冬蟲夏草大米培養(yǎng)基培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)篩選

謝昕+陳春+葉素丹

摘要 冬蟲夏草是一種被人們普遍接受的藥用真菌。由于其生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，故難以大規(guī)模人工培養(yǎng)應(yīng)用。本文以實(shí)驗(yàn)室分離得到的蟲草菌株Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041為研究對(duì)象，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響蟲草菌株在大米培養(yǎng)基上生長的光照、溫度和菌液接種量這3個(gè)因素進(jìn)行9 d的觀察，每3 d記錄菌體的增重量，以確定大米培養(yǎng)基培育蟲草的最佳生長條件，并測量其甘露醇含量。結(jié)果表明，3個(gè)影響因子光照、溫度和菌液接種量的重要性在生長初期（前3 d）依次為光照>溫度>菌液接種量；在生長中期（3～6 d）為溫度>光照>菌液接種量；在生長后期（6～9 d）為光照>溫度>菌液接種量。培養(yǎng)蟲草菌的最適條件為光照24 h、培養(yǎng)溫度25 ℃、1∶1（mL∶g）的菌米接種體積重量比。而米基培養(yǎng)的M2016041菌株菌絲中蟲草酸含量為（8.42±0.45） mg/g。本試驗(yàn)?zāi)軌驗(yàn)槿斯つM自然條件下蟲草的大規(guī)模培養(yǎng)提供一種有效的技術(shù)方法。

關(guān)鍵詞 冬蟲夏草；大米培養(yǎng)基；甘露醇；正交設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào) S567.3+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2017）10-0063-03

Abstract Ophiocordyceps sinensis is one kind of widely accepted medical fungus.However，it is hard to cultivate artificially for the large scale application because of its slow growth rate and fastidious cultivation conditions.In this study，taking Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041 reserved in laboratory as test material to study its biological characteristics and the optimal cultivation conditions on rice medium.By means of orthogonal design of experiments on the effects of Ophiocordyceps strain on the rice medium，three factors including light，temperature and inoculum size were observed for 9 days，weight recording every 3 days，in order to tetermine the optimum growth condition.Meanwhile the content of mannitol in the hyphae was determined.It suggested that in the initial growth stage （before 3 days），the range values of three factors were 0.098，0.057 and 0.022，and the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.In the middle growth stage （3-6 days），the ranks of importance was following：temperature> light > inoculum size.In the late growth stage （6-9 days），the ranks of importance was following：light > temperature > inoculum size.The optimum conditions for culturing cordyceps sinensis were light time 24 h，culture temperature 25 ℃，and volume weight ratio of bacteria and rice as 1∶1.Results were showed that the content of mannose in the hyphae was（8.42±0.45） mg/g.Conclusively，this study could provide an effective technical met-hod which could be artificially simulated under natural conditions for large-scale cultivation of Ophiocordyceps.

Key words Ophiocordyceps sinensis；rice culture medium；mannitol；orthogonal experimental design

目前，世界上已發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草屬真菌400多種，其中我國記錄有60多種，主要分布在吉林、遼寧、陜西等地[1-2]，而冬蟲夏草就是特指以青藏高原為主產(chǎn)地、中國特有的冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis）。冬蟲夏草屬于肉座菌目麥角菌科，是一種能夠感染喜馬拉雅蝙蝠蛾或蟲草蝙蝠蛾幼蟲的昆蟲病原真菌[2]。研究表明，冬蟲夏草在免疫調(diào)節(jié)、祛痰平喘、對(duì)肝腎損傷的保護(hù)、抗腫瘤、治療肝功能衰竭等方面具有明顯的效果[2-3]。

近20年來，國內(nèi)的一些科研院所相繼開展了人工培養(yǎng)和深層發(fā)酵培養(yǎng)蟲草菌絲體的研究，但蟲草真菌保健品大部分停留在利用液體培養(yǎng)菌絲體階段[4-5]，在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)則報(bào)道不多。大米培養(yǎng)基是一種常見的蟲生真菌固體培養(yǎng)基，在美國和日本得到大量的使用[6-8]。但是現(xiàn)在還沒有辦法做到冬蟲夏草人工栽培的大規(guī)模生產(chǎn)，還存在許多技術(shù)上的問題，如冬蟲夏草菌生長緩慢，侵染率低且侵染的影響因素不明等。不解決這些問題就沒有辦法實(shí)現(xiàn)冬蟲夏草的大規(guī)模生產(chǎn)[6-7]。另外，由于冬蟲夏草是昆蟲寄生真菌，表現(xiàn)出高度的宿主特異性，不同地區(qū)的蟲草菌具有不同的生長特性因素[8]。因此，篩選蟲草菌最適的生長條件的培養(yǎng)技術(shù)對(duì)更好地利用這一寶貴資源至關(guān)重要。

