芽孢桿菌NY3的鑒定及其對(duì)雞毛菜的促生效果

邢芳芳+高明夫+胡兆平+范玲超

摘要：在形態(tài)分類(lèi)的基礎(chǔ)上，結(jié)合分子鑒定手段對(duì)芽孢桿菌NY3進(jìn)行分類(lèi)鑒定；并將芽孢桿菌NY3進(jìn)行液體發(fā)酵培養(yǎng)，在溫室條件下，研究NY3菌株對(duì)雞毛菜（Brassica chinensis）的促生效果。依據(jù)NY3的培養(yǎng)性狀、顯微特征描述和系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示菌株NY3屬于蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）；在溫室盆栽試驗(yàn)中，添加NY3菌劑的各處理生物量、葉綠素均比CK增加，其中，添加1.0 mL（T3，有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥+ NY3菌劑1.0 mL，含芽孢桿菌1.0×109 CFU）增產(chǎn)最高，鮮重、干重比對(duì)照組分別提高20.28%、14.34%。

關(guān)鍵詞：形態(tài)特征；分子鑒定；促生效果；蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）

中圖分類(lèi)號(hào)：S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）12-2239-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.011

Identification of Bacillus spp. NY3 and Its Growth Promoting

Effect on Brassica chinensis

XING Fang-fang， GAO Ming-fu， HU Zhao-ping， FAN Ling-chao

（Kingenta Ecological Engineering Group Co.，Ltd./State Key Laboratory of Nutrition Resources Integrated Utilization，Linyi 276700，Shandong，China）

Abstract： NY3 was classified and identified by combining morphological classification with molecular identification means. After fermentation of Bacillus spp. NY3， under the condition of the greenhouse，the growth promoting effect of NY3 on Brassica chinensis was researched. According to the description of culture characters and microscopic characteristics of NY3， combining molecular identification， the strain NY3 was identified as B. cereus. NY3 has obvious effect on promoting growth of B. chinensis， the adding of 1 mL（T3，Organic inorganic fertilizer+NY3 bacterial agent 1.0 mL） NY3 agents had the best effect on increasing the biological yield and SPAD significantly， which contained 1.0×109 CFU/mL spores of NY3. Compared with CK， fresh weight and dry weight of T3 was increased by 20.28% and 14.34%， respectively.

Key words： morphologic character； molecular identification； growth promoting effect； Bacillus cereus

芽孢桿菌是一類(lèi)需氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌（目前也發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陰性），因其抗逆性強(qiáng)、繁殖速度快、易于生產(chǎn)、定殖等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物肥料的研究與生產(chǎn)中。芽孢桿菌在自然界分布廣泛，生理特性豐富多樣，是土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢(shì)種群之一。它可以產(chǎn)生抗菌肽類(lèi)物質(zhì)，對(duì)根腐病、立枯絲核病等多種病原菌均能起到很好的抑制作用[1]。蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）是芽孢桿菌的一種，其芽孢對(duì)高溫、干旱、鹽脅迫等極端環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗能力，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，芽孢迅速萌發(fā)，在環(huán)境條件較惡劣時(shí)，芽孢快速形成，進(jìn)入休眠狀態(tài)。蠟樣芽孢桿菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量、抑制作物病害的功能，部分蠟樣芽孢桿菌還具有抑菌和殺蟲(chóng)作用。蠟樣芽孢桿菌在繁殖、代謝過(guò)程中可以產(chǎn)生多種具有抑菌、殺菌活性的代謝產(chǎn)物，能夠抑制有害微生物的繁殖，抑制鐮刀菌、立枯絲核菌等病原真菌[2，3]。菌體代謝過(guò)程中還能分泌蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等多種活性酶類(lèi)，能夠降解土壤中的有機(jī)物，改善生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)作物生長(zhǎng)。蠟樣芽孢桿菌的芽孢具有較強(qiáng)的耐熱、耐鹽等抗逆性，在發(fā)酵工藝、劑型加工、貨架期、定殖能力等方面與其他芽孢桿菌相比具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。蠟樣芽孢桿菌因其獨(dú)特的功能特性，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、畜牧業(yè)等領(lǐng)域[4，5]。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保藏的一株篩分自健康、高產(chǎn)番茄根際土壤的芽孢桿菌NY3進(jìn)行了鑒定，并將菌株NY3進(jìn)行液體發(fā)酵制備菌劑，通過(guò)盆栽試驗(yàn)研究活體菌劑對(duì)雞毛菜生長(zhǎng)季產(chǎn)量的影響，為該芽孢桿菌劑的進(jìn)一步推廣提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 芽孢桿菌NY3保藏于金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司菌種保藏室，篩分自山東省臨沂市大棚健康、高產(chǎn)番茄根際土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.2，105 Pa滅菌30 min；蠟樣芽孢桿菌選擇培養(yǎng)基：稱(chēng)取甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂基礎(chǔ)（MYP，青島海博生物技術(shù)有限公司）4.6 g，加熱溶解于100 mL去離子水中，經(jīng)121 ℃高壓滅菌15 min，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時(shí)，每瓶加入50%卵黃乳液5 mL及多黏菌素B 10 000 IU，搖勻，傾入無(wú)菌平皿；種子培養(yǎng)基[6]：胰蛋白胨8.0 g，酵母提取物5.0 g，葡萄糖10.0 g，NaCl 5.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0，分裝于300 mL三角燒瓶，每瓶50 mL，105 Pa滅菌15 min；菌株發(fā)酵培養(yǎng)基[6]：玉米淀粉2.0 g，黃豆餅粉5.0 g，酵母粉0.55 g、K2HPO4 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，CaCO3 0.05 g，ZnSO4 0.02 g，去離子水100 mL，pH 7.2，裝入500 mL三角燒瓶中，105 Pa滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌NY3形態(tài)觀察 將斜面上保藏的NY3接種到MYP培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h，用于觀察菌落和菌體的形態(tài)特征。

