錳超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)豚鼠耳蝸組織Caspase 3蛋白活性的影響

林 馨，王一鳴

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310053）

錳超氧化物歧化酶基因轉(zhuǎn)染對(duì)豚鼠耳蝸組織Caspase 3蛋白活性的影響

林 馨，王一鳴

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州 310053）

采用雄性豚鼠按每天50 mg/kg給予醋酸潑尼松龍肌注連續(xù)10 d，在第6天按每天400 mg/kg給予硫酸卡那霉素肌注連續(xù)5 d的方法，制備腎虛耳聾模型。將攜帶MnSOD基因的慢病毒液經(jīng)圓窗膜注入豚鼠耳蝸的外淋巴液中，并檢測耳蝸外源性MnSOD和Caspase 3的活性。以此研究錳超氧化物歧化酶（MnSOD）基因?qū)δI虛耳聾豚鼠耳蝸組織的Caspase 3蛋白活性的影響，探討其對(duì)內(nèi)耳氧化損傷的保護(hù)作用機(jī)制。結(jié)果表明外源性MnSOD基因轉(zhuǎn)染腎虛耳聾豚鼠耳蝸組織能夠抑制其Caspase 3的蛋白活性，從而對(duì)內(nèi)耳氧化損傷起到保護(hù)作用。

錳超氧化物歧化酶；腎虛耳聾；Caspase 3

超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是廣泛存在于生物體各個(gè)組織中的重要金屬酶，是唯一將超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫的抗氧化酶。目前已知的哺乳動(dòng)物體內(nèi)SOD有三種異構(gòu)體，分別是銅/鋅超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD或SOD1）、錳超氧化物歧化酶（MnSOD或SOD2）和細(xì)胞外超氧化物歧化酶（ECSOD或SOD3）。Cu/ZnSOD主要存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞漿、胞核及溶酶體內(nèi)，MnSOD主要存在于需氧細(xì)胞的線粒體中，ECSOD最初在人血漿、淋巴、腹水和腦脊液中發(fā)現(xiàn)，與肝素有較高的親和力，三種SOD主要在它們各自的部位發(fā)揮保護(hù)功能。線粒體的氧化呼吸鏈?zhǔn)求w內(nèi)自由基產(chǎn)生的最主要場所，MnSOD是線粒體內(nèi)的主要酶性自由基的清除劑，在維持線粒體功能、體內(nèi)外抗氧化損傷中發(fā)揮重要作用。NAKASHIMA等[1]將帶有Cu/ZnSOD和MnSOD的基因?qū)腚嗍蠖?，發(fā)現(xiàn)能對(duì)抗氨基糖甙類藥物的部分毒性，且MnSOD起主導(dǎo)作用，MnSOD水平的調(diào)節(jié)可能是細(xì)胞所有氧化還原狀態(tài)的重要生理機(jī)制。

Caspase 3屬于Caspase（Cysteine-requiring Aspartate Protease）家族，在細(xì)胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用。因此Caspase 3在海內(nèi)外有關(guān)哺乳動(dòng)物細(xì)胞研究中最受關(guān)注。Caspase 3可以剪切procaspase 2、6、7和9，并可直接特異性剪切眾多 Caspase底物，包括 PARP（poly（ADP-ribose）polymerase）、ICAD（Inhibitor of Caspase-activated deoxyribonuclease）等。上述由Caspase 3介導(dǎo)的蛋白剪切是細(xì)胞凋亡分子機(jī)制的重要組成部分。此外，Caspase 3對(duì)細(xì)胞起泡和細(xì)胞核的凋亡過程中也起關(guān)鍵作用。因此為了進(jìn)一步研究MnSOD對(duì)豚鼠耳蝸組織中Caspase 3活性的影響，本課題將MnSOD基因?qū)肽I虛耳聾豚鼠耳蝸組織產(chǎn)生持續(xù)高表達(dá)，測定其對(duì)Caspase 3表達(dá)的影響，從而說明MnSOD是否通過對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的抑制而起到有效的抗氧化保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

