動(dòng)物類中藥質(zhì)量控制的生物評(píng)價(jià)研究

王玄+歐陽(yáng)羅丹+代春美+馬莉+肖小河

[摘要] 動(dòng)物類中藥是中藥中極具特色的一部分，其藥性峻猛，藥效成分不明確?，F(xiàn)行動(dòng)物類中藥的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)方法無(wú)法有效地控制其有效性及安全性，嚴(yán)重制約了動(dòng)物類中藥的發(fā)展。生物評(píng)價(jià)不拘泥于個(gè)別成分的作用，以生物效應(yīng)直接關(guān)聯(lián)藥效和安全性。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，生物芯片、高內(nèi)涵分析等新技術(shù)的涌現(xiàn)，從相關(guān)靶點(diǎn)、通路或關(guān)鍵生化因子入手，拓展了生物評(píng)價(jià)方法的領(lǐng)域。生物評(píng)價(jià)具有藥效相關(guān)、整體可控等優(yōu)勢(shì)，符合中醫(yī)藥質(zhì)量控制的特點(diǎn)，將成為動(dòng)物類中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化的重要發(fā)展方向之一。

[關(guān)鍵詞] 中藥； 動(dòng)物類中藥； 質(zhì)量控制； 生物評(píng)價(jià)

[Abstract] Animal medicine is a unique part of traditional Chinese medicine. They have strong effects， but their effective compounds are not entirely known. The efficiency and safety of animal medicines can′t be effectively controlled by current quality assurance system and evaluation method， which has deeply influenced the development of animal medicines. Biological assay does not focus on efficacy of single component， but directly reflects the pharmacodynamics and safety of animal medicines by biological effect. With the development of biotechnology， many new technologies have emerged， such as biochip and high content analysis. Based on the related targets， pathways and key biochemical factors， the field of biological assay has been expanded. With advantages of pharmacology andoverall controllability， as well as the characteristics of in line with the quality control of Chinese Medicine， biological assay will become one of the important development directionsfor quality standardization of animal medicines.

[Key words] traditional Chinese medicine； animal medicine； biological assay； quality control

動(dòng)物類中藥（簡(jiǎn)稱為動(dòng)物藥），又稱為蟲(chóng)類藥。即來(lái)源于動(dòng)物整體、器官、生理或病理產(chǎn)物等供藥用的中藥材。動(dòng)物藥使用歷史悠久，早在戰(zhàn)國(guó)時(shí)期，中醫(yī)始有運(yùn)用動(dòng)物藥的文獻(xiàn)記載。《神農(nóng)本草經(jīng)》中有動(dòng)物藥67種，占18.4%?！侗静菥V目》中有動(dòng)物藥461 種，占24.4%。近年調(diào)查我國(guó)中藥有12 807種，其中動(dòng)物藥1 581種，占12.3%[1]。動(dòng)物藥大多成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究不明確，且功效與成分難以關(guān)聯(lián)。隨著野生資源逐漸匱乏，偽劣品不斷出現(xiàn)，這對(duì)現(xiàn)行動(dòng)物藥的質(zhì)量控制體系提出挑戰(zhàn)。生物評(píng)價(jià)具有藥效相關(guān)、整體可控等技術(shù)優(yōu)勢(shì)，隨著新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，動(dòng)物藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)實(shí)施的條件已日趨成熟。本文擬從動(dòng)物藥的特點(diǎn)及質(zhì)量控制現(xiàn)狀進(jìn)行分析，闡述生物評(píng)價(jià)在動(dòng)物藥質(zhì)量控制中的優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用與發(fā)展。

1 動(dòng)物藥的特點(diǎn)

1.1 成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確

目前從動(dòng)物藥中分離得到的活性成分主要有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸類及其他小分子物質(zhì)。動(dòng)物藥成分復(fù)雜，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。以動(dòng)物藥水蛭為例，水蛭素是目前已知的作用最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑，一般從水蛭唾液腺中獲得[2]。中醫(yī)臨床多以動(dòng)物全體入藥，經(jīng)高溫炮制后入藥仍具有較強(qiáng)的活性，水蛭真正發(fā)揮臨床療效是水蛭素還是其它成分，目前尚無(wú)定論。

1.2 功效多，成分與藥效難以關(guān)聯(lián)

