DNA N⁶—甲基腺嘌呤（6mA）在真核生物中的研究進(jìn)展

李鋒

摘要 脊椎動物DNA上的甲基化修飾一直被認(rèn)為只發(fā)生在胞嘧啶（C）位點上，最近的研究發(fā)現(xiàn)腺嘌呤（A）位點的甲基化也是存在的，即DNA N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA）。這是一種在高等真核生物中剛開始被人們認(rèn)識的甲基化修飾堿基，它廣泛而保守地存在于生物體中，其修飾水平在整個生命周期中是動態(tài)變化的，且這種表觀遺傳修飾承擔(dān)著重要的生物學(xué)功能。主要對近年來6mA的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，探討其在進(jìn)化上的保守性，并進(jìn)一步探索6mA在真核生物中的生物學(xué)功能，討論參與6mA形成及消除的酶，評估目前常用的檢測6mA的幾種方法，最后對6mA的研究做出展望。

關(guān)鍵詞 N6-甲基腺嘌呤（6mA）；表觀遺傳學(xué)；生物學(xué)功能；甲基轉(zhuǎn)移酶；去甲基酶

Research Progress of DNA N6-methyladenine （6mA） in Eukaryotes

LI Feng

（College of Life Sciences， China West Normal University， Nanchong， Sichuan 637009）

Abstract Methylation at cytosine of DNA has long been considered as the only modified bases in vertebrate， until the methylation at adenine site was discovered in recent studies. 6mA is a newly studied base in higher eukaryotes， this modification is in a wide prevalence and conserved among eukaryotic species. The level of 6mA is dynamically changing and it plays important biological functions in the whole life cycle. This paper was mainly to review researches of 6mA in recent years， explore its conservatism in evolution and the biological function in eukaryotes， elucidate the mechanism of enzymes， then sum up the common used methods in recent studies of detecting 6mA. Finally， put forward the prospect of 6mA research in the future.

Key words N6-methyladenine；Epigenetics；Biological function；Methyltransferase；Demethylase

DNA作為生物體遺傳信息載體，肩負(fù)著將遺傳物質(zhì)忠實地在世代中進(jìn)行傳遞的使命。除了胞嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鳥嘌呤這4種主要堿基成分之外，近幾年有學(xué)者將5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5 mC）稱為第5種堿基，5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethyl cytosine，5 hmC）稱為第6種堿基。后來又相繼發(fā)現(xiàn)了第7、第8種DNA堿基：5-胞嘧啶甲酰（5-formylcytosine，5fC）和5-胞嘧啶羧基（5-carboxylcytosine，5caC）[1]，這4種被經(jīng)過修飾的堿基也被稱為“新四大堿基”。最新的研究成果表明，在腺嘌呤堿基第6位N原子上存在甲基化修飾——N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6mA），Holger等[2]提出這可能是第9種DNA堿基，它存在于藻類、線蟲、果蠅等真核生物中，可以幫助決定表觀基因組，因此N6-甲基腺嘌呤對于細(xì)胞生命至關(guān)重要。對6mA的發(fā)現(xiàn)稍晚于5mC，并且當(dāng)時認(rèn)為6mA只在原核生物中存在，因而不像5mC那樣受到重視。早在1978年就有研究人員在單細(xì)胞綠藻萊茵衣藻的DNA中發(fā)現(xiàn)了5mC和6mA修飾，但對其生物學(xué)功能并不清楚。近年來6mA在衣藻、線蟲、果蠅中相繼被發(fā)現(xiàn)[3-5]，后來又在非洲爪蟾、小鼠及人胚胎干細(xì)胞[1]以及最近研究報道的斑馬魚和豬[6]當(dāng)中發(fā)現(xiàn)了6mA的存在。由于這些標(biāo)記存在于DNA上，可以在DNA復(fù)制過程中發(fā)生傳遞，甚至可能一代代傳下去，因此推測這是一種具有重要生物學(xué)功能的堿基修飾。

為了更好地理解6mA這種甲基化修飾的動態(tài)調(diào)節(jié)，首先要明白其在進(jìn)化中的意義。筆者對6mA的研究進(jìn)行了綜述，討論了它的生物學(xué)意義，探討了甲基化、去甲基化酶對6mA動態(tài)變化的調(diào)節(jié)機(jī)制，最后總結(jié)了該領(lǐng)域比較重要的研究方法，并對未來的研究方向進(jìn)行展望。

