虎杖苷通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導(dǎo)人宮頸癌細胞凋亡的初步研究

潘紀紅+王海濱+杜曉飛+劉江月+張代娟

[摘要] 通過觀察虎杖苷對宮頸癌HeLa細胞體外生長的抑制作用，初步探討其誘導(dǎo)凋亡的可能機制。不同濃度的虎杖苷（50，100，150 μmol·L^-1）處理HeLa細胞后，采用MTT法檢測虎杖苷對HeLa細胞增殖的抑制作用，AO/EB染色法熒光顯微鏡觀察HeLa細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化；Annexin/PI雙標記法檢測HeLa細胞凋亡率；流式細胞儀分析HeLa細胞周期分布；RT-PCR和Western blot法檢測HeLa細胞中PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA和蛋白表達。結(jié)果顯示，虎杖苷顯著抑制HeLa細胞增殖，且具有一定劑量依賴性；虎杖苷能夠引起HeLa細胞發(fā)生S期阻滯，促進細胞凋亡，顯著下調(diào)HeLa細胞中PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA和蛋白表達。表明虎杖苷具有抑制宮頸癌HeLa細胞增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用，其機制可能與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路及其下游基因蛋白表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 虎杖苷； 宮頸癌； HeLa細胞； PI3K/AKT/mTOR信號通路； 凋亡

[Abstract] To observe the effect of polydatin on proliferation and apoptosis of cervical cancer HeLa cells and explore its possible mechanism. The growth inhibitory effect was detected with MTT assay. After HeLa cells were treated with different concentrations （50， 100， 150 μmol·L^-1） of polydatin， MTT assay was used to detect the inhibitory effect of polydatin on proliferation of HeLa cells； Acridine orange/ethidium bromide staining was used for morphological changes in apoptotic HeLa cells； Annexin/propidium iodide staining was applied to detect HeLa cell apoptotic rate. In addition， flow cytometry was employed to analyze apoptosis and cell cycle distribution； RT-PCR and Western blot assay were used to detect PI3K， AKT， mTOR， and P70S6K mRNA and protein expression levels. The results showed that polydatin significantly inhibited HeLa cells proliferation in a dose-dependent manner. Polydatin can cause S phase arrest for HeLa cells， promote cell apoptosis and decrease the mRNA and protein expression levels of PI3K， AKT， mTOR and P70S6K. It indicated that polydatin could inhibit proliferation and induce apoptosis of cervical cancer HeLa cells， and the mechanism may be associated with inhibiting the PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and suppressing downstream gene expression.

[Key words] polydatin； cervical cancer； HeLa cell； PI3K/AKT/mTOR signaling pathway； apoptosis

宮頸癌是我國婦科最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅廣大婦女的生命健康。近年來發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且發(fā)病年齡不斷年輕化。近年來對化療在宮頸癌治療中的應(yīng)用進行了大量的研究，并取得了良好的效果[1]。常用的順鉑、五氟尿嘧啶等化療藥物費用昂貴，且毒性作用嚴重。因此，尋找高效低毒的化療藥物至關(guān)重要。目前，從傳統(tǒng)中藥等植物提取物中尋找毒性低、療效高的抗癌活性成分并探討其作用機制，已成為當今腫瘤治療研究領(lǐng)域的熱點?；⒄溶帐菑幕⒄鹊母稍锔o中提取的單體，以往研究表明其在抗炎[2]、抗過敏[3]、改善微循環(huán)[4]等方面有顯著作用，近年來有研究報道虎杖苷具有抗腫瘤作用，可以抑制鼻咽癌、肺癌、結(jié)腸癌細胞的增殖、分化[5-7]。然而其對宮頸癌細胞是否具有抑制作用，國內(nèi)外未見相關(guān)報道。Rashmi和Husseinzadeh等[8-9]研究證實PI3K/AKT/mTOR信號通路在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展過程中起到了重要的促進作用。本研究以宮頸癌HeLa 細胞為研究對象，觀察虎杖苷對宮頸癌細胞的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用效果，并對其抗宮頸癌機制進行了初步研究。

1 材料

1.1 藥品與儀器 虎杖苷（上海喬羽生物科技有限公司）。RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清（美國Gibco）；細胞裂解液（武漢博士德生物工程有限公司）；MTT（美國Sigma公司）；吖啶橙/溴化乙錠雙熒光凋亡染色試劑盒（上海銘博生物科技有限公司）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海前塵生物科技有限公司）；兔抗人PI3K，AKT，P-AKT，P70S6K，鼠抗人mTOR（CST，美國）；FC-500流式細胞儀（美國Beckma公司）；轉(zhuǎn)膜儀、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad司）。

1.2 細胞株 宮頸癌HeLa細胞株由濰坊醫(yī)學(xué)院實驗中心提供。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 以RPMI1640為細胞培養(yǎng)液（內(nèi)含10%胎牛血清、l00 U·mL^-1青霉素和0.1 g·L^-1鏈霉素），在37 ℃，飽和濕度和5%CO₂的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HeLa細胞。