動(dòng)物藥大多具有多種功效。美洲大蠊古稱蜚蠊，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載：“主血瘀，寒熱，破積聚，喉咽痹，內(nèi)寒，無(wú)子。”《別錄》：“通利血脈”?，F(xiàn)代藥理作用包括促進(jìn)創(chuàng)面愈合，抗炎、鎮(zhèn)痛、消腫，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性，提高機(jī)體免疫功能，抗氧化等作用。目前研究表明其含有蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、脂肪和脂肪酸、信息素、糖類、酶及豐富的礦物質(zhì)和微量元素等成分[3]。眾多的成分與眾多的功效如何對(duì)應(yīng)？不同的功效是否對(duì)應(yīng)著不同的活性成分？各藥效成分之間是否存在協(xié)同增效的可能？動(dòng)物藥組成復(fù)雜，單以成分為指標(biāo)，難以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物藥質(zhì)量控制的突破。

1.3 藥性峻猛，大多有毒

動(dòng)物藥藥性峻猛，大多有毒。蟲(chóng)類藥多含有異體蛋白，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，異體蛋白易引起人體過(guò)敏反應(yīng)，以其致敏性損傷機(jī)體[4-5]。目前動(dòng)物藥不良反應(yīng)、毒性特征不完全清楚，毒性物質(zhì)基礎(chǔ)和中毒機(jī)制暫不明確。在歷代本草專著和現(xiàn)行《中國(guó)藥典》中，動(dòng)物藥僅有有毒無(wú)毒的記載及毒力強(qiáng)弱的分級(jí)（如大毒、有毒和小毒），尚缺乏客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)。因此，動(dòng)物藥的安全性評(píng)價(jià)也需要加強(qiáng)。

1.4 來(lái)源復(fù)雜，資源緊缺

動(dòng)物藥的來(lái)源十分復(fù)雜。尤其一部分來(lái)源于動(dòng)物的分泌物、排泄物及生理病理產(chǎn)物，如麝香、五靈脂、蟬蛻、牛黃等，或?yàn)閯?dòng)物的加工品，如阿膠、血余炭等。再加上飲片加工炮制等原因，很多原有性狀特征無(wú)法鑒別。而且《野生動(dòng)物保護(hù)法》將許多動(dòng)物藥列入保護(hù)動(dòng)物，而現(xiàn)有人工養(yǎng)殖技術(shù)還有待提高，導(dǎo)致目前許多動(dòng)物藥資源緊缺。在供不應(yīng)求的市場(chǎng)上，偽品、劣品、混淆品和習(xí)用品泛濫，這使在動(dòng)物藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣的質(zhì)量把控上有更大的難度。

2 動(dòng)物藥質(zhì)量控制的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)

目前動(dòng)物藥質(zhì)量控制主要有以下幾種控制模式。

2.1 找成分，測(cè)成分

現(xiàn)行動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的模式大部分是依據(jù)指標(biāo)性成分定性檢測(cè)與定量測(cè)定而制定的，但這些指標(biāo)性成分大多是為了檢測(cè)而檢測(cè)，其不一定是專屬性成分，也不一定是有效成分；即使既是專屬性成分也是有效成分，其譜效關(guān)系、量效關(guān)系、毒效關(guān)系目前尚不清楚。以膠類藥材為例，在2015年版《中國(guó)藥典》中，龜甲膠、阿膠和鹿角膠3種藥材均以L-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、 L-脯氨酸這4種氨基酸作為質(zhì)控成分。雖同為膠類藥材，均有滋陰補(bǔ)血之效，但龜甲膠偏于養(yǎng)陰清虛熱，阿膠偏于滋補(bǔ)陰血，鹿角膠則偏于溫陽(yáng)補(bǔ)腎。由此可見(jiàn)，這4種氨基酸專屬性不強(qiáng)，不能很好地解釋膠類藥材各自功效的特點(diǎn)。又如冬蟲(chóng)夏草以腺苷為檢測(cè)指標(biāo)。冬蟲(chóng)夏草的常見(jiàn)混淆品和偽品中腺苷含量雖然略低于冬蟲(chóng)夏草的腺苷含量，可是均高于藥典標(biāo)準(zhǔn)[6]。如果僅以腺苷含量為依據(jù)，這幾種藥材皆可以等同于冬蟲(chóng)夏草入藥，可這顯然有悖于實(shí)際應(yīng)用。隨著技術(shù)手段的進(jìn)步，如液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，使可檢測(cè)的成分越來(lái)越多，檢測(cè)指標(biāo)也由單一成分轉(zhuǎn)向多指標(biāo)同步測(cè)定。例如除了腺苷以外，核苷、麥角甾醇、糖類以及氨基酸等也均被作為指標(biāo)性成分進(jìn)行蟲(chóng)草的質(zhì)量控制[7-10]。但這仍沒(méi)有解決動(dòng)物藥質(zhì)量控制與功效未很好關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。

