACM）、條件培養(yǎng)基處理的激活給藥組（ACM-T）、條件培養(yǎng)基處理的損傷組（ICM）、條件培養(yǎng)基處理的損傷給藥組（ICM-T），靜置培養(yǎng)過夜（約12 h）。

1.8 指標(biāo)檢測Westen blot法檢測 各組AS BDNF、GDNF表達(dá)量。裂解AS細(xì)胞，提取總蛋白，ABC法定量蛋白后，各樣品取50 μg總蛋白，制備10%的分離膠，充分分離目的蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜。將膜放在含有5%脫脂奶粉的自封袋里，室溫?fù)u床1 h，TBST洗膜，5 min×3次。將膜置于含一抗自封袋中4℃孵育過夜（BDNF：1∶5000。GDNF：1∶100），TBST洗膜，5 min×3次。將膜放在含有1∶3000辣根過氧化酶標(biāo)記的的山羊抗兔的二抗 （用5%BSA配成）自封袋里室溫下培養(yǎng)2～3 h，TBST洗膜，5 min×3次。將ECL plus的A、B發(fā)光液1∶1混合均勻后加在膜上，吸干膜上多余的發(fā)光液，用曝光機(jī)（Tanon 4500）曝光及掃描條帶。用Band Scan軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白的灰度值，得到目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以（±s）表示，通過單因素方差分析組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS活性的影響見表1。與正常組比較，8 h后模型組AS活性顯著降低（P＜0.001），提示AS擬缺血損傷模型制作成功。與I組比較，NCM組、ACM組及ICM組OD值顯著升高（P＜0.001），提示正常、激活及損傷的BMEC條件培養(yǎng)基均可以顯著提高受損AS的活性。與ACM組相比，ACM-T組OD值升高更加顯著（P＜0.05），與ICM組相比，ICM-T組OD值也明顯升高（P＜0.05），提示活血涼血之通絡(luò)救腦注射液作用于激活及損傷BMEC后，其條件培養(yǎng)基可明顯增強(qiáng)AS活性。

表1 不同狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS活性的影響（±s）

表1 不同狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS活性的影響（±s）

與N組比較，***P＜0.001；與I組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001；與ACM組比較，△P＜0.05；與ICM組比較，★P＜0.05。下同。

組別 n OD值N組 61.72±0.11 I組 6 NCM組 6 0.39±0.06***1.71±0.03###ACM組 6 ACM-T組 6 1.72±0.08△ICM組 6 1.39±0.22###ICM-T組 6 1.60±0.10★1.49±0.03###

2.2 不同狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基對損傷AS分泌BDNF的影響 如表2及圖1，與正常組相比，模型組BDNF顯著降低（P＜0.001），提示腦缺血缺氧造模成功后損傷的AS分泌BDNF明顯降低。與模型組相比，NCM組及ACM組分泌BDNF明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），提示正常、激活狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基都可顯著促進(jìn)AS分泌BDNF；與ACM組相比，ACM-T組BDNF表達(dá)量明顯升高 （P＜0.01），與ICM組相比，ICM-T組BDNF表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示通絡(luò)救腦注射液作用于激活BMEC后，其條件培養(yǎng)基可促進(jìn)AS分泌BDNF，增強(qiáng)AS保護(hù)神經(jīng)元的功能。

表2 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS表達(dá)BDNF的影響（±s）

表2 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS表達(dá)BDNF的影響（±s）

組別 n OD值N組 61.00±0.00 I組 6 NCM組 6 0.43±0.03***0.96±0.05##ACM組 6 ACM-T組 6 1.37±0.08△△ICM組 6 0.43±0.12 ICM-T組 6 0.58±0.20 0.78±0.06#

圖1 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS表達(dá)BDNF的影響

2.3 不同狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS分泌GDNF的影響 如表3，圖2，與正常組相比，模型組GDNF顯著降低（P＜0.001），提示腦缺血缺氧造模成功后損傷的AS分泌GDNF明顯降低。與模型組相比，NCM組及ACM組分泌GDNF明顯升高 （P＜0.05或P＜0.01），提示正常、激活狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基都可顯著促進(jìn)AS分泌GDNF；與ACM組相比，ACMT組GDNF表達(dá)量明顯升高（P＜0.01），與ICM組相比，ICM-T組GDNF表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明活血涼血之通絡(luò)救腦注射液作用于激活BMEC后，其條件培養(yǎng)基可促進(jìn)AS分泌GDNF，增強(qiáng)AS保護(hù)神經(jīng)元的功能。