1.2.2 菌株NY3的活化 取冰箱保存的試管斜面，劃線活化于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，連續(xù)傳代兩次即得到活化菌株。

1.2.3 菌株NY3制劑的制備 挑取活化后的健壯NY3菌落接種于種子培養(yǎng)基中，35 ℃、200 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)18 h后，按照10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，每瓶發(fā)酵培養(yǎng)基接種10 mL，200 r/min搖床培養(yǎng)32 h，即得NY3發(fā)酵液。離心發(fā)酵液得上清液和菌體沉淀，將菌體沉淀用去離子水配成含有109 CFU/mL的NY3菌劑[7]。

1.2.4 NY3分子生物學(xué)鑒定 NY3 16S rDNA PCR擴(kuò)增參考謝永麗等[8]的方法。將NY3活化菌株接入種子培養(yǎng)基中，裝瓶量為70 mL/300 mL，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，離心收集菌體，并用滅菌濾紙吸干多余水分，利用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司），提取NY3基因組，擴(kuò)增引物分別為16S rDNA通用引物27F：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，引物27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL，Taq酶0.2 μL，G1基因組0.5 μL，加無(wú)菌水至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性35 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 min，共25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。由生工生物工程（上海）股份有限公司對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。將測(cè)得的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似性高的相關(guān)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)[9]。

1.2.5 雞毛菜盆栽試驗(yàn) 于2016年1月9日至2月18日在金正大生態(tài)工程集團(tuán)股份有限公司的智能玻璃溫室中進(jìn)行。

供試雞毛菜（Brassica chinensis），在本地種子站購(gòu)得，為本地常用品種；供試底肥為山東泉林嘉有肥料有限責(zé)任公司生產(chǎn)的黃腐酸有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥（13-13-5），有機(jī)質(zhì)≥150 g/kg，黃腐酸≥80 g/kg。NY3芽孢桿菌劑為芽孢桿菌數(shù)為1.0×109 CFU/mL的活菌制劑；供試土壤為棕壤，有機(jī)質(zhì)含量為12.6 g/kg。

設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，每盆裝土2 kg，有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥的施用量為750 kg/hm2，全部肥料作為基肥一次性施入。CK為對(duì)照，不施用菌劑；處理組為使用不同用量的菌劑，處理1（T1）添加NY3菌劑0.1 mL（含芽孢桿菌1.0×108 CFU）；處理2（T2）添加NY3菌劑0.5 mL（含芽孢桿菌5.0×108 CFU），處理3（T3）添加NY3菌劑1.0 mL（含芽孢桿菌1.0×109 CFU），每盆播種10株以上的雞毛菜種子。待雞毛菜長(zhǎng)出2片真葉后間苗定植，每盆1株，于收獲時(shí)測(cè)定鮮重、葉綠素和葉片數(shù)，烘干后稱(chēng)干重。

1.2.6 葉片數(shù)、生理指標(biāo)測(cè)定 葉片數(shù)只選擇綠色可食用部分；葉綠素含量測(cè)定采用SPAD-502Plus型葉綠素測(cè)定儀進(jìn)行；干重測(cè)定按常規(guī)方法進(jìn)行[10，11]。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行處理，利用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 NY3菌株的形態(tài)觀察

NY3菌落在MYP培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落為粉紅色，周?chē)蟹奂t色暈圈，表面粗糙似融蠟狀，不透明（圖1，左）；通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察芽孢形態(tài)，芽孢呈鏈狀排列，圓形或橢圓形，直徑1.0～1.5 μm，革蘭氏染色呈陽(yáng)性（圖1，右）。