2.2 基于主要成分或一類成分的質(zhì)量控制模式

作為動(dòng)物藥的主要成分，蛋白質(zhì)及多肽的研究也越來(lái)越多。童芯鋅等[11]使用雙向電泳篩選得到蟲(chóng)草特有的21種蛋白質(zhì)，為有效物質(zhì)的確立奠定基礎(chǔ)。張晗星等[12]采用iTRAQ 技術(shù)從蛋白質(zhì)組的水平上對(duì)蟲(chóng)草有效成分進(jìn)行更深入的鑒定，為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)參考。程顯隆等[13]利用蛋白質(zhì)酶切技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析其蛋白質(zhì)及多肽的分子質(zhì)量及其分布規(guī)律，得到膠原蛋白特征肽段，以用來(lái)鑒別膠類藥材。

指紋圖譜在動(dòng)物藥質(zhì)量控制的研究也日益增多。用于動(dòng)物藥指紋圖譜研究的方法分為光譜法和色譜法2類，以色譜法居多。光譜法例如那麗丹等[14]采用¹H-NMR 代謝組學(xué)法得到不同廠家阿膠經(jīng)酸水解后的¹H-NMR 圖譜，并進(jìn)行化學(xué)成分差異性分析，為質(zhì)量控制提供了新方法和新思路。陳罡等[15]建立了冬蟲(chóng)夏草核磁特征指紋圖譜。 趙建國(guó)[16]、周健等[17]則采用傅里葉變換紅外光譜法 （FTIR） 得到僵蠶、麝香的紅外光譜指紋圖譜，可直觀有效地鑒別正品和偽品，以此為生藥鑒定與品質(zhì)評(píng)價(jià)提供參考。而色譜法例如通過(guò)HPLC指紋圖譜對(duì)冬蟲(chóng)夏草、海龍的品種真?zhèn)芜M(jìn)行有效鑒別[18-19]。高效毛細(xì)管電泳技術(shù)（HPCE） 因具有分析核酸、多肽和蛋白質(zhì)生物大分子的優(yōu)勢(shì)，在動(dòng)物藥的指紋圖譜中研究很多。目前已報(bào)道建立了土鱉蟲(chóng)、僵蠶、蛤蚧、蘄蛇、烏梢蛇、金錢白花蛇、菲牛蛭等的HPCE指紋圖譜，以此作為其品種鑒定與質(zhì)量控制方法[20-26]。但是由于動(dòng)物藥成分極其復(fù)雜，雖然反映了整體化學(xué)信息，但所檢測(cè)的特征指紋有可能并不完全包含其有效成分，“譜-效”關(guān)系不能得到體現(xiàn)，所以控制一類成分也只能是一種過(guò)渡性質(zhì)量控制方法。

2.3 基于核酸分子鑒定技術(shù)的動(dòng)物藥來(lái)源真實(shí)性考察

如采用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）分子鑒定技術(shù)[27-28]及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）鑒定技術(shù)[29]和基于 ITS序列的條形碼技術(shù)[30]等對(duì)冬蟲(chóng)夏草進(jìn)行真?zhèn)舞b定。Kumeta等[31]以細(xì)胞色素b基因作為引物，成功地鑒別出阿膠的動(dòng)物基源以及摻假與否。 Yuan G等[32]通過(guò)建立RAPD-HPCE法能快速鑒別鹿茸真?zhèn)?。近年?lái)，DNA條形碼技術(shù)成為動(dòng)物藥材鑒定的新工具。鄢丹等[33]利用COⅠ 序列可以對(duì)羚羊角、鹿角等傳統(tǒng)角類藥材及其偽品進(jìn)行很好地鑒別。張輝等[34]利用DNA 條形碼可以對(duì)《中國(guó)藥典》45種動(dòng)物藥材及其混偽品進(jìn)行相互區(qū)分。2014年，石林春等[35]構(gòu)建了中國(guó)動(dòng)物藥材 DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。