本文擬通過浙江省生物計(jì)量與檢驗(yàn)檢疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離得到的蟲草菌株M2016041，以常用的大米培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基對(duì)3個(gè)影響培育的主要因素（溫度、光照和接種比）對(duì)蟲草菌株的產(chǎn)量和相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)，篩選出最適蟲草生長的條件，以期能夠?yàn)槿斯つM自然條件下蟲草的大規(guī)模培養(yǎng)提供一種有效的技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 菌種來源及培養(yǎng)準(zhǔn)備

從采自寧夏的冬蟲夏草蟲體上篩選獲得一株生長良好的蟲草菌株，經(jīng)18S rRNA鑒定為Ophiocordyceps sinensis，命名為CCTCC M2016041，并已經(jīng)送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存。取冰箱中儲(chǔ)存的蟲草菌株適量接種到SDAY薩氏培養(yǎng)基（Difco）上，放在20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。將培養(yǎng)1周左右的菌落挑取接種到已高溫高壓滅菌SDB液體培養(yǎng)基（葡萄糖4%、酵母粉1%、蛋白胨1%）中，接種量為固體培養(yǎng)基內(nèi)總菌種量的50%以上。放入恒溫震蕩搖床，以150 r/min、20 ℃條件培養(yǎng)7 d。

1.2 大米培養(yǎng)基的制作

稱取200 g大米放入燒杯中，加入足量的沸水，攪勻，浸泡30 min后沖洗4～5遍，用紗布徹底濾干后放入60 ℃烘箱中烘15～30 min[9]。取出后用錫箔封好放入高壓滅菌鍋，121 ℃溫度下滅菌15 min。將已滅菌的大米均勻分開后加入上述SDB培養(yǎng)液15 mL，并充分?jǐn)嚢?。再將大米均勻地鋪? cm培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)基加10 g滅過菌的大米。

1.3 蟲草菌株M2016041的接種方法

取3支干燥潔凈的15 mL離心管，依次加入5、10、15 mL上述培養(yǎng)獲得的蟲草菌液，7 000 r/min離心3 min，去上清，加入10 mL無菌水混勻清洗，7 000 r/min離心5 min后再次去除上清，向沉淀菌體中加入13 mL 0.01% Tween80溶液，用槍頭輕輕混勻成懸濁狀態(tài)待噴霧用。取制作好的上述大米培養(yǎng)基，使噴霧器的噴頭與培養(yǎng)基表面呈90°角垂直噴灑，每個(gè)培養(yǎng)基噴灑1.5 mL，每種濃度處理9次重復(fù)。

1.4 蟲草菌株生長最優(yōu)條件篩選

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)因素，為溫度、光照條件、蟲草菌的接種量。溫度設(shè)為20、25、30 ℃ 3個(gè)水平，光照條件分別為黑暗24 h、光照24 h、12 h光照12 h黑暗，菌液接種量分別為5、10、15 mL。正交設(shè)計(jì)方案如表1所示。試驗(yàn)過程中設(shè)定接種后的1 d記為作D1，觀察分別在D3、D6和D9進(jìn)行，將大米培養(yǎng)基培養(yǎng)物放入50 mL離心管中再加入25 mL無菌水，進(jìn)行超聲后，8 000 r/min離心5 min后稱取菌體的重量。

1.5 甘露醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

稱取1 g的甘露醇于大燒杯中，量取1 L去離子水配制成1 mg/mL的甘露醇溶液，取6支試管分別編號(hào)為1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1 mg/mL的甘露醇溶液，再加入去離子水，使各試管中的甘露醇濃度分別為10、20、30、40、50、0 μg/mL。將配制的溶液分別取1 mL至新的試管，試管對(duì)應(yīng)標(biāo)記1～6。再向各試管中加入1 mL高碘酸鈉溶液，室溫放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash試劑，53 ℃水浴15 min。通過對(duì)甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液的比色法得甘露醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 蟲草甘露醇含量的測定

