蛋白同化雄性類固醇檢測技術(shù)研究進(jìn)展

李國俊

摘 要：蛋白同化雄性類固醇是一類濫用最為普遍的禁用物質(zhì)， 對(duì)其進(jìn)行有效的控制和檢測關(guān)系到運(yùn)動(dòng)員的身心健康和體育比賽的公平公正。對(duì)該類禁用物質(zhì)分析方法的改進(jìn)和發(fā)展是目前興奮劑檢測的重要任務(wù)。該文通過對(duì)蛋白同化雄性類固醇使用現(xiàn)狀的分析，結(jié)合里約奧運(yùn)會(huì)類固醇檢測技術(shù)的研究分析和近兩年在國內(nèi)外期刊發(fā)表的有關(guān)類固醇檢測方面的文獻(xiàn)進(jìn)行歸納總結(jié)，以為相關(guān)機(jī)構(gòu)開展有關(guān)研究提供借鑒依據(jù)。

關(guān)鍵詞：蛋白同化雄性類固醇 檢測 長效代謝物

中圖分類號(hào)：R87 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2017）06（a）-0252-02

1 蛋白同化雄性類固醇在體育領(lǐng)域使用現(xiàn)狀分析

蛋白同化雄性類固醇具有三個(gè)特點(diǎn)，一是具有蛋白同化的生理活性，其蛋白同化作用可以增加蛋白質(zhì)合成， 促進(jìn)肌肉增長和紅細(xì)胞生成， 增強(qiáng)力量和耐力；二是屬于雄性激素，而雄性激素作用可以使男性性特征更加明顯；三是該類物質(zhì)從化學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)上屬于類固醇，它是廣泛分布于生物界的一大類環(huán)戊稠環(huán)全氫化菲衍生物的總稱， 又稱甾醇、甾族化合物。

20世紀(jì)50年代，前蘇聯(lián)舉重運(yùn)動(dòng)員開始通過服用雄性激素睪酮增加力量。到20世紀(jì)60年代，競技運(yùn)動(dòng)員使用類固醇激素的現(xiàn)象已非常普遍，因而國際奧林匹克委員會(huì)（IOC）將這類物質(zhì)判定為興奮劑而明令禁止。目前，在所有禁用物質(zhì)當(dāng)中，蛋白同化雄性類固醇仍然是濫用最為普遍的物質(zhì)，在世界反興奮劑機(jī)構(gòu)“2015 Anti-Doping Testing Figures”可以看出， 2015年世界反興奮劑機(jī)構(gòu)認(rèn)可的興奮劑檢測實(shí)驗(yàn)室所提供的陽性物質(zhì)統(tǒng)計(jì)中，蛋白同化雄性類固醇陽性率仍然達(dá)到50%～60%。國際舉重聯(lián)合會(huì)公布國際奧委會(huì)復(fù)檢北京、倫敦奧運(yùn)會(huì)樣品陽性結(jié)果，大多涉及類固醇的長效代謝物。

類固醇類興奮劑的濫用嚴(yán)重影響到體育比賽的公平、公正性， 且長期使用這類興奮劑會(huì)嚴(yán)重干擾人體的自然激素平衡， 導(dǎo)致異性化現(xiàn)象，男性運(yùn)動(dòng)員使用會(huì)出現(xiàn)胸部增大，睪丸縮小，女性化特征明顯，而女性運(yùn)動(dòng)員使用會(huì)出現(xiàn)喉結(jié)，體毛加重，痤瘡等男性化特征，甚至可能引起嚴(yán)重的肝、腎損傷， 并發(fā)肝癌、心臟病， 并產(chǎn)生藥物依賴， 少數(shù)人還可能出現(xiàn)嚴(yán)重的情感及精神病癥。

在世界反興奮劑機(jī)構(gòu)《2016年禁用清單國際標(biāo)準(zhǔn)》中，蛋白同化雄性類固醇分為兩類，一是外源性蛋白同化雄性類固醇，如氯司替勃、去氫氯甲睪酮、美雄酮等。另一類是外源性攝入內(nèi)源性蛋白同化雄性類固醇，代表物質(zhì)包括雙氫睪酮、普拉睪酮、睪酮等。內(nèi)源性蛋白同化雄性類固醇是指人體自身能夠分泌，外源性是指人體自身不能分泌而經(jīng)人工合成的。

2 類固醇常規(guī)分析方法

目前國際奧委會(huì)（IOC）規(guī)定的蛋白同化雄性類固醇類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)分析方法是采用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）方法分析尿樣， 選擇特定的特征離子進(jìn)行監(jiān)測。尿樣一般先經(jīng)酶解除去蛋白質(zhì)等生物大分子， 之后經(jīng)固相萃取或液-液萃取對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行初步的分離富集， 將得到的被分析物進(jìn)行三甲基硅烷化衍生后即可進(jìn)入毛細(xì)管氣相色譜分析， 常通過四極桿質(zhì)譜監(jiān)測特征離子。這類方法對(duì)絕大多數(shù)外源性雄性類固醇能夠獲得比較可靠的分析結(jié)果。

3 外源性類固醇的檢測進(jìn)展

對(duì)于判斷運(yùn)動(dòng)員是否使用了外源性類固醇激素， 需要檢測尿液中是否存在該物質(zhì)或其代謝物或標(biāo)記物即可。目前，在外源性類固醇的檢測方面，主要的研究進(jìn)展是使用高分辨靜電場軌道離子阱技術(shù)發(fā)現(xiàn)一些運(yùn)動(dòng)員經(jīng)常使用的類固醇類藥物的長效代謝物，使檢測窗口期延長，提高陽性檢出率。下面就里約奧運(yùn)會(huì)類固醇檢測技術(shù)以及近兩年在國內(nèi)外發(fā)表的類固醇檢測技術(shù)的期刊內(nèi)容進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

