解磷菌株M-3-01發(fā)酵工藝優(yōu)化

柯春亮,李淑娟,段雅婕

（1.廣東石油化工學(xué)院,廣東茂名525000；2.茂名市第十七中學(xué),廣東茂名525000；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,廣東湛江524091）

解磷菌株M-3-01發(fā)酵工藝優(yōu)化

柯春亮1,李淑娟2,段雅婕3

（1.廣東石油化工學(xué)院,廣東茂名525000；2.茂名市第十七中學(xué),廣東茂名525000；3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,廣東湛江524091）

采用單因素試驗研究碳、氮、磷礦粉3組主要影響因子類別和質(zhì)量濃度對解磷菌M-3-01（Serratia nematodiphila）菌株解磷效果的影響,再運用正交試驗進行L（934）優(yōu)化,以探究M-3-01的解磷發(fā)酵配方工藝.結(jié)果表明：菌株M-3-01的高效解磷最終優(yōu)化發(fā)酵配方中,葡萄糖、草酸銨、磷礦粉、無機鹽的質(zhì)量濃度分別為15 g/L、1.5g/L、2.5 g/L、1.92 g/L,接種量為2%,pH為6.0,150 r/min,37℃.解磷菌發(fā)酵配方經(jīng)過優(yōu)化后,優(yōu)化組有效磷含量達88.64mg/L,是CK有效磷含量的2.34倍,效果顯著,為優(yōu)化后的解磷菌發(fā)酵配方投入到微生物菌肥產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了有力的數(shù)據(jù)支持.

解磷菌株；正交試驗；培養(yǎng)基優(yōu)化

磷素以多種形式參與植物體內(nèi)的生理生化代謝過程,對植物的生長發(fā)育起著重要的作用[1-2].許多研究表明,利用解磷細菌制成的菌肥施入土壤后,不僅能夠提高土壤有效磷含量,而且能夠加強土壤其他有益微生物的活動,改善植物根部營養(yǎng),提高作物產(chǎn)量[3-6].微生物產(chǎn)品的質(zhì)量及成本都與培養(yǎng)的成本密切相關(guān).此外,培養(yǎng)基中碳源、氮源和無機鹽等也會影響解磷菌生長或改變其生理代謝途徑,從而影響其解磷效果[7-8].為了降低成本,提高產(chǎn)量,有必要進行培養(yǎng)基優(yōu)化,提高解磷效率.本項目利用實驗室篩選獲得的溶磷效果較好的細菌菌株M-3-01（Serratia nematodiphila）,通過單因素試驗及正交試驗,調(diào)整碳、氮、磷礦粉及培養(yǎng)條件,探究解磷菌株解磷效果最佳時的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件,以期為M-3-01菌株投入高效微生物菌肥的生產(chǎn)提供一定的理論支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株從香蕉根際土壤中篩選到對磷礦粉具有良好溶解效果的細菌蟲內(nèi)生沙雷氏菌M-3-01（Serratia nematodiphila）,由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供.

1.1.2 試劑和儀器碳源：葡萄糖,果糖,蔗糖,麥芽糖,乳糖,淀粉,甘油,甘露醇；氮源：硫酸銨,草酸銨,乙酸銨,氯化銨,硝酸銨,硝酸鉀,尿素,黃豆粉,酵母粉,蛋白胨；磷礦粉（有效磷含量為2.3 g/kg,全磷含量為237.5 g/kg）,產(chǎn)地江蘇錦屏.FE20K型pH計（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）,ZEISSAxioScope A1激光共聚焦熒光顯微鏡（德國卡爾蔡司公司）.

1.1.3 主要培養(yǎng)基

無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g,硫酸銨0.5 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,NaCl0.3 g,KCl0.3 g,MnSO4·H2O 0.03 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,磷礦粉5 g,蒸餾水定容至1 000mL,pH 7.0～7.2.磷礦粉與其他藥品分開滅菌后混和.

細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g,酵母粉5 g,NaCl10 g,pH 7.0,蒸餾水1 000mL.

上述兩種主要培養(yǎng)基加入瓊脂（體積分數(shù)為2%）滅菌即配成固態(tài)培養(yǎng)基.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液的制備挑取菌株M-3-01劃線接菌于細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基固體平板上37℃培養(yǎng)24 h.再挑取單菌落接菌于液態(tài)細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,37℃、250 r/min搖床培養(yǎng)24 h,用移液槍吸取一定量的菌液于光學(xué)顯微鏡下觀察有效活菌數(shù),用無菌水稀釋至活菌數(shù)為108cfu/mL量級的菌液.

