MicroRNAs與異種移植

趙智成

摘要：MicroRNAs是一種普遍存在的非編碼單鏈RNA，廣泛參與眾多的生物學(xué)過程，特別是對免疫系統(tǒng)能夠進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)和定量調(diào)節(jié)。異種移植是治療臟器功能衰竭的希望。研究MicroRNAs在免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答中的作用，將為防治移植排斥反應(yīng)提供新的途徑。

關(guān)鍵詞：MicroRNAs；異種移植；免疫調(diào)節(jié)；排斥反應(yīng)

中圖分類號：R392.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）13-0044-03

1 MicroRNAs的研究現(xiàn)狀

近年來測序技術(shù)、生物信息學(xué)以及基因組學(xué)的飛速發(fā)展帶來了巨量的遺傳信息，使人們認(rèn)識到基因表達(dá)和調(diào)節(jié)機制的重要性。1993年，Lee等在秀麗新小桿線蟲中發(fā)現(xiàn)了第一個可時序調(diào)控胚胎后期發(fā)育的基因lin-4[1]。2000年，Reinhart等又在該線蟲中發(fā)現(xiàn)第二個異時性開關(guān)基因let-7[2]。2001年10月《Science》報道了三個實驗室分別從線蟲、果蠅和人體內(nèi)找到的幾十個類似于lin-4的小RNA基因，稱之為MicroRNAs。在過去的十年中，MicroRNAs作為細(xì)胞基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的核心元件這一事實越發(fā)的清晰。MicroRNAs家族是一類內(nèi)源性、非編碼、單鏈RNA，長約22個核苷酸，作為一種轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)節(jié)因子而廣泛存在于從病毒、線蟲、植物到動物體內(nèi)。MicroRNAs通過和匹配的互補mRNA結(jié)合或促進(jìn)靶mRNA降解來阻斷翻譯過程進(jìn)而抑制蛋白的合成。MicroRNAs被一組的基因編碼，在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，經(jīng)過一系列的加工變?yōu)殚L為19～25核苷酸的成熟體。首先在核內(nèi)，較長的包含特征性發(fā)卡結(jié)構(gòu)的MicroRNAs初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（primary MicroRNAs）被RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄并被核糖核酸酶III、Drosha內(nèi)切酶及Parsha/DGCR8加工成70個核苷酸左右并能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體（pre-MicroRNAs）[3]。而后，pre-miRNAs被轉(zhuǎn)運子5轉(zhuǎn)移到胞漿內(nèi)，并被Dicer酶及其配體TAR RNA結(jié)合蛋白（TRBP）加工成22核苷酸的雙鏈RNA。雙鏈RNA解離后形成有功能的、成熟的MicroRNAs單鏈，后者與包括Argonaute族在內(nèi)的眾多蛋白組成RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），從而發(fā)揮抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄及促進(jìn)其降解的作用。揭開MicroRNAs的沉默翻譯網(wǎng)絡(luò)之謎在某種程度上仍是一項挑戰(zhàn)，這是因為一種MicroRNAs可以抑制多種靶mRNA，同時一種mRNA又接收多種相互合作的MicroRNAs的調(diào)控。與之相應(yīng)，盡管已知MicroRNAs的表達(dá)、功能失調(diào)與多種人類腫瘤和自身免疫性疾病相關(guān)，但對于MicroRNAs的調(diào)控機制我們?nèi)匀恢跎?。其直接參與了廣泛的生物學(xué)過程，包括生長發(fā)育、造血、細(xì)胞分化、凋亡及增殖。迄今為止，超過800種人類MicroRNAs被鑒別，而只有其中一小部分的生物學(xué)功能被闡明。到目前為止，通過某些計算機手段預(yù)測出來的MicroRNAs約多達(dá)1000個甚至可能更多，大約覆蓋了3%人類基因組序列[4-6]。