超氧化物歧化酶（SOD）分型測試盒；Caspase 3活性檢測試劑盒（碧云天）；EcoR I、Not I、XbaI（Fermentas）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豚鼠MnSOD基因慢病毒載體的構(gòu)建

從GenBank:U39843.1獲得豚鼠MnSOD基因信息，據(jù)此設(shè)計(jì)含cMnSOD基因的DNA片段，并由金斯瑞進(jìn)行合成，其序列（674 bp）如下：

軟件驗(yàn)證其翻譯后氨基酸序列與GenBank:U39843.1獲信息一致:

EFDLYDDDDKMLCRAVCSASRRLAPAL－

GILGVRQKHSLPDLPYDYGALQPHI －

NAEIMQLHHSKHHAAYLNNLNI

AEEKYQEALAKGDVTAQVALQ

PALKFNGGGHINHSIFWTNLSP

NGGGEPKGELLEAIKRDFGSFDK

FKEKLTAVSVGVQGSGWGWL

GFNKERGCLQIAACSNQDPLQGTTGLI

PLLGIDVWEHAYYLQLKNVRPDYLKAIWKVIKNS

合成基因（cMnSOD）克?。‥coR I/Not I）至pLVHisSSD-Puro（慢病毒載體），獲得pLV-HiscMnSOD–Puro。最終質(zhì)粒進(jìn)行EcoRI/XbaI酶切鑒定和基因測序鑒定，結(jié)果如圖1。

1.2.2 MnSOD基因慢病毒的制備

轉(zhuǎn)染前 24 h，將 293V 細(xì)胞以（4～5）×106/10 cm2平皿密度接種，加入10 mL 293V培養(yǎng)基37℃，5%CO2培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前密度應(yīng)達(dá)到90%。漩渦震蕩混勻Polyfect-V轉(zhuǎn)染試劑。準(zhǔn)備2個(gè)離心管，按以下順序分別制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液。離心管1：目的基因慢病毒載體質(zhì)粒5 μg，pH1 質(zhì)粒 3.75 μg，pH2 質(zhì)粒 1.25 μg，加 DMEM 無血清培養(yǎng)基至 500 μL；離心管 2：Polyfect-V 轉(zhuǎn)染試劑 20 μL，加DMEM無血清培養(yǎng)基至500 μL。充分混勻。將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液（離心管2）加入質(zhì)粒DNA溶液（離心管1）中，立刻充分混勻。室溫孵育轉(zhuǎn)染混合液15 min。將轉(zhuǎn)染混合液逐滴加入步驟1準(zhǔn)備的細(xì)胞培養(yǎng)皿，前后晃動(dòng)培養(yǎng)皿，充分混勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)。4～6 h后，用10 mL新鮮的293V培養(yǎng)基換液。轉(zhuǎn)染后24 h，用10 mL病毒培養(yǎng)基換液。轉(zhuǎn)染后48～72 h收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。500 g離心10 min去除細(xì)胞碎片；上清過0.45 μm濾膜即可直接用于慢病毒感染。

圖1 pLV-HisSSD-Puro質(zhì)粒圖譜及測序結(jié)果Fig.1 pLV-HisSSD-Puro plasmid map and sequencing results

1.2.3 動(dòng)物模型的建立，制備腎虛耳聾動(dòng)物模型

選用健康活潑、無耳疾、耳廓反射靈敏的白色紅目雄性豚鼠12只，體重250～350 g，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組，腎虛耳聾模型組（模型組3只）：50 mg/（kg·d）醋酸潑尼松龍（肌注，10 d）+400 mg/（kg·d）硫酸卡那霉素（從第6天開始，肌注，5 d）。腎虛耳聾治療組（治療組3只）：醋酸潑尼松龍（劑量同致聾組）+硫酸卡那霉素（劑量同致聾組），同時(shí)在第6天開始經(jīng)左耳圓窗膜向外淋巴液注射攜帶有MnSOD基因的慢病毒液體6 μL?？瞻讓?duì)照組（空白組3只）：單純給予醋酸潑尼松龍（劑量同致聾組），在第6天經(jīng)左耳圓窗膜向外淋巴液注射生理鹽水6 μL。

