4′—去甲基表鬼臼毒素的酶法糖基化

解可波+陳日道+張玉嬌+陳大偉+戴均貴

[摘要] 4′-去甲基表鬼臼毒素（4′-demethylepipodophyllotoxin，DMEP）的糖苷衍生物具有多種藥理活性，但其化學合成面臨位置及立體選擇性和基團的保護與脫保護等諸多挑戰(zhàn)。該研究從庫拉索蘆薈Aloe barbadensis中克隆得到1個新穎糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferase， GT）基因AbGT5，并成功進行了外源表達及蛋白純化。重組AbGT5能夠催化4′-去甲基表鬼臼毒素進行糖基化，獲得的產(chǎn)物經(jīng)MS，¹H-NMR，¹³C-NMR，HSQC以及HMBC等波譜技術(shù)鑒定為4′-去甲基表鬼臼毒素-4′-O-β-D-葡萄糖苷。酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)AbGT5的最適反應(yīng)溫度為20 ℃，最適pH 9.0，且不依賴金屬離子。在最適反應(yīng)條件下，4′-去甲基表鬼臼毒素的轉(zhuǎn)化率可達80%。該研究表明利用新穎糖基轉(zhuǎn)移酶AbGT5可實現(xiàn)4′-去甲基表鬼臼毒素的高效酶法糖基化，為其糖基化提供新方法。

[關(guān)鍵詞] 糖基轉(zhuǎn)移酶； 酶法糖基化； 工具酶； 4′-去甲基表鬼臼毒素； 庫拉索蘆薈

[Abstract] The glycosides of 4′-demethylepipodophyllotoxin （DMEP） possess various pharmacological activities； however， the chemical synthesis of these glycosides faces challenges in regioselectivity， stereoselectivity， and the protection and de-protection of functional groups. In this work， a novel glycosyltransferase （GT） gene AbGT5 from Aloe barbadensis was successfully cloned， heterogeneously expressed and purified. Recombinant AbGT5 was able to catalyze the glycosylation of DMEP and the glycosylated product， which was separated from the preparative scale reaction， was characterized as DMEP 4′-O-β-D-glucoside via MS， ¹H-NMR， ¹³C-NMR， HSQC and HMBC. According to the investigations of enzyme properties， AbGT5 show the highest activity around 20 ℃ in the buffer of pH 9.0， and it was independent of divalent metal ions. Under the optimum conditions， the conversion rate of DMEP can reach 80%. Above all， in this work the enzymatic glycosylation of DMEP was achieved with high efficiency by the novel GT AbGT5.

[Key words] glycosyltransferase； enzymatic glycosylation； tool enzyme； 4′-demethylepipodophyllotoxin； Aloe barbadensis

鬼臼毒素（podophyllotoxin）是來源于桃兒七屬Sinopodophyllum、鬼臼屬Dysosma及山荷葉屬Diphylleia等小檗科植物的木脂素類活性天然產(chǎn)物，具有抗病毒、抗腫瘤等活性[1]。由于鬼臼毒素的毒副作用較大，不適于直接在臨床上使用，因此，自20世紀50年代開始，醫(yī)藥領(lǐng)域的科研工作者等從鬼臼毒素出發(fā)，利用化學法進行結(jié)構(gòu)修飾，獲得了一系列毒副作用降低、水溶性及生物利用度等得到改善的衍生物[2]。其中4′-去甲基表鬼臼毒素（4′-demethylepipodophyllotoxin，DMEP）是由鬼臼毒素經(jīng)化學半合成得到的，其糖苷類衍生物依托泊苷（etoposide，VP-16）和替尼泊苷（teniposide，VM-26）能夠抑制微管蛋白的聚合作用、阻斷細胞的有絲分裂和抑制DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的活性，是目前臨床治療淋巴癌、白血病及小細胞肺癌等腫瘤疾病的主要藥物[3-5]。另外，從植物中也分離得到了多種天然鬼臼毒素糖苷類衍生物，并具有良好的抗腫瘤藥理活性[6-7]，但這些糖苷類衍生物仍然存在水溶性差、抗癌譜窄、易產(chǎn)生耐藥性以及毒副作用大等問題，限制了其臨床應(yīng)用[8]。因此，為開發(fā)新型DMEP糖苷類藥物，尋找更為有效且毒性小的抗腫瘤新藥，藥物化學家通過化學法對DMEP進行了大量并富有成效的糖基化修飾，但無一不涉及位置及立體選擇性、基團的保護與脫保護等[9-10]，大大限制了多樣化DMEP糖苷類衍生物的研究與開發(fā)。