表3 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS表達(dá)GDNF的影響（±s）

表3 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS表達(dá)GDNF的影響（±s）

組別 n OD值N組 61.00±0.00 I組 6 NCM組 6 0.51±0.06***0.87±0.07##ACM組 6 ACM-T組 6 1.08±0.05△△ICM組 6 0.67±0.14 ICM-T組 6 0.68±0.10 0.82±0.12#

圖2 不同BMEC條件培養(yǎng)基對受損AS分泌GDNF的影響

3 討 論

AS是哺乳動物腦中分布最廣的細(xì)胞。AS體積也是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中最大的。它可通過一系列作用支持神經(jīng)元的正常功能，包括提供營養(yǎng)、改善微環(huán)境、支持神經(jīng)干細(xì)胞、參與糖代謝及修復(fù)血腦屏障等。大量的AS在腦缺血缺氧期間被激活并通過多種方式對神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，包括合成與分泌NT、緩沖細(xì)胞外鉀離子及谷氨酸鹽、代謝多種神經(jīng)遞質(zhì)等，進(jìn)而使神經(jīng)細(xì)胞外內(nèi)環(huán)境保持穩(wěn)定，降低神經(jīng)元的損傷，最終維持了神經(jīng)元的正常生理功能［6］。本研究中筆者觀察到正常組及造模2 h后AS被激活，可分泌大量的BDNF和GDNF，顯示了AS功能存在時可保護(hù)神經(jīng)元。

BDNF和GDNF是AS在腦缺血缺氧損傷期間分泌的兩種主要神經(jīng)營養(yǎng)因子［7］。BDNF和GDNF可營養(yǎng)神經(jīng)元，促進(jìn)軸突再生，增強(qiáng)神經(jīng)元抵抗損傷的耐受性，抑制神經(jīng)元變性和死亡［8］。研究發(fā)現(xiàn)腦缺血缺氧后BDNF及其受體表達(dá)水平顯著提高，并對應(yīng)于固定的時間及分布區(qū)域，BDNF可穩(wěn)定鈣濃度、降低自由基損傷、抑制神經(jīng)元凋亡同時促進(jìn)其再生，從而恢復(fù)損傷的神經(jīng)元功能［7］。AS還通過分泌GDNF保護(hù)缺血缺氧的神經(jīng)元。大鼠腦缺血缺氧后給予外源GDNF可促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)損傷，降低遲發(fā)性神經(jīng)元死亡［9-10］。這與本研究的結(jié)果一致，且活血涼血之通絡(luò)救腦注射液可顯著促進(jìn)激活組、損傷組產(chǎn)生NT。

隨著神經(jīng)科學(xué)研究的深入，越來越多人開始重視神經(jīng)血管單元。提出這個概念是為了強(qiáng)調(diào)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和腦微血管細(xì)胞（BMEC）之間重要的相互聯(lián)系和影響，同時要求在一個小型的三維環(huán)境里，從整體上研究神經(jīng)元損傷和保護(hù)機(jī)制，那么在這個理論指導(dǎo)下，腦缺血缺氧時，神經(jīng)血管單元三個因素之間又是如何相互作用來保護(hù)神經(jīng)元的呢？藥物干預(yù)下，BMEC對AS分泌NT的功能會產(chǎn)生什么影響？本研究對體外培養(yǎng)細(xì)胞模型進(jìn)行了深層次研究。筆者先制成不同狀態(tài)BMEC條件培養(yǎng)基，再利用相同的方法制備損傷AS模型，分組后加入對應(yīng)的BMEC條件培養(yǎng)基，觀察AS活性，同時檢測其分泌BDNF、GDNF的量。結(jié)果顯示與正常組相比，模型組AS分泌BDNF、GDNF明顯減少，證明造模成功后損傷的AS分泌BDNF、GDNF明顯降低。與模型組相比，NCM組及ACM組產(chǎn)生BDNF、GDNF的量明顯增多，顯示正常、激活狀態(tài)的BMEC條件培養(yǎng)基都可顯著促進(jìn)AS分泌BDNF、GDNF，顯示了其可促進(jìn)AS分泌NT。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦組織缺血缺氧的基本病理變化不外乎虛實(shí)兩端，虛者為髓海不足或氣血不足，清竅失養(yǎng)，實(shí)者則為風(fēng)、火、痰、瘀蒙蔽腦竅。無論其證屬虛屬實(shí)，日久均可因氣血運(yùn)行不暢而導(dǎo)致瘀血內(nèi)生或原有瘀血癥狀加重。同時，現(xiàn)代生活水平的提高使得已有腦組織缺血缺氧患者的飲食控制更加困難，肥甘厚味、辛香炙煿甚至飲酒等使得瘀血化火，如此惡性循環(huán)，釀生血瘀、血熱的病理機(jī)制，使得缺血缺氧后的腦組織受損進(jìn)一步加重，致使其所產(chǎn)生的中風(fēng)、癡呆、眩暈等疾病的病理機(jī)制更加復(fù)雜、病情加深、病程遷延、治療及預(yù)后欠佳。通絡(luò)救腦注射液的主要有效成分為三七總皂苷及梔子苷。三七可活血化瘀止痛，梔子可涼血止血、清熱解毒，兩藥相合可起到很好的活血涼血之功效。研究表明，腦缺血缺氧后活血法可利用增加腦組織內(nèi)NT含量、改善認(rèn)知、加強(qiáng)神經(jīng)功能的恢復(fù)等途徑來減慢血管性癡呆大鼠的疾病過程，活血法可聯(lián)合補(bǔ)腎、益氣、疏肝等各種方法來加強(qiáng)神經(jīng)組織分泌NT的作用［11-12］。涼血法不但可以保護(hù)腦缺血缺氧后的BMEC，還可增加NT含量［13-14］。藥理研究發(fā)現(xiàn)三七皂苷能夠祛除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、減輕Ca2+內(nèi)流、減少血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、減輕炎癥［15］；梔子苷能減輕炎性反應(yīng)并保護(hù)BMEC，進(jìn)而對抗腦缺血損傷后發(fā)生的一系列反應(yīng)［16］。有研究顯示通絡(luò)救腦注射液可使BMEC分泌IGF1增多，降低血清NSE濃度以保護(hù)BMEC進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元［17］。研究還發(fā)現(xiàn)，通絡(luò)救腦注射液能夠抑制腦缺血大鼠腦組織表達(dá)Sema3A，提高GAP43含量同時縮小腦梗死體積，從而保護(hù)缺血缺氧的腦組織［18］。本研究中通絡(luò)救腦注射液作用于激活及損傷BMEC后，其條件培養(yǎng)基增強(qiáng)AS活性的作用顯著提高，同時AS所分泌的BDNF、GDNF量明顯增多，提示通絡(luò)救腦注射液作用于不同狀態(tài)的BMEC培養(yǎng)基后，能夠增強(qiáng)AS活性，并促進(jìn)其分泌NT。