手術(shù)操作-圓窗膜進(jìn)路：10%水合氯醛麻醉動(dòng)物，暴露并打開聽泡，擴(kuò)大骨孔，手術(shù)顯微鏡下辨認(rèn)蝸窗膜，用尖端彎曲的10 μL微量進(jìn)樣器刺破圓窗膜，抽取MnSOD病毒液或生理鹽水（6 μL），以3 μL/5 min的速度緩慢地注入外淋巴，注射完畢后取顳肌筋膜填于圓窗龕內(nèi)，以防止穿刺部位液體回漏，縫合皮膚切口。于經(jīng)左耳圓窗膜注射4周后行下一實(shí)驗(yàn)步驟。

1.2.4 外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染腎虛耳聾豚鼠后耳蝸組織內(nèi)的MnSOD及Caspase 3活性測定

1.2.4.1耳蝸組織錳超氧化物歧化酶（MnSOD）活性測定

各組動(dòng)物麻醉處死，取聽泡，在解剖顯微鏡下剔除蝸殼，將蝸軸連同膜蝸管取下，雙耳合為一份標(biāo)，稱重，以1 g：1 000 mL生理鹽水稀釋研磨，制成5%組織勻漿4 000 r/min離心15 min。取小量用Bradford法檢測待測樣品中的蛋白濃度。取上清30 μL按SOD分型測試盒說明書加入試劑，37℃水浴40 min后加入顯色劑，靜置10 min，用分光光度計(jì)550 nm下測吸光度，計(jì)算SOD總活性（U/mg pro）。取上述5%勻漿50 μL按說明書加入等體積試劑7混勻后4 000 r/min離心15 min，取上清按上述相同方法加樣測定，計(jì)算Zn－Cu-SOD活性（U/mg pro）。SOD總活性減去ZnCu-SOD活性即為MnSOD活性（U/mg pro）。

1.2.4.2耳蝸組織Caspase 3活性測定

樣本前處理同1.2.4.1。取上清10?L按Caspase 3活性檢測試劑盒說明書加入試劑。

A.取出pNA和適量的Ac-DEVD-pNA(2mM)，置于冰浴上備用。

B.如下設(shè)置反應(yīng)體系：

試劑 空白對(duì)照 樣品檢測緩沖液待測樣品Ac-DEVD-pNA（2 mM）總體積90 μL 0 μL 10 μL 100 μL 80 μL 10 μL 10 μL 100 μL

在設(shè)置反應(yīng)體系時(shí)先加檢測緩沖液，再加待測樣品，適當(dāng)混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。隨后再加入 10 μL Ac-DEVD-pNA（2 mM）。

C.加入Ac-DEVD-pNA（2 mM）后混勻，注意避免在混勻時(shí)產(chǎn)生氣泡。37℃孵育60～120 min。發(fā)現(xiàn)顏色變化比較明顯時(shí)即可測定A405。

D.樣品的A405扣除空白對(duì)照的A405，即為樣品中Caspase 3催化產(chǎn)生的pNA產(chǎn)生的吸光度。

E.參考Chemicon公司的Caspase 3酶活力單位的定義,計(jì)算出樣品中含有多少個(gè)酶活力單位的Caspase 3。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。統(tǒng)計(jì)分析采用單因素方差分析，P表示顯著性，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染腎虛耳聾豚鼠后其耳蝸組織內(nèi)的MnSOD活性測定結(jié)果表明（見表1和圖2），與空白組比，模型組豚鼠耳蝸組織內(nèi)的MnSOD活性顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）。而與模型組比，MnSOD基因轉(zhuǎn)染組豚鼠耳蝸組織內(nèi)的MnSOD活性顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）,說明MnSOD外源基因轉(zhuǎn)染成功。