糖基轉(zhuǎn)移酶（glycosyltransferases，GTs）是廣泛存在于生物體中的一大類酶，能夠催化NDP（nucleoside diphosphate，核苷二磷酸）活化的糖基轉(zhuǎn)移到苷元受體上形成糖苷。糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基化反應(yīng)具有高度的位置及立體選擇性和反應(yīng)條件溫和等特點，為DMEP糖苷類衍生物的酶法合成提供了一種有效策略[11-17]。DMEP具有2個O-糖基化位點即4-OH和4′-OH，催化4-OH進行糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶已有報道[18]，而催化4′-OH進行糖基化修飾的酶尚未見報道。中藥植物庫拉索蘆薈Aloe barbadensis中含有多種結(jié)構(gòu)類型的糖苷類化合物[19]，預(yù)示著新穎糖基轉(zhuǎn)移酶的存在。因此，為尋找新穎糖基轉(zhuǎn)移酶對DMEP的4′-OH進行糖基化修飾，本研究從庫拉索蘆薈中挖掘得到5個糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AbGT1～AbGT5）并進行了外源表達及酶活性篩選，其中AbGT5能夠高效催化DMEP的4′-OH進行糖基化生成DMEP 4′-O-β-D-glucoside，為DMEP糖基化提供了新方法，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 植物 庫拉索蘆薈A. barbadensis由中央民族大學生命與環(huán)境科學學院楊林副教授鑒定。

1.2 菌株 實驗使用Escherichia coli Trans1-T1克隆宿主與E. coli Transetta （DE3）表達宿主購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與試劑 Agilent 1200高效液相色譜儀購自美國安捷倫科技有限公司；LCQ Fleet離子阱質(zhì)譜儀購自美國熱電公司；核磁共振波譜儀型號為Mercury-400及VNS-600（Varian，USA）；分析色譜柱為Shiseido capcellpak C₁₈ MG III column （4.6 mm×250 mm，5 μm，Shiseido Co.，Ltd.，Japan）；半制備色譜柱為YMC-pack ODS-A column（4.6 mm×250 mm，5 μm，YMC，Japan）。RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自江蘇康為世紀生物科技有限公司；TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；E-fusion cloning kit購自淮安百慧生物科技有限公司；pET28a表達載體為Novagen公司產(chǎn)品；內(nèi)切酶購自寶生物（大連）有限公司；鎳柱親和色譜填料（Ni SepharoseTM 6 Fast Flow）為美國GE公司產(chǎn)品；4′-去甲基表鬼臼毒素（1）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDP-Glc）購自Sigma-Aldrich公司。

2 方法

2.1 庫拉索蘆薈葉片RNA的提取及cDNA合成 取生長狀態(tài)良好的庫拉索蘆薈的新鮮嫩葉進行液氮速凍，葉片組織充分研磨成粉后，按照植物總RNA提取試劑盒說明書提取RNA。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外-可見光光度計測定其濃度和純度，其在260，280 nm處的吸光度，A₂₆₀/A₂₈₀均大于1.8小于2.1，說明提取的RNA無蛋白與DNA污染。將檢測合格的RNA用于逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cNDA，用作本研究后續(xù)糖基轉(zhuǎn)移酶候選基因克隆的模板。

2.2 庫拉索蘆薈中糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆 根據(jù)庫拉索蘆薈轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果，選取具有完整ORF（open reading frame，開放閱讀框）的候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AbGT1～AbGT5），設(shè)計帶有pET28a插入位點兩端各17～18 bp同源臂的PCR引物（表1）。以cDNA為模板擴增蘆薈糖基轉(zhuǎn)移酶基因全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用于后續(xù)外源表達系統(tǒng)的構(gòu)建。