在Loanna Athanasiadou [1]研究表明，通過長效代謝物的發(fā)現(xiàn)，使得里約奧運(yùn)會(huì)類固醇檢測窗口期大大延長。如司坦唑醇通過檢測它在尿液中的代謝物17-表司坦唑醇-N-葡萄糖甙，使得該物質(zhì)檢測窗口期延長到停藥25 d左右；對(duì)于去氫氯甲睪酮，發(fā)現(xiàn)了它的代謝物去氫氯甲睪酮代謝物3，使得該物質(zhì)檢測窗口期延長到45 d左右；又如氧雄龍，它的原形在體內(nèi)僅能存留5 d左右時(shí)間，而氧雄龍代謝物1檢測窗口期延長到15 d，氧雄龍代謝物2檢測窗口期延長至約20 d。

“Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control”[2]一文中指出，24歲男性一次口服5 mg的氯美雄酮，留取服藥后8 d的尿液；49歲男性，一次口服20 mg的氯美雄酮，同樣留取服藥72 h后的尿液，在兩名志愿者留取的尿液中都發(fā)現(xiàn)了多種代謝物。

Georgina Balcells等[3]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測，進(jìn)行了單次口服甲睪酮（10 mg，3位志愿者）或司坦唑醇（6 mg，4位志愿者）的臨床實(shí)驗(yàn)，收集了受試前至受試后31 d的尿樣，分別在22 d和21 d的代謝實(shí)驗(yàn)的尿樣中檢出甲睪酮和司坦唑醇代謝物，說明這種檢測策略的有效性。

Jianghai Lu等[4]的研究表明，采用液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法檢測人體尿液中氯司替勃新型代謝物，文中指出，氯司替勃原形在尿液在3 d左右便不能檢測出來，而發(fā)現(xiàn)的氯司替勃代謝物s1檢測窗口期延長到停藥后25 d。

A. G. Fragkaki[10]的研究表明，實(shí)驗(yàn)中兩名高加索志愿者男性，分別口服25 mg美替諾龍乙酸酯，留取了用藥后632 h的尿液，并比較了液相色譜高分辨質(zhì)譜和氣相色譜高分辨質(zhì)譜檢測靈敏度的區(qū)別，第一名志愿者無論采用液相色譜高分辨質(zhì)譜還是氣相色譜高分辨質(zhì)譜，都能將檢測窗口延長到12 d左右。第二名志愿者檢測窗口期略短，約10 d左右。說明不同個(gè)體在服藥后代謝情況并不完全一致。

Thomas Piper等[11]的研究表明，39歲高加索男性，口服氘代諾龍40 d（溶于20 mL50%乙醇水中），采用氫同位素比質(zhì)譜和高分辨質(zhì)譜檢測諾龍長效代謝物，發(fā)現(xiàn)了它的新型代謝物。

4 內(nèi)源性類固醇的檢測

對(duì)于內(nèi)源性類固醇的檢測，目前主要結(jié)合使用類固醇生物護(hù)照模塊，對(duì)運(yùn)動(dòng)員尿液中的參數(shù)進(jìn)行長期縱向跟蹤，通過個(gè)人的數(shù)值建立參考范圍，如果出現(xiàn)異常來判斷陽性[1]。目前生物護(hù)照類固醇模塊尚未報(bào)告陽性，但是通過生物護(hù)照提供的線索，在使用同位素質(zhì)譜法確證陽性。類固醇生物護(hù)照的廣泛運(yùn)用為檢測內(nèi)源性蛋白同化雄性激素和一些經(jīng)修飾過且未囊括在世界反興奮劑禁用清單的新雄性激素提供了堅(jiān)實(shí)保證。

參考文獻(xiàn)

[1] Ioanna Athanasiadou， Sven Voss， Emmanouil Lyris， et al. Analytical progresses of the World Anti-Doping Agency Olympic laboratories： a 2016 update from London to Rio， Bioanalysis， 2016，8（21）：2265.

[2] G Balcells，C Gomez，L Garrostas，et al.Sulfate metabolites as alternative markers for the detection of 4-chlorometandienone misuse in doping control[M].Drug test anal，2016.

[3] Georgina Balcells， Oscar J. Pozo， Argitxu Esquivel， et al， Screening for anabolic steroids in sports： Analytical strategy based on the detection of phase I and phase II intact urinary metabolites by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A， 2015，1389：65.

[4] Jianghai Lu， María Fernández-？lvarez， Sheng Yang， Genye He， Youxuan Xu， R.Aguilera， New clostebol metabolites in human urine by liquid chromatography time-of-flight tandem mass spectrometry and their application for doping control[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015， 50（1）：191.

[5] A. G. Fragkaki， Y. S. Angelis， P. Kiousi， C. G. Georgakopoulos， E. Lyris， Comparison of sulfo-conjugated and gluco-conjugated urinary metabolites for detection of methenolone misuse in doping control by LC-HRMS， GC-MS and GC-HRMS[J].Journal of Mass Spectrometry， 2015，50（5）：740.

[6] Thomas Piper， Wilhelm Schnzer， Mario Thevis.Revisiting the metabolism of 19-nortestosterone using isotope ratio and high resolution/high accuracy mass spectrometry[J].The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology，2016，162：80.