2 MicroRNAs的鑒別和檢測

鑒別和檢測MicroRNAs的三項主要技術(shù)：總MicroRNAs測序、總MicroRNAs芯片檢測及實時定量PCR（qPCR）對于假定MicroRNAs的直接檢測。測序最為敏感，可發(fā)現(xiàn)新的MicroRNAs。常規(guī)cDNA克隆后測序和深度測序[7]被用于鑒別新MicroRNAs。存在多種MicroRNAs芯片如MicroRNAs微芯片、qPCR芯片，盡管它們只能用于已知MicroRNAs的檢測[8-11]，商品化的試劑盒可被有效用于基于雜交和qPCR的MicroRNAs表達(dá)分析。最后，直接的qPCR用于對已知MicroRNAs的快速檢測。帶有莖環(huán)的逆轉(zhuǎn)錄引物增加了對于MicroRNAs檢測的特異性及敏感性[12]。

3 MicroRNAs的功能

3.1 MicroRNAs功能與表達(dá)的關(guān)系

MicroRNAs的功能分析主要包括對MicroRNAs表達(dá)的調(diào)節(jié)和對靶mRNA表達(dá)的影響。慢病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體常被用于高表達(dá)MicroRNAs，而后對其靶mRNA的表達(dá)進(jìn)行分析[13]。常用的策略是使用含有MicroRNAs靶序列的熒光素酶報告系統(tǒng)來檢測過表達(dá)pri-miRNA或用shRNA、siRNA抑制時靶mRNA的表達(dá)情況。其它減低MicroRNAs表達(dá)的方法還有MicroRNAs基因敲除和序列特異性的MicroRNAs拮抗物[14]。絕大多數(shù)MicroRNAs的靶mRNA還不清楚，確定某一特定的MicroRNAs的靶基因及結(jié)合位點仍是一大挑戰(zhàn)?；蛐酒桶谢蝾A(yù)測軟件可用于這一工作[15-16]。據(jù)估計至少有一半表達(dá)的mRNA被MicroRNAs所調(diào)控[17]。通過熒光素酶報告系統(tǒng)，這些mRNA將被確認(rèn)其非翻譯區(qū)（UTRs）是否被特定的MicroRNAs所調(diào)控[18]。而MicroRNAs在人工系統(tǒng)中能夠調(diào)節(jié)某一mRNA并不能說明在體內(nèi)后者是前者功能相關(guān)的靶mRNA[19]。

3.2 MicroRNAs功能與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的關(guān)系

動物免疫系統(tǒng)在應(yīng)對感染、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和免疫方面發(fā)揮重要作用。為了達(dá)到免疫反應(yīng)和免疫耐受的適當(dāng)平衡，免疫反應(yīng)的開始、結(jié)束和反應(yīng)強度必須被嚴(yán)密調(diào)節(jié)。相較于轉(zhuǎn)錄子全開或全閉的調(diào)節(jié)方式，MicroRNAs更適合對免疫系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)和定量的調(diào)節(jié)。因為它們都是通過極短的作用位點進(jìn)行調(diào)節(jié)，在對應(yīng)位點一個或幾個堿基對就可以起到關(guān)鍵的作用，并且因為它們在進(jìn)化中易于突變，從而為生物提供了隨病原體變化同時又發(fā)揮作用的基因調(diào)節(jié)庫。最近研究表明MicroRNAs在免疫系統(tǒng)的精密調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。深入理解免疫系統(tǒng)被MicroRNAs調(diào)節(jié)的機制，不僅有利于尋找調(diào)節(jié)免疫的新靶標(biāo)，也有利于創(chuàng)造MicroRNAs有效地新療法。MicroRNAs在免疫系統(tǒng)發(fā)育及功能中起到了關(guān)鍵作用。某些特定MicroRNAs對B細(xì)胞、T細(xì)胞分化，先天及獲得性免疫，T細(xì)胞受體（TCR）通路，toll樣受體（TLR）通路，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）功能，抗原的表達(dá)及細(xì)胞因子的產(chǎn)生都具有巨大影響。因此，MicroRNAs參與了免疫的各個方面并可以決定移植物的排斥與耐受，盡管這一論點須在移植模型中作進(jìn)一步證實。

4 異種移植的排異反應(yīng)