2.3 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的外源表達與活性篩選 按照E-fusion cloning kit說明書，將候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因（AbGT1～AbGT5）插入表達載體pET28a構(gòu)建重組質(zhì)粒，且重組糖基轉(zhuǎn)移酶帶有His6標簽，以利于后續(xù)蛋白純化。將重組質(zhì)粒pET28a-AbGTs導(dǎo)入克隆宿主Trans1-T1，挑取轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，陽性轉(zhuǎn)化子進一步測序驗證。從測序正確的轉(zhuǎn)化子中提取重組質(zhì)粒導(dǎo)入表達宿主Transetta，構(gòu)建AbGTs的外源表達系統(tǒng)。同時將空質(zhì)粒pET28a導(dǎo)入Transetta用于對照實驗。在37 ℃條件下，200 r·min^-1搖床過夜培養(yǎng)含pET28a-AbGTs及pET28a空質(zhì)粒的重組

Transetta菌株作為種子液。按照1%的接種量將種子液接種至100 mL的LB培養(yǎng)基中（含50 mg·L^-1卡那霉素及34 mg·L^-1氯霉素），培養(yǎng)至A600 nm=0.6，隨后加入終濃度為0.5 mmol·L^-1的IPTG（isopropyl β-D-thiogalactoside，異丙基硫代半乳糖），在16 ℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。隨后以8 000×g離心收集菌體，并用10 mL的Reaction Buffer（pH 7.4，50 mmol·L^-1Tris-HCl，50 mmol·L^-1NaCl，1 mmol·L^-1PMSF）重懸菌體。將菌體重懸液在冰浴中超聲破碎10 min（工作5 s，暫停5s，功率30 W），12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶液，用于后續(xù)糖基化活性篩選實驗。對照組粗酶液由含pET28a空質(zhì)粒的Transetta重組菌制備。

糖基轉(zhuǎn)移酶活性篩選反應(yīng)體系為200 μL，包括197 μL粗酶液、1 μL 50 mmol·L^-1的DMEP（1）以及2 μL 50 mmol·L^-1的UDP-Glc。30 ℃水浴反應(yīng)12 h后，加入400 μL冰甲醇，旋渦振蕩，終止反應(yīng)。15 000×g離心30 min后，取上清液進行HPLC-UV-MS分析，進行糖基化活性篩選。

2.4 糖基轉(zhuǎn)移酶AbGT5的純化及酶學性質(zhì)研究 將誘導(dǎo)表達后的重組菌Transetta（pET28a-AbGT5）用Binding Buffer（pH 7.4，20 mmol·L^-1Na₂HPO₃-NaH₂PO₃，0.5 mol·L^-1NaCl，20 mmol·L^-1咪唑）重懸，并超聲破碎、離心制備粗酶液。將粗酶液上樣于柱體積為5 mL的鎳柱進行親和層析純化，分別用含不同濃度咪唑的Elution Buffer（pH 7.4，20 mmol·L^-1Na₂HPO₃-NaH₂PO₃，0.5 mol·L^-1NaCl，50，100，150，250，500 mmol·L^-1咪唑）洗脫。隨后分別將蛋白流份超濾脫鹽，并進行SDS-PAGE（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳）檢測，以獲得AbGT5純酶。

為優(yōu)化AbGT5催化DMEP糖基化的反應(yīng)條件，分別考察了溫度、緩沖液pH及二價金屬離子等因素對酶催化活性的影響。酶促反應(yīng)體系為200 μL，包含1 μL 50 mmol·L^-1的DMEP（1），2 μL 50 mmol·L^-1的UDP-Glc，20 μL 2 g·L^-1的AbGT5純酶，Reaction Buffer補齊至200 μL，分別在4，16，20，25，30，35，40，45，50 ℃水浴下反應(yīng)30 min以考察溫度對酶催化活性的影響。同樣在20 ℃條件下，分別測定了以pH 4.0，5.0，6.0的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液、pH 6.0，7.0，8.0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液、pH 8.0，9.0的Tris-HCl緩沖液以及pH 9.0，10.0，11.0的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液作為Reaction Buffer時，AbGT5的催化活性。隨后在20 ℃及pH 9.0的Tris-HCl條件下，考察了不同二價金屬陽離子（BaCl₂，CaCl₂，CoCl₂，CuCl₂，F(xiàn)eCl₂，MgCl₂，MnCl₂，NiCl₂，ZnCl₂，終濃度為5 mmol·L^-1）及金屬離子絡(luò)合劑（EDTA，終濃度為5 mmol·L^-1）對酶活性的影響。以上酶促反應(yīng)實驗均進行3組平行以保證數(shù)據(jù)的準確性。