目前動(dòng)物藥研究重點(diǎn)主要關(guān)注其來(lái)源的真實(shí)性及個(gè)別成分或某一類成分的變化規(guī)律，見(jiàn)表1，并未重點(diǎn)關(guān)注動(dòng)物藥的生物藥效。其優(yōu)劣等級(jí)如何區(qū)分，人工養(yǎng)殖品與野生品之間的臨床功效差異幾何？對(duì)于動(dòng)物藥這種多成分復(fù)雜體系，單以成分為指標(biāo)，難以實(shí)現(xiàn)動(dòng)物藥質(zhì)量控制的突破，亟待探索新的研究方法。

3 動(dòng)物藥的生物評(píng)價(jià)研究

生物評(píng)價(jià)（biological assay），是指在特定的試驗(yàn)條件下，評(píng)價(jià)供試藥物作用于生物體系所表達(dá)出的特定生物效應(yīng)的方法，用于定性或定量評(píng)價(jià)供試藥物的質(zhì)量。生物評(píng)價(jià)研究建立的方法須具備定量藥理學(xué)與藥檢分析的雙重屬性和要求。即以藥理實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，例如解熱、抗炎、活血等實(shí)驗(yàn)，建立基于生物效應(yīng)的動(dòng)物藥評(píng)價(jià)模式，然后用生物統(tǒng)計(jì)的方法篩選出比較適宜的生物效價(jià)檢測(cè)方法。理論上說(shuō)，多數(shù)藥理方法通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)均可用作生物測(cè)定方法，但由于藥品檢驗(yàn)工作對(duì)生物測(cè)定的要求有其特殊性，以及多數(shù)中藥量效關(guān)系不明顯，因此一般的藥理方法有時(shí)并不適合直接作為生物評(píng)價(jià)方法，故應(yīng)對(duì)生物評(píng)價(jià)方法進(jìn)行優(yōu)化和選擇?？偠灾瑒?dòng)物藥質(zhì)量生物評(píng)價(jià)與控制并非常規(guī)藥效試驗(yàn)的定量化，而是在生物檢定思想的基礎(chǔ)上，切合中藥的自身特點(diǎn)，在滿足藥物質(zhì)量控制操作可行性的前提下，最大程度地表征動(dòng)物藥的內(nèi)在質(zhì)量，達(dá)到質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制的目的。

現(xiàn)有方法多是關(guān)聯(lián)功效或毒性的生物活性檢測(cè)（包括效價(jià)、生物活性限值和毒價(jià)測(cè)定等），主要用于動(dòng)物藥質(zhì)量的優(yōu)劣、毒性大小等的評(píng)價(jià)。近年來(lái)，又發(fā)展起了生物芯片、組學(xué)技術(shù)、生物自顯影薄層色譜和高內(nèi)涵分析等新技術(shù)從相關(guān)細(xì)胞、靶點(diǎn)、通路或關(guān)鍵生化因子入手，建立起關(guān)聯(lián)機(jī)制的動(dòng)物藥的生物評(píng)價(jià)。

3.1 關(guān)聯(lián)功效或毒性的動(dòng)物藥生物活性檢測(cè)

關(guān)聯(lián)功效或毒性的生物活性檢測(cè)可以定量表征動(dòng)物藥的功效、活性或生物學(xué)效應(yīng)。生物評(píng)價(jià)具有關(guān)聯(lián)功效的優(yōu)勢(shì)，尤其適用于組成復(fù)雜、理化方法難以測(cè)定，而且理化測(cè)定也不能反映其臨床功效的動(dòng)物藥。根據(jù)常用動(dòng)物藥的主要功效，對(duì)其藥理作用和相應(yīng)生物活性評(píng)價(jià)方法進(jìn)行了概述，見(jiàn)表2。