1 N6-甲基腺嘌呤的發(fā)現(xiàn)

6mA在原核生物中是一種存在比較廣泛的修飾，它在調(diào)控DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)錄以及細(xì)胞防御中起著重要作用[7]。6mA最初發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌，隨后又在幾種細(xì)菌當(dāng)中證實了它的存在[8]。盡管Unger等[9]于1966年報道了牛和人類精細(xì)胞中存在6mA，但這一試驗結(jié)果不能重復(fù)，在其他后生動物中也沒有發(fā)現(xiàn)6mA[10]。由于檢測技術(shù)的局限以及共生體的混淆、技術(shù)的多變、組織特異性、發(fā)育階段特異性的變化以及環(huán)境因子對6mA的影響，因而最初在真核生物中報道其存在的可靠性受到質(zhì)疑，6mA只存在于原核生物中的觀點繼續(xù)盛行。后來通過斑點印跡雜交試驗在果蠅、牛的胸腺組織、人的胎盤中發(fā)現(xiàn)了6mA[11]。其他幾篇文章也有報道其在高等生物中被發(fā)現(xiàn)，但由于沒有足夠的證據(jù)，導(dǎo)致6mA在多細(xì)胞真核生物中的存在頗有爭議，因此6mA被認(rèn)為只存在于原核生物和單細(xì)胞真核生物當(dāng)中[12]。

直到最近隨著甲基化分析新技術(shù)的開發(fā)，更加靈敏的檢測手段不斷涌現(xiàn)，才檢測到6mA在多細(xì)胞真核生物如綠藻、線蟲、果蠅中的存在[3-5]。隨后又通過免疫熒光染色檢測到小鼠的心臟組織中有6mA[13]。Huang等[14]通過高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-ms/ms）在水稻、玉米、大鼠、人類細(xì)胞中檢測到6mA。Koziol等[1]通過結(jié)合斑點印跡雜交、HPLC、DNA甲基化免疫沉淀反應(yīng)以及免疫沉淀測序（MeDIPseq）等幾種方法，在非洲爪蟾和小鼠的腎臟組織中發(fā)現(xiàn)6mA修飾；同時Wu等[15]通過斑點印跡雜交、HPLC、MeDIPseq、SMRT-seq在小鼠胚胎干細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了6mA。芝加哥大學(xué)的研究人員在2016年發(fā)表的文章中指出，6mA在高等哺乳動物豬中也是存在的，且隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行其含量逐漸降低[6]。

2 N6-甲基腺嘌呤的生物學(xué)功能探索

6mA是一種非常保守的DNA修飾，科學(xué)家們推測其可能與5mC，mRNA水平的6mA修飾以及原核生物的6mA有著相似的調(diào)節(jié)機(jī)制。由于6mA對DNA結(jié)構(gòu)的影響及其在原核生物中的生物學(xué)功能研究得較為深入，而6mA在真核生物中是否也具有功能保守性還不知道，因此可以通過討論6mA在原核生物中的作用來推導(dǎo)其在真核生物中的作用。

2.1 腺嘌呤甲基化對DNA結(jié)構(gòu)的影響

腺嘌呤甲基化通過效應(yīng)蛋白來改變DNA結(jié)構(gòu)，6mA可能改變了DNA的二級結(jié)構(gòu)，通過改變配對堿基的穩(wěn)定性來影響DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的形成，含有GATC序列的6mA會使DNA解旋，而6mA會降低螺旋結(jié)構(gòu)的解鏈溫度，減緩螺旋結(jié)構(gòu)的形成[16]。

2.2 6mA在限制修飾系統(tǒng)中的作用

在原核生物中，DNA的6mA通常作為限制修飾系統(tǒng)的一部分識別外源DNA，細(xì)菌免疫系統(tǒng)通過噬菌體中的病原DNA被內(nèi)切酶識別，通過選擇性地切除特定限制性位點的未甲基化DNA來免受核酸限制內(nèi)切酶的消化[17]。

2.3 6mA參與DNA損傷的調(diào)控

早期的研究表明6mA可以降低DNA損傷，后來又證明了6mA能幫助識別突變體中的母鏈和子鏈。大腸桿菌和其他陰性革蘭氏菌中，DNA腺嘌呤甲基化在DNA錯配修復(fù)中有重要作用，這種鏈特異性修復(fù)途徑依賴于DNA復(fù)制后的瞬時半甲基化。當(dāng)DNA復(fù)制出錯導(dǎo)致堿基錯配時，DNA修復(fù)機(jī)制會利用腺嘌呤甲基化來識別模板中甲基化鏈和新合成的未甲基化子鏈[18]。