2.5 酶法糖基化產(chǎn)物的制備及結(jié)構(gòu)鑒定 利用AbGT5酶法糖基化DMEP（1）制備DMEP 4′-O-β-D-glucoside（1a）的反應(yīng)體系包含1 mmol·L^-1的DMEP（1），2 mmol·L^-1的UDP-Glc，5 mmol·L^-1的MgCl₂，1 mmol·L^-1的AbGT5純酶，終質(zhì)量濃度分別為1，2，5，1 mg·L^-1。酶促反應(yīng)在pH 9.0的Tris-HCl緩沖液中進行，反應(yīng)液總體積為20 mL。20 ℃水浴振蕩反應(yīng)24 h后，用40 mL的乙酸乙酯萃取5次，有機相減壓蒸干后用1～2 mL甲醇溶解，利用反相半制備HPLC分離制備酶促反應(yīng)產(chǎn)物。將分離獲得的產(chǎn)物進行HR-ESI-MS，¹H-NMR，¹³C-NMR，HSQC以及HMBC等譜學測定分析以對其結(jié)構(gòu)進行鑒定。

3 結(jié)果與分析

3.1 庫拉索蘆薈糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆 通過對庫拉索蘆薈轉(zhuǎn)錄組序列的分析，發(fā)現(xiàn)5個功能注釋為糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA序列具有完整的ORF，分別命名為AbGT1～AbGT5。AbGT1長度為1 413 bp，編碼470個氨基酸；AbGT2長度為1 401 bp，編碼466個氨基酸；AbGT3長度為1 443 bp，編碼480個氨基酸；AbGT4長度為1 431 bp，編碼476個氨基酸；AbGT5長度為1 419 bp，編碼472個氨基酸。以RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA作為模板，AbGTs-F與AbGTs-R作為引物（表1），PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測與預(yù)測ORF條帶大小一致（圖1）。

3.2 糖基轉(zhuǎn)移酶基因的外源表達與活性篩選 基因AbGT1～AbGT5連接pET28a后進行測序驗證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組中的ORF序列信息一致，且候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因正確插入到pET28中。隨后將驗證正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到表達宿主Transetta，經(jīng)菌落PCR驗證，成功構(gòu)建了候選糖基轉(zhuǎn)移酶基因的外源表達體系。

重組糖基轉(zhuǎn)移酶經(jīng)誘導(dǎo)表達后，利用HPLC-UV-MS進行糖基化反應(yīng)活性初篩。對照組及AbGT1～AbGT3均未檢測到糖基化產(chǎn)物的生成，而AbGT4與AbGT5在18.2 min出現(xiàn)1個產(chǎn)物峰，轉(zhuǎn)化率分別為17%和70%（圖2）。質(zhì)譜檢測顯示該產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量為562，與底物DMEP（1）相比，相對分子質(zhì)量增加162，推測產(chǎn)物峰為DMEP（1）的單糖基化產(chǎn)物。因此，選擇具有高催化效率的AbGT5對其進行蛋白純化以及后續(xù)DMEP（1）的酶法糖基化實驗。

3.3 糖基轉(zhuǎn)移酶AbGT5的純化及酶學性質(zhì)研究 經(jīng)SDS-PAGE檢測，AbGT5主要分布在咪唑濃度為150 mmol·L^-1的洗脫液中，純度達到90%以上（圖3）。經(jīng)超濾脫鹽，獲得7 mL純酶，質(zhì)量濃度為2 g·L^-1。

通過在不同溫度下測定AbGT5的催化活力，發(fā)現(xiàn)在4～20 ℃，AbGT5的活性隨溫度升高而逐漸升高；而在20～50 ℃，AbGT5的活性隨溫度升高而降低。因此，重組AbGT5催化DMEP（1）糖基化的最適溫度在20 ℃附近（圖4）。

通過在不同pH緩沖體系中測定酶的催化活力，發(fā)現(xiàn)在pH 5.0～9.0，AbGT5的催化活力隨著pH的升高而逐漸升高；而在pH 9.0以后，酶活力迅速下降。因此，重組AbGT5的最適pH 9.0左右（圖5）。