3.1.1 攻毒散結(jié)類動(dòng)物藥 攻毒散結(jié)類動(dòng)物藥可治療濁痰、瘀血等結(jié)聚而形成的瘡瘍腫毒瘰疬結(jié)核諸證?，F(xiàn)多用于抗腫瘤治療。主要通過(guò)直接抑制腫瘤增生，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，阻止腫瘤細(xì)胞向周圍組織浸潤(rùn)而起作用。以其功效構(gòu)建生物評(píng)價(jià)的方法，從動(dòng)物藥對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用[36-37]，對(duì)RNA和蛋白質(zhì)合成的抑制作用，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[38]，抑制雞胚血管生成[39]等進(jìn)行生物評(píng)價(jià)。例如王晶娟等[40-41]以改良MTT法、流式細(xì)胞法研究全蝎蛋白藥效組分對(duì)Bel7402細(xì)胞和HepG 2細(xì)胞毒和細(xì)胞周期抑制的作用，來(lái)評(píng)價(jià)全蝎的抗腫瘤活性。

3.1.2 清熱解毒類動(dòng)物藥 清熱解毒類動(dòng)物藥多用于里熱證，即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的多種急性傳染病、感染性疾病及其他如腫瘤等。以其生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建方法，見(jiàn)表3。

以臨床廣泛用于治療瘡瘍腫毒、咽喉腫痛、跌打損傷等癥的麝香為例，羅云等[43]采用酶免疫 （EIA） 法，測(cè)定人工麝香對(duì)環(huán)氧合酶Ⅱ （COX-2） 的抑制率，構(gòu)建人工麝香對(duì)COX-2 抑制作用的量效關(guān)系，為建立人工麝香的體外抗炎效價(jià)測(cè)定方法提供基礎(chǔ)。此外，羅云等[44]采用微量熱法，測(cè)定人工麝香對(duì)其抑制作用過(guò)程的熱效應(yīng)變化，并獲得其相應(yīng)的熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)，從而對(duì)人工麝香對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用強(qiáng)度進(jìn)行定性定量的評(píng)價(jià)。

3.1.3 活血化瘀類動(dòng)物藥 活血化瘀類動(dòng)物藥以疏通血脈、消散瘀血為主要作用，臨床常用于各種血瘀證的治療。同時(shí)，活血化瘀藥因能改善機(jī)體的高黏狀態(tài)，影響腫瘤細(xì)胞的血行擴(kuò)散與轉(zhuǎn)移，抑制新生血管生成而具有抗腫瘤作用[45]。以其生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建方法，見(jiàn)表4。

例如角甲類藥物，基于其活血通絡(luò)的作用，Luo等[53]采用血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)，凝血酶時(shí)間，凝血酶滴定實(shí)驗(yàn)以及體外血栓法和全血凝塊法分別對(duì)羚羊角，山羊角，水牛角，穿山甲，鱉甲，龜甲，鹿角等角甲類藥的抗凝血、抗血栓活性進(jìn)行了生物評(píng)價(jià)。并且根據(jù)生物評(píng)價(jià)結(jié)果對(duì)珍稀瀕危物種尋找替代品提供借鑒依據(jù)。

3.1.4 補(bǔ)血滋陰類動(dòng)物藥 補(bǔ)血滋陰類動(dòng)物藥可以補(bǔ)益人體氣血不足，提高機(jī)體免疫力，延緩衰老等。在抗腫瘤治療中也發(fā)揮著扶正驅(qū)邪的作用。以其生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建方法，見(jiàn)表5。

Wu等[56]建立由5-FU和γ射線導(dǎo)致的血虛證模型，選擇外周血象，骨髓和脾造血祖細(xì)胞，超氧化物歧化酶（SOD）、GSH-Px、ROS、脾表面集落形成單位（CFU-S）等功能指標(biāo)對(duì)阿膠提取物進(jìn)行增強(qiáng)造血作用評(píng)價(jià)。周丹蕾等[57]采用MTT比色法，通過(guò)其對(duì)刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用的影響來(lái)進(jìn)行免疫活性生物評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)天然蟲(chóng)草和人工蟲(chóng)草均能增強(qiáng)免疫，但不同產(chǎn)地、品種和規(guī)格的蟲(chóng)草在增強(qiáng)免疫的作用上存在差異，這為以人工蟲(chóng)草替代天然蟲(chóng)草的可行性提供了參考依據(jù)。王東亮等[58]建立D-半乳糖致小鼠衰老模型，通過(guò)檢測(cè)其血清、腦、肝中SOD，CAT，GSH-Px活性和MDA含量，以及采用Western blot法檢測(cè)p16和p21的表達(dá)等方法來(lái)評(píng)價(jià)阿膠的抗衰老活性。