2.2 MTT法細胞增殖抑制實驗 取對數(shù)生長期的HeLa細胞處理后接種于96孔板，隨機分為空白對照組（A組）、陰性對照組（B組）、虎杖苷低劑量組（C組，50 μmol·L^-1）、中劑量組（D組，100 μmol·L^-1）、高劑量組（E組，150 μmol·L^-1）。C，D，E組加入不同濃度虎杖苷10 μL，B組加入等體積DMSO孵育24 h后，各組加入MTT（0.5%），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清液，加入150 μL DMSO，用酶標儀490 nm測定A。抑制率=[（A陰性對照孔-A實驗孔）/（A陰性對照孔-A空白對照孔）]×100%。

2.3 AO/EB雙熒光染色法檢測細胞凋亡形態(tài)學(xué)改變 按常規(guī)制備細胞爬片，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分組同MTT實驗，24 h后按試劑盒說明書操作，熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 取對數(shù)生長期細胞處理后接種于6孔板，分組處理同MTT實驗，48 h后，制成單細胞懸液。按照試劑盒說明進行操作，用FACScan進行FCM定量檢測。

2.5 流式細胞儀分析細胞周期 取對數(shù)生長期HeLa細胞，分組處理同MTT實驗，調(diào)整細胞濃度1×10⁶⁰個/mL，用1 mL PBS 重懸，滴加到4 mL預(yù)冷70%乙醇中，4 ℃過夜固定，離心棄上清，PBS洗3次，加入500 μL RNaseA/PI（50 mg·L^-1），室溫避光30 min，上流式細胞儀分析。

2.6 RT-PCR檢測PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達 取對數(shù)生長期HeLa細胞，分組處理同MTT實驗，提取總RNA后合成cDNA，引物序列PI3K：上游5′-CTGTCAATCGGTGACTGTGTGG-3′，下游5′-AAACAGGTCAATGGCTGCATCATA-3′；AKT：上游5′-CTTGCTTTCAGGGCTGCTCA-3′，下游5′-TACAGGTGCTGCGACACGATAC-3′；mTOR：上游5′-AGAAACTGCACGTCAGCACCA-3′，下游5′-CCATTCCAGCCAGTCATCTTTG-3′； P70S6K：上游5′-CTCAGTGAAAGTGGCAATCAGGTC-3′，下游5′-GCTGCCAATAAATCTTCGAGGTG-3′。GAPDH為內(nèi)參，進行定量PCR擴增。

2.7 Western blot法檢測PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的蛋白表達 取對數(shù)生長期HeLa細胞，分組處理同MTT實驗，提取總蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后加一抗（1∶500）4 ℃過夜，TBST洗膜3次后二抗（1∶2 000）孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，暗室曝光顯影，圖像分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料以±s表示，采用單因素方差分析，組間比較用SNK-q檢驗，采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 虎杖苷對HeLa細胞增殖的抑制作用 與A組比較，B組細胞的增殖無明顯變化；虎杖苷低、中、高劑量各組細胞的增殖明顯受抑制（P<0.05），與虎杖苷中劑量組比較，低劑量組的細胞增殖抑制作用明顯減弱（P<0.05），高劑量組的細胞增殖抑制作用明顯增強（P<0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明虎杖苷對HeLa細胞增殖呈明顯劑量依賴性抑制作用（圖1）。

3.2 虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 A組、B組細胞均呈圓形，大小一致，核質(zhì)體染成均勻綠色，隨著虎杖苷濃度增加，HeLa細胞凋亡數(shù)量和結(jié)構(gòu)均發(fā)生明顯改變。C組出現(xiàn)少量核固縮，D組細胞形態(tài)不規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮呈斑塊狀，核固縮，細胞呈新月形等，E組細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，凋亡細胞明顯增多，染色質(zhì)濃縮，細胞核碎裂呈點狀或分葉狀，細胞膜完整和膜泡狀突起等典型的凋亡形態(tài)細胞（圖2）。說明虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡呈明顯劑量依賴性。

3.3 虎杖苷對HeLa細胞凋亡率和細胞周期的影響 虎杖苷可促進宮頸癌HeLa細胞凋亡，隨著虎杖苷劑量的增大，HeLa細胞凋亡率顯著增加，各組間差異有顯著性（P<0.05），虎杖苷誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡呈明顯劑量依賴性。細胞周期檢測結(jié)果顯示，A，B組細胞周期無明顯變化；虎杖苷低、中、高劑量組細胞均出現(xiàn)G₀/G1期細胞的百分比逐漸降低而S期細胞的百分比逐漸增加，呈現(xiàn)S期阻滯作用（P<0.05），與虎杖苷中劑量組比較，低劑量組的S期阻滯作用明顯減弱（P<0.05），高劑量組的S期阻滯作用明顯增強（P<0.05），說明虎杖苷對HeLa細胞S期阻滯作用呈明顯劑量依賴性（表1）。