同時還考察了不同金屬離子對重組AbGT5活性的影響。在含有金屬離子絡(luò)合劑EDTA時，AbGT5仍具有催化活力，說明AbGT5催化功能的發(fā)揮不依賴于金屬離子。但Mg²⁺和Mn²⁺等能夠提高AbGT5的催化活力，相反Cu²⁺能夠極大的抑制酶的活性，Zn²⁺甚至能夠使酶完全失去活性（圖6）。

3.4 酶法糖基化產(chǎn)物的制備及結(jié)構(gòu)鑒定 在20 ℃條件下及pH 9.0的Tris-HCl緩沖液（含5 mmol·L^-1MgCl₂）中，純酶AbGT5酶法糖基化DMEP（1）的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率可達80%。經(jīng)HPLC反向半制備分離純化獲得8.9 mg產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)HR-ESI-MS，¹H-NMR，¹³C-NMR，HMBC及HSQC等手段鑒定結(jié)構(gòu)為4′-demethylepipodophyllotoxin 4′-O-β-D-glucoside（1a）。質(zhì)譜及核磁數(shù)據(jù)：HR-ESI-MS m/z 585.155 8 [M+Na]⁺，計算值 C₂₇H₃₀O₁₃Na； ¹H-NMR（methanol-d4，400 MHz） δ： 6.93（1H，s，H-5），6.48（1H，s，H-8），6.37（2H，s，H-2′，H-6′），5.95（2H，s，H-13），4.90（1H，overlapped，H-4），4.80（1H，d，J=7.2 Hz，Glc-H1），4.61（1H，d，J=5.2 Hz，H-1），4.35（2H，m，H-11），3.72（6H，s，H-3′，5′-OCH₃），3.75～3.30（6H，m，Glc-H），3.34（1H，m，H-2），2.85（1H，m，H-3）； ¹³C-NMR（methanol-d4，150 MHz） δ： 176.2（C-12），152.1（C-3′），152.1（C-5′），148.2（C-7），147.3（C-6），136.7（C-10），134.0（C-4′），132.6（C-1′），131.5（C-9），109.4（C-5），109.3（C-8），108.6（C-2′），108.6（C-6′），104.0（Glc-1），101.4（C-13），76.8（Glc-5），76.4（Glc-3），74.3（Glc-2），69.9（Glc-4），68.0（C-11），65.7（C-4），61.2（Glc-6），55.6（-OCH₃），55.6（-OCH₃），43.7（C-1），40.3 （C-2），38.8 （C-3）。

4 討論

隨著越來越多的糖基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)，酶法糖基化越來越受到關(guān)注。相比化學法，酶法具有反應(yīng)條件溫和、位置及立體選擇性強以及催化效率高效等特點。目前已發(fā)現(xiàn)的一些糖基轉(zhuǎn)移酶具有很強的底物雜泛性，不僅能夠識別多種結(jié)構(gòu)不同的天然以及非天然產(chǎn)物，還能夠?qū)⒏鞣N類型的糖基引入到這些苷元上，形成多樣化的糖苷類產(chǎn)物[11-18]，這為活性糖苷類化合物的合成提供了一種有效策略。本研究中從庫拉索蘆薈中挖掘到1個新穎糖基轉(zhuǎn)移酶AbGT5（GenBank accession number KY662485），可作為工具酶以UDP-Glc為糖基供體高效催化DMEP的4′-OH進行糖基化反應(yīng)，生成DMEP 4′-O-β-D-glucoside。AbGT5的發(fā)現(xiàn)為大量制備DMEP糖苷從而進行體內(nèi)及體外藥理活性的研究奠定了基礎(chǔ)。不僅如此，未來對AbGT5受體底物譜的研究，可發(fā)掘該酶對于DMEP結(jié)構(gòu)類似物的糖基化潛力；同時對糖基供體雜泛性的研究，嘗試將不同結(jié)構(gòu)類型的糖基引入DMEP的羥基，可酶法合成更加多樣化的糖苷衍生物。這不僅能夠增加鬼臼毒素類糖苷衍生物的結(jié)構(gòu)多樣性，更可為藥物先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。隨著酶法糖基化研究的深入，糖基轉(zhuǎn)移酶作為工具酶在鬼臼毒素類糖基衍生化的研究中將扮演越來越重要的角色。

[參考文獻]

[1] Gordaliza M， García P A， Del Corral J M M， et al. Podophyllotoxin： distribution， sources， applications and new cytotoxic derivatives [J]. Toxicon， 2004， 44（4）： 441.