3.1.5 壯陽(yáng)益腎類動(dòng)物藥 部分蟲(chóng)類藥甘咸性溫，或?yàn)檠庥星橹罚軠匮a(bǔ)腎陽(yáng)，強(qiáng)筋健骨。主治腎陽(yáng)不足的畏寒肢冷、腰膝酸軟、陽(yáng)痿不舉、宮冷不孕等。以其生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建方法，見(jiàn)表6。

龔偉等[61]通過(guò)比較不同規(guī)格鹿茸飲片對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的影響，并進(jìn)行聚類分析，建立起鹿茸飲片強(qiáng)筋健骨的生物學(xué)評(píng)價(jià)，從而為其飲片質(zhì)量進(jìn)行分級(jí)。毛翠平等[62]則用體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，建立了抗骨質(zhì)疏松中藥作用于骨形成的藥效學(xué)評(píng)價(jià)方法。

3.1.6 祛風(fēng)通絡(luò)類動(dòng)物藥 爬行蟲(chóng)類性善走竄，長(zhǎng)于治風(fēng)，有祛風(fēng)通絡(luò)，解毒止痛之功。是臨床治療風(fēng)濕病的要藥。以其生物學(xué)效應(yīng)構(gòu)建方法，見(jiàn)表7。

3.1.7 其他 動(dòng)物藥如麝香、蟾酥等具有開(kāi)竅醒神的功效，主要用于各種竅閉神昏證?？蓮膶?duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響，腦保護(hù)及抗炎作用等進(jìn)行開(kāi)竅活性評(píng)價(jià)。

3.2 生物新技術(shù)在動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

隨著現(xiàn)代科學(xué)的發(fā)展，許多新技術(shù)如生物芯片技術(shù)，組學(xué)生物標(biāo)志物，高內(nèi)涵分析技術(shù)以及生物自顯影技術(shù)等逐漸被應(yīng)用到動(dòng)物藥的生物評(píng)價(jià)中，這也是目前生物評(píng)價(jià)發(fā)展的方向。

3.2.1 生物芯片 生物芯片可以將中藥研究與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)內(nèi)容聯(lián)系起來(lái)，在基因、蛋白質(zhì)等分子水平闡明中藥的作用靶點(diǎn)和機(jī)制，通過(guò)高通量檢測(cè)及表達(dá)譜形式表征中藥藥效，在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制研究領(lǐng)域的應(yīng)用已日益增多。武麗斐等[64]應(yīng)用大鼠全基因表達(dá)譜芯片，通過(guò)差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)冬蟲(chóng)夏草主要通過(guò)抗炎、抗凋亡、抗氧化等途徑對(duì)缺血性神經(jīng)元起到保護(hù)作用，并通過(guò)神經(jīng)再生等作用對(duì)缺血部位的腦組織進(jìn)行修復(fù)等。鄭重等[65]通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）功能基因芯片檢測(cè)篩選差異表達(dá)基因，結(jié)果表明康復(fù)新液能明顯抑制 MMP-3，MMP-13的表達(dá)，這為其改善急性大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的作用機(jī)制提供了依據(jù)。

此外，利用表達(dá)譜對(duì)比研究動(dòng)物藥或其提取物作用于機(jī)體前后，特定細(xì)胞中相關(guān)物質(zhì)表達(dá)的異常變化，可提示該動(dòng)物藥在研究劑量下是否具有毒性，并能闡明其作用機(jī)制并控制其安全性[66]。楊愛(ài)文等[67]以蟾酥為研究對(duì)象，通過(guò)表達(dá)譜芯片篩查大鼠在灌胃給予蟾酥高、低劑量的基因表達(dá)差異，然后進(jìn)行Ontology和Pathway富集分析，解釋蟾酥心臟毒性的作用機(jī)制及其劑量依賴性。