1.2.2 發(fā)酵液有效磷含量測定

磷標準曲線的繪制：取數(shù)支50mL具塞比色管,分別加入質(zhì)量濃度為2mg/L的磷標準溶液0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、15.0mL,加水至50mL,然后向比色管中加入1mL質(zhì)量分數(shù)為10%的抗壞血酸溶液混勻,30 s后加入2mL鉬銻抗顯色劑,搖勻放置15min,以零濃度溶液為參照,于700 nm波長處測定吸光度.此時各管中磷質(zhì)量濃度分別為0、0.02、0.04、0.12、0.20、0.40、0.60mg/L.以磷質(zhì)量濃度為橫坐標,以吸光度為縱坐標,繪制磷標準曲線.

發(fā)酵液有效磷測定方法：吸取108cfu/mL量級的菌液1mL接于無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基上,37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)3 d,取發(fā)酵液在12 000 r/min離心機中離心7min,去除菌體.取上清液用0.45μm無菌濾膜過濾,觀察菌株的解磷能力.本試驗均采用鉬銻抗比色法顯色測定發(fā)酵液吸光值.具體方法為：取2.5mL濾液加入25mL比色管中,用純凈水定容至刻度線,其余步驟同上.分光光度值以不接菌培養(yǎng)基為空白對照,進行有效性磷含量測定,各處理均設(shè)3次重復(fù).解磷率計算公式如下：

式中：處理有效磷質(zhì)量濃度和對照有效磷質(zhì)量濃度的單位為mg/L,磷礦粉質(zhì)量濃度的單位為g/L,全磷含量的單位為%.

1.2.3 培養(yǎng)基單因素試驗

碳、氮源種類對發(fā)酵液有效磷含量的影響：采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方,分別將經(jīng)乙醚滅菌處理的質(zhì)量分數(shù)為1.0%的碳源加入到已高溫滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基中,同時將菌液分別接入,250mL三角瓶裝液100mL,于恒溫搖床中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)發(fā)酵3 d,對發(fā)酵液進行可溶性磷含量測定,方法見1.2.2.確定最佳碳源種類后,與碳源試驗一樣,只改變氮源種類,分別將代表菌株接入質(zhì)量分數(shù)為0.5%的氮源,加入到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng).均以不接菌作對照.

碳、氮源質(zhì)量濃度對有效磷含量的影響：在最優(yōu)碳、氮源種類已知的前提下,分別改變氮源質(zhì)量濃度（0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、碳源質(zhì)量濃度（0、5、10、15、20、30 g/L）,加入到液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,其余配方根據(jù)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方不變,超菌臺接待測菌株,搖床培養(yǎng)3 d,取上清濾液測有效磷含量.

磷礦粉質(zhì)量濃度對有效磷含量的影響：確定代表菌株生長的最佳碳、氮源及質(zhì)量濃度后,進一步探討磷礦粉質(zhì)量濃度對有效磷含量的影響.磷礦粉質(zhì)量濃度設(shè)置為2.5、5、10、15、20 g/L.

1.2.4 培養(yǎng)基正交試驗將篩選出的最優(yōu)葡萄糖、草酸銨、磷礦粉、無機鹽4個主要因子,分別用A、B、C、D表示,選用L9（34）正交表設(shè)計試驗,對代表菌株M-3-01進行主要因子的最優(yōu)組合搭配篩選試驗.試驗設(shè)3次重復(fù),以平均值作為試驗結(jié)果.

1.2.5 培養(yǎng)條件單因素試驗在確定最優(yōu)培養(yǎng)組合配方基礎(chǔ)上,對影響功能菌生長代謝的培養(yǎng)轉(zhuǎn)速、接種量和培養(yǎng)基pH值等培養(yǎng)條件進行逐一優(yōu)化.轉(zhuǎn)速設(shè)置為0、100、150、200、250 r/min；接種量設(shè)置為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、4.0%、7.0%、10.0%；初始pH值設(shè)置為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0.