圖2 豚鼠耳蝸組織內(nèi)的總SOD、ZnCu-SOD及MnSOD活性Fig.2 Total SOD,ZnCu-SOD and MnSOD activities in guinea pig cochlea

表1 豚鼠耳蝸組織內(nèi)的MnSOD活性（n=3）Tab.1 MnSOD activity in guinea pig cochlear tissue(n=3)

為了進(jìn)一步明確外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染后對(duì)豚鼠耳蝸組織的作用，本實(shí)驗(yàn)檢測了外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染前后腎虛耳聾豚鼠耳蝸組織內(nèi)的Caspase 3活性。表2結(jié)果表明，其耳蝸組織內(nèi)的Caspase 3活性測定結(jié)果如表2。腎虛耳聾模型組耳蝸組織內(nèi)的Caspase 3活性與空白組相比顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05）。而外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染腎虛耳聾豚鼠后，MnSOD轉(zhuǎn)染組的Caspase 3活性明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.05），說明外源MnSOD基因轉(zhuǎn)染抑制了虛耳聾豚鼠后耳組織內(nèi)的Caspase 3的活性。

3 討論

感音神經(jīng)性聾是臨床難治性疾病之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國聽力障礙殘疾人有2 057萬，占全部人口的1.67%，其中超過80%是感音神經(jīng)性聾。劉蓬等[2-3]研究證實(shí)，聽力障礙多表現(xiàn)為腎虛的主要征象，腎虛易致耳聾。前期調(diào)查研究表明，浙江省7歲以下進(jìn)行聽覺語言康復(fù)訓(xùn)練的感音神經(jīng)性聾兒童，其中辨證為腎虛型的占30.5%[4]。由于耳蝸的特殊解剖位置且具有血-迷路屏障，藥物難以在耳蝸局部達(dá)到有效濃度，故目前尚無有效的治療感音神經(jīng)性聾的藥物和方法。

表2 豚鼠耳蝸組織內(nèi)的Caspase 3活性（n=3）Tab.2 Caspase 3 activity in guinea pig cochlear tissue(n=3)

“腎為先天之本”。腎氣、腎陽是一身陽氣根本。對(duì)人體有推動(dòng)、溫煦功能，腎陰為一身陰液根本，對(duì)人體有滋養(yǎng)、濡潤作用。腎的精氣旺盛，體內(nèi)清除自由基的酶類和非酶類系統(tǒng)功能正常，自由基對(duì)人體的損害較?。幌喾矗I氣衰弱，則必然引起機(jī)體正氣不足，影響機(jī)體的代謝能力，則機(jī)體內(nèi)清除自由基的酶類和非酶類系統(tǒng)功能低下，自由基造成的過氧化反應(yīng)導(dǎo)致對(duì)人體的損害。陳揚(yáng)榮等[5]研究表明腎氣虛組患者的SOD活性明顯低下，血漿中過氧化脂含量增多，提示腎虛與SOD活力的低下關(guān)系密切。腎虛導(dǎo)致內(nèi)耳自由基蓄積，氧自由基的堆積是引發(fā)聽毛細(xì)胞退行性變的始動(dòng)因素。

近年來的研究表明自由基可通過生物膜中不飽和脂肪酸的過氧化導(dǎo)致生物膜形態(tài)和功能的改變，從而引起細(xì)胞壞死或凋亡，細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在各種死亡信號(hào)刺激后發(fā)生的一系列程序性的死亡過程，Caspase家族是細(xì)胞凋亡最關(guān)鍵的執(zhí)行因子，尤其是Caspase3[6]。多種多樣刺激因素啟動(dòng)的信號(hào)激活Caspase3，活化的Caspase3可作用于一些其它Caspase成員，并以瀑布式活化引起細(xì)胞形態(tài)上的改變，最終完成凋亡過程，因此Caspase3的激活被認(rèn)為是凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路[7-8]。Caspase 3表達(dá)陽性意味著細(xì)胞凋亡在進(jìn)行過程中。

