腫瘤壞死因子-α表達與腦出血患者神經(jīng)細胞凋亡的相關性研究

盧艷秋 ?？肆?王生鋒 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450014

腫瘤壞死因子-α表達與腦出血患者神經(jīng)細胞凋亡的相關性研究

盧艷秋 常克亮 王生鋒 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學科，河南 鄭州 450014

目的 探討腦出血患者炎性因子表達與細胞凋亡的關系。方法 選取腦出血患者48例，登記臨床資料并檢測血腫周圍腦組織TNF-α的不同時間段的表達。測定TNF-α表達：(1)Western Blot法；(2)免疫組化法。測定細胞凋亡：TUNEL法。結果 TNF-α的表達高峰期為0～24 h、13～48 h，TUNEL法測定神經(jīng)細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致，存在時間變化規(guī)律一致性。以凋亡細胞數(shù)為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數(shù)為橫軸制作散點圖。胞質TNF-α陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)相關系數(shù)r為0.954，呈明顯正相關。結論 腦出血患者血腫周圍腦組織TNF-α表達水平與神經(jīng)細胞凋亡數(shù)一致。

TNF-α；腦出血；神經(jīng)細胞；凋亡

神經(jīng)細胞的凋亡是腦出血后繼發(fā)性損害的主要表現(xiàn)形式，也是神經(jīng)功能損害的主要誘因，能夠促進神經(jīng)功能損傷的進行性發(fā)展[1]。炎性反應是腦出血后繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要作用機制，研究表明，NF-κB對多種炎性細胞因子的陽性表達水平、炎癥反應發(fā)展及神經(jīng)細胞損傷具有至關重要的作用[2]。TNF-α作為NF-κB的下游因子是炎性反應過程的重要參與元素[3]。本研究旨在觀察48例腦出血患者的臨床資料及血腫周圍腦組織TNF-α的時間表達規(guī)律和神經(jīng)細胞凋亡的時間周期規(guī)律，探討炎性因子TNF-α表達與神經(jīng)細胞凋亡的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2013-11—2015-11鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科收治的腦出血患者48例為研究組，男29例，女19例，年齡32～73歲，術前GCS評分13～14分5例，9～12分29例，3～8分14例。選取同期收治的需皮層造瘺行腦室手術治療的良性疾病患者10例為對照組，男6例，女4例，年齡29～70歲。所有研究標本均為正常手術中血腫周圍破碎腦組織。研究組取皮層造瘺距離血腫周圍1 cm處腦組織，對照組取皮層瘺口通道灰白質交界處的腦組織。

1．2 方法

1．2．1 研究組：根據(jù)術中取材時間與初發(fā)病時間間隔，將研究組分為6組各8例：0～6 h為1組，7～12 h為2組，13～24 h為3組，25～48 h為4組，49～96 h為5組，>96 h為6組。

1．2．2 Western Blot法：①預實驗檢測方法可信度；②提取細胞核蛋白、胞漿蛋白；③配制SDS-PAGE膠；④轉膜；⑤免疫反應；⑥化學發(fā)光、顯影、定影；⑦1D Image Analysis Software定量分析。

1．2．3 免疫組化法：制作石蠟切片行HE染色，然后按試劑盒步驟進行免疫組化檢測，于400倍高倍顯微鏡下觀察，隨機選擇5個無重復視野，進行TNF-α陽性細胞計數(shù)，以總和陽性細胞數(shù)作為測量值。

1．2．4 測定細胞凋亡：采用TDT介導下的dUTP缺口末端標記測定法(即TUNEL法)測定細胞凋亡水平。

2 結果

2．1 Western Blot法測定各組TNF-α表達水平及時間變化比較 TNF-α出血后表達水平顯著升高，研究組3組TNF-α表達水平為最高峰，與4組表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P3/4>0.05)，與其他各研究組比較差異有統(tǒng)計學意義(P1/3、P2/3、P3/4<0.05)。見表1。

表1 各組TNF-α表達水平比較

2．2 免疫組化法測定TNF-α的表達水平及時間變化比較 研究組4組TNF-α陽性表達細胞數(shù)最多，與3組比較差異無統(tǒng)計學意義(P3/4>0.05)，與其他各研究組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P2/4<0.05，P1/4、P4/5<0.01)。出血后13～48 h為TNF-α的表達高峰期。見表2。