取培養(yǎng)完全的固體培養(yǎng)基上的蟲草菌置于干燥的無菌培養(yǎng)皿中，60 ℃的烘箱中過夜。稱取烘干后的蟲草菌0.5 g置于50 mL的離心管中超聲15 min，離心取上清，重復(fù)離心取上清置于5 mL的離心管中，加入一定量的去離子水定容至5 mL即濃度為0.1 g/mL，待用。取6支試管分別編號(hào)為1～6，向其中加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0 mL的0.1 g/mL的蟲草菌液，再加入去離子水，使各試管中的蟲草液濃度分別為1、2、3、4、5、0 mg/mL。將配制得到的溶液分別取1 mL至新的試管，試管對(duì)應(yīng)標(biāo)記1～6。再向各試管中加入1 mL高碘酸鈉溶液，室溫放置10 min。10 min后向其中加入2 mL 0.01% L-鼠李酸，最后加入1 mL的Nash試劑，53 ℃水浴15 min。通過比色法測得蟲草菌樣品的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得相應(yīng)的含量值，取其平均數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最優(yōu)條件的篩選

蟲草菌CCTCC M2016041在大米培養(yǎng)基培養(yǎng)前和固體培養(yǎng)期間的生長狀況如圖1所示?？梢钥闯?，接種后3 d部分大米表面有少許白色斑點(diǎn)產(chǎn)生，但多半大米表面沒有改變。菌種的覆蓋程度從高到低依次為25 ℃、10 mL菌接種量，30 ℃、15 mL菌接種量，20 ℃、5 mL菌接種量。另一個(gè)明顯的區(qū)別是 25 ℃條件下的米培養(yǎng)基中蟲草菌的厚度沒有30 ℃的大，但是30 ℃條件下蟲草菌的分布較不均勻，覆蓋厚的部分較少，其余部分沒有長，或者厚度沒有20 ℃條件下的蟲草菌覆蓋厚。接種后6 d，大米表面的米白色斑點(diǎn)部分已經(jīng)連成片，覆蓋面積明顯變大，覆蓋部分呈現(xiàn)半透明狀。蟲草菌在20 ℃、15mL菌接種量的大米培養(yǎng)基的生長覆蓋厚度比其在25 ℃、5 mL菌接種量和30 ℃、10 mL菌接種量條件下要薄。從接種后9 d蟲草培養(yǎng)的狀況來看，所有的培養(yǎng)基中的大米表面幾乎覆蓋完全且厚度較均一。雖然25 ℃下和30 ℃下覆蓋厚度沒有明顯的差別，但20 ℃明顯較其他2組的菌要低。

由圖2可知，接種后3 d各組菌增長量差異最顯著，最能體現(xiàn)單個(gè)因素對(duì)蟲草菌生長的影響。其中處理5增長量最明顯，其菌體增重量為0.398 5 g，培養(yǎng)條件為25 ℃、10 mL菌接種量和24 h光照。其次為處理9和處理6，培養(yǎng)條件分別為30 ℃、5 mL菌接種量、12 h光照和30 ℃、10 mL菌接種量、24 h光照。由此可認(rèn)為，適合蟲草菌生長的米培養(yǎng)基的溫度條件偏高，為25 ℃或25～30 ℃之間的一個(gè)溫度，而其光照條件明顯偏向光照時(shí)間較長的條件。至于菌接種量則沒有明顯的規(guī)律性。接種后6 d，除處理6明顯高于其他組外，處理1～5沒有明顯的區(qū)別，還有一個(gè)明顯的差別在于處理7～9，存在明顯的梯度，這3個(gè)處理的試驗(yàn)控制的條件是光照時(shí)間均為12 h，溫度分別為20、25、30 ℃，菌接種量分別為10、15、5 mL。可以推測蟲草菌生長到第6天時(shí)，溫度對(duì)其生長有一定的影響，且在給定的溫度范圍內(nèi)，菌的增重量隨溫度的升高而增長。接種后9 d由于所有處理的蟲草菌幾乎都生長完全，所以各組之間的菌增重量沒有明顯的差別。

由表2可知，接種后3 d極差分析表明，處理5與其余處理有明顯差異，處理5的培養(yǎng)條件為24 h光照、培養(yǎng)溫度 25 ℃、10 mL的菌接種量。接種后6 d，菌增重量以處理5、6、9的數(shù)據(jù)顯著性差異最多。接種后9 d蟲草菌幾乎覆蓋大米表面，各處理所得的菌增重量都沒有顯著性差異。