器官移植已成為臟器功能衰竭的一種重要療法，環(huán)孢素等抗排斥藥物的出現(xiàn)以及手術(shù)技術(shù)的進(jìn)步使器官移植取得了里程碑式的進(jìn)展。然而，移植供體日漸缺乏。臨床上如果能夠開展異種移植，則可為患者提供大量的供體，移植技術(shù)也將得到極大的推動。異種移植完成后受體將表現(xiàn)出比同種移植更為復(fù)雜而強烈的排異反應(yīng)。包含：超急性排斥反應(yīng)（hyperacute rejection，HAR）、急性血管性排斥反應(yīng)（acute vascluar rejection，AVR）、急性細(xì)胞性排斥反應(yīng)（acute cellular rejection，ACR）等。其中，HAR主要由半乳糖α1，3-半乳糖抗原（Galα1，3Gal）所引發(fā)，而急性血管排斥反應(yīng)和急性細(xì)胞排斥反應(yīng)與核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）有著密切關(guān)系。AVR發(fā)生于HAR后，又稱延遲移植排斥反應(yīng)（delayed xenograft rejection，DXR），AVR有2個特點，其一是激活血管內(nèi)皮細(xì)胞以及單核細(xì)胞浸潤，很少出現(xiàn)T細(xì)胞或缺少T細(xì)胞，表明AVR并不依靠補體參加。此反應(yīng)是通過抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用以及供體內(nèi)皮細(xì)胞活化等幾種機制來完成。有研究證明，3個因素或許參與AVR的發(fā)生、發(fā)展：天然異種抗體、繼發(fā)抗體的結(jié)合、激活的供體內(nèi)皮細(xì)胞和針對異源組織的NK細(xì)胞活化。

5 MicroRNAs與異種移植的關(guān)系

當(dāng)我們開始認(rèn)識到MicroRNAs在參與免疫應(yīng)答中有怎樣的特異性時，有證據(jù)表明MicroRNAs參與了整個免疫穩(wěn)態(tài)和自身耐受的維持。此外，MicroRNAs表達(dá)的方式和水平依淋巴細(xì)胞的分化和活化而進(jìn)行高度調(diào)節(jié)。既然特定基因的表達(dá)模式可以作為移植物排斥或耐受的標(biāo)志，那么有理由認(rèn)為MicroRNAs表達(dá)的變化便是這種模式的基礎(chǔ)。Suthanthiran的研究小組測定了365種MicroRNAs在7份同種異體腎移植物活檢標(biāo)本中的表達(dá)模式并分析了特定MicroRNAs在其它33份標(biāo)本（12份急排、21份正常）的表達(dá)情況。聚類分析表明急排組與正常組有差異。17種MicroRNAs在急排活檢標(biāo)本和正常對照間表達(dá)有差異。與正常對照相比，10種低表達(dá)，7種高表達(dá)。miR-142-5p，miR-155和miR-223高度提示急排并且與移植物內(nèi)CD3 mRNA水平相關(guān)。miR-155被證明與抗體、細(xì)胞因子產(chǎn)生，TLR信號通路，Treg細(xì)胞生成相關(guān)，而所有這些都關(guān)系到同種異體移植物排斥反應(yīng)。這3個MicroRNAs基因簇位點是：miR-648、miR-185、miR-130b同位于染色體22q11，21；miR-510、miR-513位于染色體xq27，3；miR-370、miR-494、miR-134、miR-433位于染色體14q32，31。通過軟件TargetsScan可以預(yù)測差異表達(dá)顯著的MicroRNAs靶基因，從中尋找慢性排斥的可能影響因子進(jìn)行進(jìn)一步的研究探索。由此可見，MicroRNAs在移植排斥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

6 小結(jié)

未來幾年的研究工作將集中在闡明特定MicroRNAs的靶基因及其生物學(xué)重要性。在這一領(lǐng)域的進(jìn)展無疑將使我們對于免疫應(yīng)答的理解更近一步從而為器官移植提供了新的靶點和途徑。事實上，靜默靶MicroRNAs的相關(guān)策略已經(jīng)被開發(fā)-即使用“拮抗mirs”，一種與靶MicroRNAs互補的膽固醇結(jié)合的單鏈RNA寡核苷酸。其它的方法包括使用載體介導(dǎo)的MicroRNAs靶序列誘導(dǎo)并耗竭內(nèi)源性的mRNAs。另外，使用腺病毒載體替代靶MicroRNAs的方法對鼠肝細(xì)胞癌模型起到了治療作用。未來對MicroRNAs在調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答中表達(dá)和功能的進(jìn)一步認(rèn)識必將為促進(jìn)移植物長期存活提供新的可能性。

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編輯/成森