表2 免疫組化法測定TNF-α表達水平

2．3 TUNEL法測定血腫周圍腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況及時間變化 研究組樣本在光鏡下查見大量棕色凋亡細胞，而對照組中凋亡細胞極為罕見。提示研究組神經(jīng)細胞凋亡數(shù)顯著多于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TUNEL檢測法測定研究組及對照組腦組織神經(jīng)細胞凋亡情況

2．4 細胞凋亡與TNF-α表達水平的關系 TNF-α的表達高峰期為13～48 h，Western Blot法及免疫組化法測定結果一致。TUNEL法測定神經(jīng)細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致。以凋亡細胞數(shù)為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數(shù)為橫軸制作散點圖。胞質TNF-α陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)相關系數(shù)R為0.954，呈明顯正相關。見圖1。

圖1 胞漿TNF-α陽性細胞數(shù)

3 討論

炎性因子是一種高生物活性的小分子多肽，TNF-α可啟動細胞因子系統(tǒng)進一步誘發(fā)機體代謝異常、血管通透性、血流動力學異常等過程。胡利華等[4]研究顯示，腦出血后TNF-α的表達水平即顯著升高，TNF-α陽性表達細胞數(shù)增多。趙衛(wèi)海等[5]發(fā)現(xiàn)腦出血后血腫周圍腦組織TNF-α陽性表達水平與炎性細胞數(shù)呈正相關。

本研究結果表明，TNF-α的表達高峰期分別為0～24 h、13～48 h，Western Blot法及免疫組化法測定結果一致。TUNEL法測定神經(jīng)細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致，以凋亡細胞數(shù)為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數(shù)為橫軸制作散點圖，胞漿TNF-α陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)呈明顯正相關。

本研究結果印證了腦出血后神經(jīng)細胞凋亡與TNF-α蛋白質表達水平、mRNA表達等因素有關，而神經(jīng)細胞凋亡情況與腦出血患者遠期預后、神經(jīng)功能損傷水平有關，因而調控、阻斷、降低IL-1β、TNF-α的蛋白質表達水平、mRNA表達及轉錄可能對降低神經(jīng)功能損傷嚴重程度或改善腦出血患者遠期預后有重要意義。但本研究例數(shù)相對較少，存在一定局限性，有待大規(guī)模臨床研究進一步證實相關結論。且本研究結果提示，未來研究方向應針對采用特異性活性抑制劑、RNA干擾劑、RNA抑制劑、蛋白質抑制劑及基因表達阻斷等相關技術阻斷或降低TNF-α的陽性表達水平，以期探索更為針對有效治療腦出血患者神經(jīng)功能損傷的治療手段。同時，應進一步研究TNF-α等炎性因子對神經(jīng)細胞凋亡的作用機制，為治療手段研究奠定基礎。

[1] Chen J，Wang L，Wu C，et al．Melatonin-enhanced autophagy protects against neural apoptosis via a mitochondrial pathway in early brain injury following a subarachnoid hemorrhage[J]．J Pineal Res，2014，56(1)：12-19．

[2] Zhou C，Xie G，Wang C，et al．Decreased progranulin levels in patients and rats with subarachnoid hemorrhage：a potential role in inhibiting inflammation by suppressing neutrophil recruitment[J]．J Neuroinflammation，2015，12：200．

[3] 陳光丑．顱腦損傷早期血清炎性細胞因子的變化與預后關系分析[J]．浙江創(chuàng)傷外科，2014，19(6)：889-891．

[4] 胡利華，吳江，杜丹華，等．實驗性腦出血急性期灶周組織水腫及炎性細胞因子的表達[J]．中風與神經(jīng)疾病雜志，2006，23(5)：552-554．

[5] 趙衛(wèi)海，海陳煉，余國棟．血清TNF-α IL-1 IL-6 IL-8在急性顱腦損傷后含量變化及意義[J]．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2013，16(16)：22-23．

(收稿2017-03-14)

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1673-5110(2017)12-0062-02