由上述可得，培養(yǎng)蟲草菌的最適條件為光照24 h、培養(yǎng)溫度25 ℃、菌接種量10 mL。在生長初期（D3前），3個(gè)影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.098、0.057、0.022，重要性依次為光照>溫度>菌液接種量。在生長中期（D3～D6），3個(gè)影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.074、0.101、0.069，重要性依次為溫度>光照>菌液接種量。在生長后期（D6～D9），3個(gè)影響因子光照、溫度和菌液接種量的極差值分別為0.052、0.059、0.040，重要性依次為光照>溫度>菌液接種量。在生長初期和中期，各處理間光照和溫度因子的差異顯著（P<0.05），而菌液接種量在整個(gè)過程中均不顯著。

2.2 蟲草酸的測定

由圖3可知，通過甘露醇標(biāo)準(zhǔn)液的配制，得出甘露醇含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且得出其回歸方程y=66.367x+0.064 1（R2=0.998 2）。再將試驗(yàn)得到的蟲草菌的樣品液中測得的OD值帶入回歸方程中，可得到5個(gè)值，取其平均數(shù)得到甘露醇在冬蟲夏草中的的含量為（8.42±0.45）mg/g。

3 結(jié)論與討論

近年來，中國一些地方已經(jīng)能夠進(jìn)行蟲草的大規(guī)模栽培。蛹蟲草可以寄生在動(dòng)物中如蠶或蠶蛹中來培養(yǎng)，也可以用大米為培養(yǎng)基來栽培，而大米及其添加物培養(yǎng)則是目前人工培育的主要方法[10-11]。本試驗(yàn)通過蟲草菌在大米培養(yǎng)基上的生長情況，對(duì)影響其生長的因素進(jìn)行了最優(yōu)篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本菌種在大米培養(yǎng)基上的最適生長條件為光照24 h、培養(yǎng)溫度 25 ℃、菌接種量10 mL（菌米接種體積、重量比為1∶1，mL∶g）。

昆蟲的生長發(fā)育遵循有效積溫法則，在有效溫度范圍內(nèi)，溫度愈高，發(fā)育速率愈快，而發(fā)育所需天數(shù)就愈少；反之，發(fā)育所需天數(shù)就愈多[1]。提取得到的菌種依舊保留著該屬性，適當(dāng)?shù)母邷赜兄诰N的生長。關(guān)于菌接種量對(duì)蟲草的生長沒有明顯的促進(jìn)作用，可能是因?yàn)榫N經(jīng)過離心和0.01%吐溫溶液溶解后，濃度高的菌體和濃度低的菌體與大米培養(yǎng)基的接觸面積是一樣的，只能靠與培養(yǎng)基接觸的部分菌絲體吸收營養(yǎng)，覆蓋在菌體上的蟲草菌不能直接吸收營養(yǎng)，因而生長繁殖較慢[6]。而濃度低的蟲草菌液在保證覆蓋米表面的前提下重復(fù)的覆蓋率沒有濃度高的多，所以生長速率沒有因濃度的不同而有明顯的變化。

另外，本文只是利用大米培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基來篩選冬蟲夏草人工培養(yǎng)的相關(guān)條件，以后可以添加其他研究報(bào)道的培養(yǎng)基質(zhì)，如白高粱[12]，或者培養(yǎng)添加物，如植物油[12]等來進(jìn)一步試驗(yàn)，以提高蟲草菌絲的產(chǎn)量和生物活性物質(zhì)含量。

冬蟲夏草的生長地特別是西藏、青海一帶，由于每年大量的采挖，對(duì)當(dāng)?shù)氐耐临|(zhì)環(huán)境有相當(dāng)大的破壞，甚至在雨季容易導(dǎo)致山體滑坡，最終造成水土流失。尋找一種可以模擬替代冬蟲夏草生長環(huán)境的培養(yǎng)基技術(shù)對(duì)更好地利用這一寶貴資源至關(guān)重要。本研究開發(fā)的成熟模擬培養(yǎng)技術(shù)為冬蟲夏草保健品的開發(fā)提供一條新的技術(shù)路徑，而且可以套用到其他藥用真菌的模擬培養(yǎng)，使得蟲生藥用真菌產(chǎn)業(yè)多樣化和“平民化”，對(duì)替代日趨減少的冬蟲夏草野生資源和保護(hù)西部地區(qū)逐步惡化的生態(tài)環(huán)境具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

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