總之，本研究初步探討了BMEC作用于受損AS后對其活性和分泌NT的影響，及活血涼血之通絡(luò)救腦注射液對其保護(hù)功能的促進(jìn)作用。但研究未能明確BMEC作用于AS腦保護(hù)的作用機(jī)制，能否進(jìn)一步尋找到相關(guān)的靶點(diǎn)及通絡(luò)救腦注射液可能的靶向作用將是今后進(jìn)一步研究的方向。

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Effect of Blood-Activating and Cooling-blood Method on Neurotrophin in Astrocytes of Oxygen-glucoseDeprived Rats

SHI Dongyan，ZHU Yuan，CHANG Cheng. The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210029，China.

Objective：To study the effect of blood-activating and cooling-blood method on neurotrophin in astrocytes of oxygen-glucose deprived rats by conditioned medium of rat brain microvascular endothelial cells（BMEC）.Methods：Five different states of BMEC conditions medium with oxygen-glucose-deprivation legal system called normal，active，activate merge Tongluo Jiunao Injection process，damage，and injury combined Tongluo Jiunao Injection process were made.The injured AS models were made in the same way and divided it into seven groups，being added the corresponding BMEC conditioned medium，namely normal controlled group（N），model group（I），the normal group treated with conditioned medium（NCM），activated group treated with conditioned medium （ACM），activated conditioned medium administration group treated group（ACM-T），injured group treated with conditioned medium （ICM），damage administration group treated with conditioned medium（ICM-T）.The activity of AS was observed and the amount of BDNF&GDNF came from AS was detected.Results：All of the normal，active and damage BMEC conditions states could significantly increase the activity of impaired AS and then significantly increase its secretion of BDNF&GDNF，the sequence of promotive effect was the activated group＞the normal group＞the injured group.When Tongluo Jiunao Injection was acted on the activated BMEC as a conditioned medium，it could promote the secretion of neurotrophin from AS.Conclusion：Tongluo Jiunao Injection has the blood-activating and cooling-blood function.It can significantly improve the activity of AS and promote the secretion of neurotrophin to reduce damage to the nerve cells when cerebral hypoxiaischemia happens，promote the recovery of nerve cell function which shows that it is a potential drug to treat cerebral hypoxia-ischemia.

Blood-activating and cooling-blood method；Brain microvascular endothelial cells；Astrocytes；Neurotrophin；Tongluo Jiunao Injection

R285.5

A

1004-745X（2017）05-0756-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.05.002

2017-02-08）

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81673759）；江蘇省六大高峰人才資助項(xiàng)目（2013WS-034）

△通信作者（電子郵箱：chch1967@163.com）