2.4 6mA對轉(zhuǎn)錄的影響

6mA甲基化在大麥的基因轉(zhuǎn)錄中增加了2～5倍，而5mC的CpG甲基化在大麥中對轉(zhuǎn)錄的影響很小[19]。衣藻、線蟲、果蠅中6mA是活躍轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的標(biāo)志，與5mC的位置及相關(guān)功能均有很大不同，6mA促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的啟動，而5mC對基因表達(dá)起抑制作用[20]。

2.5 6mA與核小體定位

在四膜蟲和衣藻中，6mA分布于核小體之間的連接區(qū)域[3]，這可能與指導(dǎo)核小體定位有關(guān)，或者6mA在連接區(qū)域的富集可能會使染色體開放區(qū)能更易接近甲基轉(zhuǎn)移酶，而線蟲里面的6mA富集并不在特定的基因組區(qū)域[4]。

2.6 6mA參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)

N6-腺嘌呤甲基化能標(biāo)記原核生物中DNA復(fù)制起始區(qū)域，還能改變大腸桿菌中細(xì)胞周期速率，當(dāng)DNA需要被復(fù)制時，復(fù)制起始位點oriC的腺嘌呤甲基化會降低Tm值，使得復(fù)制起始位點發(fā)生解鏈，6mA還會通過影響堿基配對來減緩DNA聚合酶I的催化速率[21]。

2.7 6mA修飾的繼代遺傳

回文區(qū)的DNA甲基化能以最簡潔的方式將表觀信息進(jìn)行跨代遺傳，由于DNA的半保留復(fù)制母鏈的甲基化能夠在新合成的子鏈中被復(fù)制。同位素標(biāo)記試驗證明大腸桿菌新合成的岡崎片段上N6-腺嘌呤會迅速被甲基化[22]，這與親代甲基化在DNA復(fù)制時傳遞到子代的觀點是相吻合的。在一些細(xì)菌中，DNA腺嘌呤甲基化與細(xì)胞分裂協(xié)同進(jìn)行，使得親代甲基化模式被遺傳下去。對果蠅卵巢[5]、斑馬魚及豬的卵母細(xì)胞和精細(xì)胞[6]的6mA檢測結(jié)果表明，早期胚胎尤其是生殖細(xì)胞中轉(zhuǎn)座子及附近的6mA處于較高水平，缺乏組蛋白去甲基酶的線蟲突變體spr-5后代不育，6mA水平在后代逐漸積累，這些研究成果進(jìn)一步拓寬了人們對6mA作為表觀遺傳修飾標(biāo)志的認(rèn)識。

3 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶

為了證明6mA發(fā)生了重要的生物學(xué)作用，應(yīng)弄清楚使6mA發(fā)生動態(tài)變化的酶是如何發(fā)揮作用的。通過觀察大多數(shù)生物（從細(xì)菌到人類）的N6-腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶中已知或假設(shè)的MT-A70家族發(fā)現(xiàn)，6mA在真核生物基因組中是廣泛存在并且有重要生物學(xué)作用的?；诩谆D(zhuǎn)移酶MT-A70家族的結(jié)構(gòu)同源性，多細(xì)胞生物的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可能起源于細(xì)菌的M.MunI-like 6mA 甲基轉(zhuǎn)移酶[23]。MT-A70家族包含RNA、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，如釀酒酵母中的IME4（inducer of meiosis 4）及Kar4（karyogamy 4）；線蟲中的DAMT-1（DNA methyltransferase-1）；人中的METTL（methyltransferaselike）家族成員METTL3（RNA甲基轉(zhuǎn)移酶）、METTL14，而METTL4作為人里面與DAMT-1同源性最高的甲基轉(zhuǎn)移酶，其功能還未得到證實[3]。盡管在某種條件下同一種酶能使RNA、DNA都發(fā)生甲基化，且MT-A70家族成員的底物特異性（針對RNA還是DNA，或兩者均可）還沒研究透徹，同一種酶是否催化不同生物的RNA、DNA甲基化還不得而知。

AlkB是一種在進(jìn)化上功能十分保守的去甲基酶，該家族的同源蛋白能催化多種生物的DNA及RNA去甲基化，如植物、大腸桿菌、線蟲、果蠅、人等。如在衣藻中發(fā)揮作用的TET/JBP，線蟲中的NMAD-1，果蠅中的DMAD，TET1-3作為TET蛋白家族一種保守的胞嘧啶去甲基酶，在人的甲基化腺嘌呤位點也可能發(fā)揮作用[2]。最近發(fā)表在《Cell》的2篇研究報道指出，線蟲和果蠅中的NMAD基因（Alkb基因家族）編碼了6mA去甲基酶，并驗證了其去甲基功能[3，5]。同時，在《Nature》雜志上報道了哺乳動物基因組中的Alkb1基因（Alkb基因家族）編碼了6mA去甲基酶，同樣驗證了其去甲基功能[20]。通過比對不同物種蛋白序列發(fā)現(xiàn)，Alkb1基因編碼的蛋白含一個高度保守的DSBH（double-stranded beta-helix）區(qū)域，屬于具有催化作用的2OG-Fe（Ⅱ）加氧酶家族，因此該結(jié)構(gòu)域很可能是高等真核生物6mA去甲基酶的候選基因。