MnSOD是線粒體內(nèi)的主要酶性自由基的清除劑，在維持線粒體功能、體內(nèi)外抗氧化損傷中發(fā)揮著重要作用，也是內(nèi)耳組織細(xì)胞中十分重要的抗氧化酶類。結(jié)果證明腎虛耳聾豚鼠耳窩組織內(nèi)MnSOD水平比空白組明顯降低，而轉(zhuǎn)染外源MnSOD基因后，耳窩組織內(nèi)MnSOD水平顯著升高。同時(shí)，從Caspase3活性的檢測結(jié)果可以看出，與空白組相比，腎虛耳聾豚鼠耳窩組織內(nèi)Caspase3活性顯著上升，而轉(zhuǎn)染外源Mn－SOD基因后，Caspase3活性明顯下降。由此推斷，腎虛耳聾可能與耳蝸組織內(nèi)清除自由基功能低下、Caspase3活性升高有關(guān)，而外源性MnSOD基因能成功在腎虛耳聾豚鼠耳窩組織內(nèi)表達(dá)，并且外源性MnSOD能夠顯著抑制耳蝸組織內(nèi)Caspase 3的活性，從而有可能抑制了耳蝸組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡途徑，但其抑制凋亡的具體機(jī)制仍有待深入探討。

[1]NAKASHIMA T,UEDA H,FURUHASHI A,et al.Large vestibular aqueduct syndrome treated by hyperbaric oxygen[J].International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology,2000,51(3):207-210.

[2]劉 蓬,王培源,邱寶珊,等.腎陰虛對(duì)卡那霉素耳毒易感性的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(3):24-27.

[3]劉 蓬,邱寶珊,王培源,等.腎陰虛對(duì)豚鼠聽力的影響及補(bǔ)腎中藥的拮抗作用 [J].中國中西醫(yī)結(jié)合耳鼻咽喉科雜志,2001,9(2):57-63.

[4]王永華,樓蘭花,劉金洪,等.中藥“天鼓”對(duì)卡那霉素中毒性耳聾的預(yù)防作用及機(jī)理研究[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2001,7(10):28-31.

[5]陳揚(yáng)榮,江 明,李慶陽.老年脾腎虛證LPO、SOD、血脂關(guān)系的探討[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志,2002,8(7):44-45.

[6]NOOR R,SHUAIB U,WANG Chenxu,et al.High-density lipoprotein cholesterol regulates endothelial progenitor cells by increasing eNOS and preventing apoptosis[J].Atherosclerosis,2007,192(1):92-99.

Effects of Manganese Superoxide Dismutase Gene Transfection on the Activity of Caspase 3 Protein in Guinea Pig Cochlear Tissue

LIN Xin,WANG Yi-ming
（College of Medicine and Technology,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310053,China）

First,the model of kidney deficiency deafness was prepared,male guinea pigs were given 50 mg/kg/day prednisolone acetate for 10 days.Then from day 6 each guinea pigs were intramuscular injection kanamycin 400mg/kg/day.The lentiviral solution carrying manganese superoxide dismutase(MnSOD)gene was injected into the perilymph of guinea pig cochlea through round window membrane,and the activities of exogenous MnSOD and Caspase 3 were detected.In order to studied the effect of MnSOD gene on the activity of Caspase 3 protein in cochlear tissue of guinea pigs with kidney vacuity deafness.And explored the protective mechanism of MnSOD gene on oxidative damage in inner ear.The results showed that the cochlear tissue of guinea pigs transfected with exogenous MnSOD gene could inhibit the activity of Caspase 3 protein and protect the inner ear from oxidative damage.Inhibit the activity of Caspase 3 protein,and thus protect the inner ear from oxidative damage.

MnSOD;kidney vacuity deafness;Caspase 3

R965

：A

2016-12-10

浙江省教育廳科研項(xiàng)目（Y201121286）

林馨（1962-），女，浙江杭州人，主任中醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合耳聾康復(fù).E-mail:595188264@qq.com

1008－830X(2017)01－0081－05