[2] Yousefzadi M， Sharifi M， Behmanesh M， et al. Podophyllotoxin： current approaches to its biotechnological production and future challenges [J]. Eng Life Sci， 2010， 10（4）： 281.

[3] Atta-Ur-Rahman， Iqbal Choudhary M A， Habibu-Ur-Rehman Kazmi M H. Antifungal aryltetralin lignans from leaves of Podophyllum hexandrum [J]. Phytochemistry， 1995， 40（2）： 427.

[4] Iberti V， Donadio M， Giaccone G. Cisplatin and teniposide chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer [J]. Eur J Cancer Clin Oncol， 1991， 27（9）： 1104.

[5] Clark P I， Slevin M L. The clinical pharmacology of etoposide and teniposide [J]. Clin Pharmacokinet， 1987， 12（4）： 223.

[6] Zilla M K， Nayak D， Amin H， et al. 4′-Demethyl-deoxypodophyllotoxin glucoside isolated from Podophyllum hexandrum exhibits potential anticancer activities by altering Chk-2 signaling pathway in MCF-7 breast cancer cells [J]. Chem Biol Interact， 2014， 224： 100.

[7] Liu Y， Zhao C， Li H， et al. Cytotoxicity and apoptosis induced by a new podophyllotoxin glucoside in human hepatoma（HepG2） cells [J]. Can J Physiol Pharmacol， 2010， 88（4）： 472.

[8] 王莉莉， 周應(yīng)軍. 抗癌物質(zhì)鬼臼毒素及其衍生物研究進展 [J]. 國外醫(yī)藥： 植物藥分冊， 2006， 21（1）： 6.

[9] Abad A， Loópez-Perez J L， del Olmo E， et al. Synthesis and antimitotic and tubulin interaction profiles of novel pinacol derivatives of podophyllotoxins [J]. J Med Chem， 2012， 55（15）： 6724.

[10] Zi C T， Yang D， Dong F W， et al. Synthesis and antitumor activity of novel per-butyrylated glycosides of podophyllotoxin and its derivatives [J]. Bioorg Med Chem， 2015， 23（7）： 1437.

[11] Gantt R W， Goff R D， Williams G J， et al. Probing the aglycon promiscuity of an engineered glycosyltransferase [J]. Angew Chem Int Ed， 2008， 47（46）： 8889.

[12] Xie K， Chen R， Li J， et al. Exploring the catalytic promiscuity of a new glycosyltransferase from Carthamus tinctorius [J]. Org Lett， 2014， 16（18）： 4874.

[13] Sun L， Chen D， Chen R， et al. Exploring the aglycon promiscuity of a new glycosyltransferase from Pueraria lobata [J]. Tetrahedron Lett， 2016， 57（13）： 1518.

[14] Chen D， Chen R， Wang R， et al. Probing the catalytic promiscuity of a regio- and stereospecific C-glycosyltransferase from Mangifera indica [J]. Angew Chem Int Ed， 2015， 54（43）： 12678.

[15] Xie K， Dou X， Chen R， et al. Molecular characterization and phylogenetic analysis of two novel fungal phenolic UDP-Glycosyltransferases from Absidia coerulea and Rhizopus japonicus [J]. Appl Environ Microbiol， 2017， doi：10.1128/AEM.03103-16.

[16] Xie K， Chen R， Chen D， et al. Enzymatic N-glycosylation of diverse arylamine aglycones by a promiscuous glycosyltransferase from Carthamus tinctorius [J]. Adv Synth Catal， 2017， 359（4）： 603.

[17] Feng J， Zhang P， Cui Y， et al. Regio- and stereospecific O-glycosylation of phenolic compounds catalyzed by a fungal glycosyltransferase from Mucor hiemalis [J]. Adv Synth Catal， 2017， doi：10.1002/adsc.201601317.

[18] Berim A， Ebel R， Schneider B， et al. UDP-glucose：（6-methoxy） podophyllotoxin 7-O-glucosyltransferase from suspension cultures of Linum nodiflorum [J]. Phytochemistry， 2008， 69（2）： 374.

[19] Chen W， Van Wyk B E， Vermaak I， et al. Cape aloes—a review of the phytochemistry， pharmacology and commercialisation of Aloe ferox [J]. Phytochem Lett， 2012， 5（1）： 1.

[責任編輯 丁廣治]