2.2 菌株16S rDNA基因序列擴(kuò)增與測(cè)序

PCR擴(kuò)增片段電泳結(jié)果如圖2所示，芽孢桿菌NY3 16S rDNA基因序列擴(kuò)增后片段長(zhǎng)度為1 449 bp。

由圖3可知，芽孢桿菌NY3與蠟樣芽孢桿菌ATCC 14579同源性最高，匹配程度可達(dá)到100%，結(jié)合菌株形態(tài)及顯微鏡觀察，確定NY3為蠟樣芽孢桿菌。

2.3 芽孢桿菌NY3對(duì)葉綠素含量、雞毛菜葉片數(shù)的影響

由圖4可知，與CK相比，施用菌劑的各處理均提高了雞毛菜葉片中葉綠素含量，差異均不顯著。其中，添加NY3菌劑0.1 mL（T1）的雞毛菜葉片葉綠素含量提高1.93%，添加NY3菌劑0.5 mL（T2）葉綠素含量提高3.18%，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）葉綠素含量提高3.66%。就葉片數(shù)而言，與CK相比，各處理均提高了雞毛菜葉片數(shù)。其中，T1較CK葉片數(shù)增加2.78%，T2較CK葉片數(shù)增加5.56%，T3較CK葉片數(shù)增加6.94%，T2、T3與CK相比差異顯著。表明在施加有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥為底肥的情況下每盆施用0.1×108～1.0×109 CFU的蠟樣芽孢桿菌NY3活體可以提高葉綠素含量，增加葉片數(shù)，其中，T2、T3與CK相比對(duì)葉片數(shù)有顯著增加作用。

2.4 芽孢桿菌NY3對(duì)雞毛菜鮮重、干重的影響

由表1可知，與CK相比，添加NY3菌劑的處理鮮重增加3.51～7.78 g，干重增加0.05～0.44 g。其中，添加NY3菌劑0.1 mL（T1）較對(duì)照（CK）鮮重增加9.15%，干重增加1.64%，添加NY3菌劑0.5 mL（T2）較CK鮮重增加15.66%，干重增加11.15%，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）增產(chǎn)最高，較CK鮮重增加20.28%，干重增加14.43%。表明在施加有機(jī)無(wú)機(jī)復(fù)混肥的基礎(chǔ)上增施蠟樣芽孢桿菌NY3菌劑，可增加雞毛菜的鮮重和干重，且每盆增施蠟樣芽孢桿菌0.5×109～1.0×109 CFU NY3活體芽孢，可極顯著增加雞毛菜的鮮重和干重。

3 小結(jié)與討論

通過(guò)分子生物學(xué)鑒定，結(jié)合形態(tài)觀察，確定NY3菌株為蠟樣芽孢桿菌。

對(duì)蠟樣芽孢桿菌NY3進(jìn)行促生效果評(píng)價(jià)，施加NY3菌劑0.1、0.5、1.0 mL，對(duì)雞毛菜的生長(zhǎng)均起到了促進(jìn)作用，提高了其對(duì)水分的吸收、干物質(zhì)的積累以及葉片葉綠素含量。其中，添加NY3菌劑1.0 mL（T3）較CK鮮重提高20.28%，干重提高14.43%。表明蠟樣芽孢桿菌NY3對(duì)雞毛菜的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用，有效活菌數(shù)越高對(duì)雞毛菜的促生效果越明顯。但在提高葉綠素含量方面差異不明顯，而添加NY3菌劑0.5～1.0 mL能顯著增加雞毛菜葉片數(shù)。

芽孢桿菌作為一種資源豐富的微生物類(lèi)群，具有廣譜的植物病害防治、促進(jìn)作物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗性等作用，已發(fā)現(xiàn)有芽孢桿菌菌株能有效促進(jìn)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，提高植物產(chǎn)量。芽孢桿菌能賦予宿主植物耐受非生物脅迫的能力，并在緩解強(qiáng)脅迫的環(huán)境壓力，如干旱、鹽堿、低溫以及重金屬污染等發(fā)面發(fā)揮重要作用。目前，微生物菌劑作用的穩(wěn)定性常受到外界環(huán)境的影響，尤其是田間降水、溫度、土壤pH以及土壤微環(huán)境等，均會(huì)對(duì)微生物菌劑作用的發(fā)揮帶來(lái)影響。因此，后續(xù)試驗(yàn)還需在不同土壤環(huán)境和不同氣候的條件下，對(duì)蠟樣芽孢桿菌NY3的促生效果進(jìn)行研究和驗(yàn)證，為其開(kāi)發(fā)成良好的農(nóng)用微生物菌劑奠定基礎(chǔ)。

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