4 N6-甲基腺嘌呤的檢測方法

通過紫外吸收光譜、電泳、紙層析等方法于1955年首次檢出了6mA[24]。但這些方法靈敏度相對較低，在哺乳動物中并沒有檢測到6mA，后來科學(xué)家們利用限制性酶來鑒定[25]，這種方法的不足之處在于檢測甲基化要依賴于酶對靶序列上未甲基化、半甲基化和全甲基化的特異性，因此并不是所有的基因組序列都能用限制性酶來處理。隨著技術(shù)的發(fā)展，檢測6mA的靈敏度和準(zhǔn)確度也越來越高。2015年在《Cell》上同時報道了不同方法檢測6mA在果蠅、衣藻、線蟲中的存在[3-5]。如利用高靈敏度的UHPLC-MRM-MS/MS方法檢測到果蠅的6mA水平（6mA/dA）為0.001%～0.070%。Fu等[3]結(jié)合幾種方法對衣藻全基因組DNA的6mA修飾進(jìn)行了檢測，如基于抗體的6mA免疫沉淀測序技術(shù)（6mA-IPseq），照片交聯(lián)與核酸外切酶消化結(jié)合的6mA-CLIP-exo技術(shù)，以及基于限制酶消化的6mA測序技術(shù)（6mA-REseq），他們成功地檢測到14 000個基因含有6mA修飾，占衣藻基因組的84%。而基于限制酶消化并結(jié)合二代測序的SMRTseq能高效、靈敏地檢測出單堿基分辨率的甲基化位點，利用這種方法成功地檢測到線蟲中6mA的含量為0.01%～0.40%。

雖然UHPLC-MRM-MS/MS是目前最高效、靈敏的手段，但這種方法不能體現(xiàn)出全基因組信息；而基于限制酶消化的測序方法即使能達(dá)到單堿基分辨率的效果，也不能檢測出限制性識別位點外的6mA修飾；盡管SMRTseq可以得到準(zhǔn)確的序列，檢測出單堿基分辨率上的差異，但這項技術(shù)很難辨別相似的修飾類型（1mA & 6mA）。而將UHPLC-MRM-MS/MS（能區(qū)分1mA和6mA）與SMRT-seq結(jié)合就能解決這一難題，可以準(zhǔn)確地鑒別出6mA在特定生物體中的豐度和基因組位置[4]。此外，甲基化殘基的定位還能通過限制酶的消化和q-PCR來鑒別，序列特異性探針也能選擇性地結(jié)合序列中的6mA或未甲基化的腺嘌呤[3]。為了更加準(zhǔn)確地鑒定像6mA這樣修飾水平很低的表觀修飾，必須結(jié)合幾種互補(bǔ)的方法。

5 展望

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，6mA在高等真核生物中不斷被發(fā)現(xiàn)，6mA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基酶的保守性以及6mA在幾種后生動物中的發(fā)現(xiàn)說明N6-腺嘌呤甲基化可能是一種比較保守的修飾。隨著6mA在整個生命中的進(jìn)化同時結(jié)合不斷改進(jìn)的檢測技術(shù)是至關(guān)重要的。對于已經(jīng)發(fā)現(xiàn)6mA修飾的真核動物來說，更重要的是探索6mA的生物學(xué)功能及其在不同發(fā)育時期、細(xì)胞類型中的基因組分布模式。另外一個重要問題是N6-腺嘌呤甲基化的DNA與甲基化的RNA是否一致。今后的研究應(yīng)該圍繞揭示生殖細(xì)胞中6mA不完全清除以及繼代遺傳開展。鑒于哺乳動物發(fā)育時期和細(xì)胞分化中5mC的動態(tài)變化性，未來可進(jìn)一步探究6mA在哺乳動物發(fā)育過程中的動態(tài)變化和潛在功能。后續(xù)的研究還將揭示調(diào)節(jié)6mA水平的環(huán)境因素以及后生動物中的修飾酶系統(tǒng)。結(jié)合檢測DNA中6mA的多種方法將能更全面、細(xì)致地了解不同物種6mA的存在、分布模式以及潛在的功能。

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