3.2.2 組學(xué)生物標(biāo)志物 生物標(biāo)志物是一種能客觀測(cè)量并評(píng)價(jià)正常生物過(guò)程、病理過(guò)程或?qū)λ幬锔深A(yù)反應(yīng)的指示物，是生物體受到干預(yù)時(shí)的重要指示指標(biāo)，涉及細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)和功能的變化，生化代謝過(guò)程的變化，生理活動(dòng)的異常表現(xiàn)，個(gè)體、群體或整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的異常變化等。在動(dòng)物藥質(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域，生物標(biāo)志物可以靈敏、綜合地反映中藥的生物效應(yīng)，為藥效的定量表征提供依據(jù)。

耿瀟等[68]運(yùn)用雙向凝膠電泳結(jié)合 MALDI-TOF-MS 技術(shù)，比較分析腦心通膠囊給藥前后的蛋白表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物，探討腦心通膠囊防治心腦血管疾病的可能作用機(jī)制。張鳳霞等[69]基于UFLC/MS-IT-TOF技術(shù)的代謝組學(xué)方法并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)來(lái)研究通心絡(luò)干預(yù)下的抑郁-動(dòng)脈粥樣硬化大鼠的血漿代謝譜，發(fā)現(xiàn)色氨酸、苯丙氨酸代謝及某些膽汁酸等標(biāo)志物，從而為藥效的定量表征提供依據(jù)。梁曉萍等[70]運(yùn)用UPLC/TOF-MS方法，比較空白組和蟾酥給藥組之間的代謝差異，找到潛在的生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)蟾酥導(dǎo)致心臟損傷的途徑可能是通過(guò)阻礙自由脂肪酸再?；蚣せ畹鞍准っ竿犯蓴_了脂質(zhì)代謝，從代謝組學(xué)的角度為闡述蟾酥毒性作用機(jī)理提供了新思路。

3.2.3 高內(nèi)涵分析技術(shù) 高內(nèi)涵分析技術(shù)是一種基于細(xì)胞表型分析的高效篩選技術(shù)，能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，同時(shí)檢測(cè)待測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)、周期、遷移、凋亡、代謝途徑及信號(hào)傳導(dǎo)等方面的影響，從單一試驗(yàn)中獲取大量有關(guān)信息，從而確定化合物的生物活性以及潛在毒性，從而以更直觀、動(dòng)態(tài)、定量的方式反映中藥質(zhì)量及藥效[71]。具有動(dòng)態(tài)、活體、多個(gè)指標(biāo)同步檢測(cè)綜合性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以全面生動(dòng)的反映細(xì)胞組學(xué)的整體變化進(jìn)程。

3.2.4 生物自顯影技術(shù) 生物自顯影薄層色譜是一種將薄層色譜分離和生物活性測(cè)定相結(jié)合的活性篩選方法。薄層色譜-生物自顯影技術(shù)可使活性成分在薄層色譜板上直接顯現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的活性斑點(diǎn)，在中藥檢驗(yàn)中可直觀地對(duì)藥物活性成分作定性鑒別，實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)薄層鑒別目的，且也可用于定量，能反映中藥的活性強(qiáng)弱。目前，應(yīng)用較廣的是對(duì)抗菌作用[72]、膽堿酶抑制作用[73]和抗氧化作用的評(píng)價(jià)[74-75]。

4 動(dòng)物藥生物評(píng)價(jià)方法構(gòu)建

對(duì)于生物評(píng)價(jià)常規(guī)方法與技術(shù)的整體框架，見(jiàn)圖1。

5 總結(jié)

2015 年，美國(guó) FDA 于發(fā)布《植物藥研發(fā)行業(yè)指南（草案）》，明確指出將生物評(píng)價(jià)作為植物藥在美國(guó)新藥注冊(cè)評(píng)審的重要內(nèi)容，其中就包括質(zhì)量控制。將生物評(píng)價(jià)方法引入動(dòng)物藥質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)體系，通過(guò)選擇合理的指標(biāo)，盡可能多地反映其“功能主治”，以彌補(bǔ)目前動(dòng)物藥質(zhì)量控制的缺陷。充分利用快速發(fā)展的科學(xué)技術(shù)，構(gòu)建更多、更好、更系統(tǒng)的生物評(píng)價(jià)方法，以評(píng)價(jià)藥效，觀察毒副作用，更好地保障動(dòng)物藥的質(zhì)量，推動(dòng)它的現(xiàn)代化、產(chǎn)業(yè)化和國(guó)際化發(fā)展。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]