1.2.6 驗證實驗通過單因素試驗、正交試驗篩選出最優(yōu)的碳源、氮源及其質(zhì)量濃度,磷礦粉質(zhì)量濃度等主要影響因子,配制發(fā)酵培養(yǎng)基.接上M-3-01菌液,在試驗最優(yōu)的培養(yǎng)條件與原培養(yǎng)條件下分別進行培養(yǎng),進行驗證實驗.試驗設(shè)3次重復(fù),以平均值作為實驗結(jié)果.

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對解磷菌M-3-01解磷能力的影響

不同碳源培養(yǎng)基的pH值及解磷菌M-3-01的解磷值見表1.

表1 碳源種類對解磷菌M-3-01解磷能力的影響Tab.1 Effectsofcarbons sourceson the phosphate-solubilizingability ofstrain M-3-01

由表1可知,菌株M-3-01在不同碳源培養(yǎng)基上振蕩培育3 d后,培養(yǎng)基的pH值及M-3-01的解磷能力表現(xiàn)出明顯差異.解磷菌M-3-01在以葡萄糖為碳源時解磷活性最高,解磷量為16.99±0.43mg/L；其次是以果糖為碳源,其解磷量為13.78±0.79mg/L.以葡萄糖為碳源時具有較高的解磷活性,這與趙小蓉的研究一致[9],同時培養(yǎng)基pH值也大幅度降低至4.5以下.雖然培養(yǎng)液pH值在以甘油、甘露醇、麥芽糖和蔗糖為碳源時有所增加,但M-3-01菌株溶解磷礦粉的能力卻明顯低于葡萄糖,特別是以甘露醇和甘油為碳源時,菌株M-3-01基本不表現(xiàn)出解磷活性.由表1可確定株菌M-3-01溶解磷礦粉的最佳碳源為葡萄糖.

2.2 氮源種類對解磷菌M-3-01解磷能力的影響

不同氮源培養(yǎng)基的pH值及解磷菌M-3-01的解磷值見表2.

由表2可知,菌株M-3-01在不同氮源培養(yǎng)基上振蕩培育3 d后,培養(yǎng)基的pH值及M-3-01的解磷能力表現(xiàn)出明顯差異.解磷菌M-3-01在以草酸銨為氮源時解磷活性最高,解磷量為46.14±0.20mg/L,分別是尿素、乙酸銨處理的19.72、6.83倍.說明M-3-01菌株能夠很好地利用草酸銨,改變菌體自身代謝,提高解磷能力.以（NH4）2SO4為氮源時菌株M-3-01的解磷能力僅次于草酸銨,解磷量為39.48±0.67mg/L,分別是尿素、乙酸銨處理的16.87、5.84倍.解磷菌菌株M-3-01在不同氮源時表現(xiàn)的解磷能力不同可能與自身產(chǎn)生的有機酸類別有關(guān).由表2中不同處理的pH值可以看出,與其他氮源相比,草酸銨作為氮源培養(yǎng)菌體時,在培養(yǎng)濾液的pH值方面差異不顯著,但它顯著提高了M-3-01的解磷量.而尿素、蛋白胨等作為氮源時,代表菌株M-3-01卻不能很好地利用,這可能是與此類氮源不易被菌體吸收從而限制了生長,或代表菌株利用不同氮源會引起代謝途徑改變進而影響菌體解磷能力有關(guān),也有可能是某些離子過多時會抑制活性物質(zhì)代謝.由表2可確定草酸銨為菌株M-3-01溶解磷礦粉的最佳氮源.

表2 氮源種類對解磷菌M-3-01解磷能力的影響Tab.2 Effectsofnitrogen sourceson the phosphate-solubilizing ability ofstrain M-3-01

2.3 最佳碳、氮源及磷礦粉質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響

2.3.1 最佳碳源質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響最佳碳源葡萄糖質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響見圖1.