3.4 虎杖苷對HeLa細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達的影響 與A組比較，B組細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達無明顯變化；虎杖苷低劑量、中劑量、高劑量各組細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達水平明顯降低（P<0.05），不同劑量間PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達有明顯差異（P<0.05），說明虎杖苷降低HeLa細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的mRNA表達呈明顯劑量依賴性（圖3）。

3.5 虎杖苷對HeLa細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K的蛋白表達的影響 與A組比較，B組細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達無明顯變化；虎杖苷低劑量、中劑量、高劑量各組細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達水平明顯降低（P<0.05），不同劑量間PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達有明顯差異（P<0.05），說明虎杖苷降低HeLa細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K蛋白表達呈明顯劑量依賴性（圖4）。

4 討論

虎杖苷是植物虎杖中提取的一種天然活性成分，屬于芪類化合物，在植物中分布廣泛且含量高?？扇苡跓崴⒁掖?、乙酸乙酷、丙酮，具有多種藥理學(xué)作用。研究表明[10-12]虎杖苷能夠顯著保護心肌細胞、血管平滑肌細胞，具有抗血小板聚集及改善微循環(huán)等作用，此外，虎杖苷還具有抗氧化、保護肝細胞等作用。虎杖苷能夠顯著抑制乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌等多種癌細胞生長[13-14]。本研究首先采用MTT法檢測不同劑量虎杖苷對宮頸癌HeLa細胞增殖的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)虎杖苷能夠有效抑制HeLa細胞增殖，這種抑制作用呈劑量依賴性。

研究發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制之一。細胞周期是高度有組織的時序調(diào)控過程，受到DNA損傷檢控點、DNA復(fù)制檢控點和紡錘體檢控點等細胞周期檢控點的精確調(diào)控。在嚴重的DNA損傷狀態(tài)下，細胞周期阻滯可導(dǎo)致細胞凋亡。腫瘤細胞的細胞周期調(diào)控紊亂是腫瘤的特征之一，調(diào)控細胞周期進程是控制腫瘤細胞生長的一個有效的方法[15-16]。本研究采用流式細胞術(shù)檢測了不同劑量虎杖苷干預(yù)HeLa細胞的細胞周期變化，結(jié)果顯示虎杖苷可引起HeLa細胞發(fā)生S期阻滯，阻斷HeLa細胞由S期向G₂/M期的進程，阻滯細胞的有絲分裂，促使細胞調(diào)亡。

凋亡是多細胞生物體的程序性死亡，在機體穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起重要作用，凋亡的調(diào)控失衡是多種疾病如神經(jīng)退行性病變、惡性腫瘤的重要發(fā)病機制。誘導(dǎo)凋亡是抗腫瘤藥物的主要作用機制之一，因此，誘導(dǎo)凋亡可作為篩選新的抗腫瘤藥的一個指標及評價抗腫瘤藥物臨床效力一種方法。本研究通過TUNEL實驗觀察不同劑量虎杖苷干預(yù)HeLa細胞后，HeLa細胞的凋亡情況，研究結(jié)果顯示不同劑量虎杖苷均可誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡，且凋亡率隨著虎杖苷干預(yù)濃度的增加而增高，呈現(xiàn)明顯劑量依賴性，表明誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡是虎杖苷發(fā)揮抗宮頸癌作用的機制之一。PI3K/AKT/mTOR信號通路被認為是癌細胞存活的首要通路，有“抗細胞調(diào)亡途徑”之稱。AKT處于該信號通路的核心位置，活化的AKT通過啟動下游底物發(fā)揮促細胞增殖、抑制細胞調(diào)亡、調(diào)控細胞周期、促進血管生成及化療耐藥等效應(yīng)，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17-19]。mTOR是PI3K-AKT的下游靶點，主要通過PI3K-AKT途徑被激活?；罨腁KT激活mTOR后，通過活化其下游蛋白P70S6K，促進肌動蛋白的細絲重構(gòu)，進而實現(xiàn)腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT/mTOR信號通路中的關(guān)鍵因子mTOR與其下游蛋白P70S6K在宮頸癌中表達均顯著增加[20]。 本研究RT-PCR和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖苷呈現(xiàn)明顯劑量依賴性抑制HeLa細胞PI3K，AKT，mTOR，P70S6K mRNA和蛋白表達水平，劑量越大其mRNA和蛋白表達量越低。因此，推測虎杖苷抑制HeLa細胞生長和促進細胞調(diào)亡，其重要的分子作用機制可能在于虎杖苷可通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的關(guān)鍵節(jié)點蛋白AKT的表達，繼而影響其下游靶基因mTOR和P70S6K的表達水平，從而抑制宮頸癌HeLa細胞的生長。

綜上所述，虎杖苷能有效抑制宮頸癌HeLa細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，將細胞阻滯在S期，其機制可能是與抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路及其下游基因蛋白表達有關(guān)。

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[責任編輯 張寧寧]