圖1 最佳碳源質(zhì)量濃度對解磷細菌解磷能力的影響Fig.1 Theeffectofconcentration ofcarbon sourceson phosphate-solubilizing ability ofphosphorus solution bacteriaM-3-01

由圖1可知,隨著最佳碳源葡萄糖質(zhì)量濃度的增加,M-3-01菌株的解磷能力呈現(xiàn)先增后減的趨勢.當葡萄糖質(zhì)量濃度為0 g/L時,解磷能力幾乎沒有,驗證了碳源是菌株生長的必需元素[10].碳源質(zhì)量濃度控制在合適的范圍內(nèi)時,提高其在培養(yǎng)基中質(zhì)量濃度,有助于菌株的生長.當碳源葡萄糖質(zhì)量濃度升高到5 g/L后,M-3-01菌株溶解磷礦粉的能力顯著增強；繼續(xù)增加葡萄糖質(zhì)量濃度至15 g/L時,M-3-01菌株的解磷能力最強,解磷量為30.21mg/L；當碳源葡萄糖質(zhì)量濃度大于15 g/L后,解磷能力顯著降低.因此選擇15 g/L為最佳碳源葡萄糖的質(zhì)量濃度.

2.3.2 最佳氮源質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響最佳氮源草酸銨質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響見圖2.

圖2 最佳氮源質(zhì)量濃度對磷細菌解磷能力的影響Fig.2 Theeffectofconcentration ofnitrogen sourceson phosphate-solubilizingabilityofphosphorussolution bacteriaM-3-01

由圖2可知,隨著最優(yōu)氮源草酸銨質(zhì)量濃度的增加,M-3-01菌株的解磷能力呈現(xiàn)先增后減的趨勢.草酸銨質(zhì)量濃度為1 g/L時,M-3-01菌株的解磷能力最強,解磷值達到61.02mg/L,顯著高于其余各質(zhì)量濃度.其后,隨著草酸銨質(zhì)量濃度的進一步升高,M-3-01菌株的解磷能力開始下降.因此最佳氮源草酸銨的質(zhì)量濃度選擇1 g/L為最佳.

2.3.3 磷礦粉質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響磷礦粉質(zhì)量濃度對菌株M-3-01解磷能力的影響見圖3.

圖3 磷礦粉質(zhì)量濃度對M-3-01菌株解磷能力的影響Fig.3 The effectsofconcentration ofphosphate rock on the phosphate-solubilizingability ofphosphorussolution bacteriaM-3-01

由圖3可知：磷礦粉質(zhì)量濃度為2.5 g/L時,發(fā)酵上清液中可溶性磷量最高,解磷值達28.19mg/L；磷礦粉質(zhì)量濃度為5 g/L時,已經(jīng)超過了最合適的磷礦粉質(zhì)量濃度,再增加磷礦粉的質(zhì)量濃度,解磷菌的解磷量就顯著減少,甚至完全表現(xiàn)不出任何解磷能力.說明當磷礦粉質(zhì)量濃度達到一定值時,磷礦粉質(zhì)量濃度與解磷菌菌株的解磷能力呈負相關(guān)關(guān)系,與已有研究[10]結(jié)論一致.

2.4 培養(yǎng)基主要影響因子正交試驗

由上述結(jié)果及文獻[10]可知,葡萄糖、草酸銨、磷礦粉、無機鹽是解磷菌株M-3-01培養(yǎng)過程中最重要的因素.將這4種因素作為處理因子,采用L9（34）正交表進行試驗,研究不同質(zhì)量濃度處理組合對M-3-01菌株解磷能力的影響,選出最佳培養(yǎng)基配方.正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表3,正交試驗影響因素直觀圖見圖4.

表3 正交試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.3 The design and resultsoforthogonal test

由表3中的R值可知菌株解磷能力影響因素主次排序為A＞C＞B＞D,即最佳碳源質(zhì)量濃度影響最大,接下來依次是磷礦粉質(zhì)量濃度、最佳氮源草酸銨質(zhì)量濃度和無機鹽質(zhì)量濃度.綜合而言,A2B3C1D2組合最好,即葡萄糖、草酸銨、磷礦粉和無機鹽的質(zhì)量濃度分別為15 g/L、1.5 g/L、2.5 g/L和1.92 g/L,此時M-3-01菌株的解磷能力最好,解磷吸光值達最大值,為3.468.

圖4 正交試驗影響因素直觀圖Fig.4 Factors influenced orthogonal test

由因素直觀圖可知,葡萄糖、草酸銨、磷礦粉和無機鹽的質(zhì)量濃度對M-3-01菌株的解磷能力有較大影響.葡萄糖質(zhì)量濃度為5 g/L、15 g/L時,M-3-01菌株的解磷能力顯著提高；質(zhì)量濃度大于15 g/L時, M-3-01菌株的解磷能力開始下降.草酸銨質(zhì)量濃度為1 g/L時,M-3-01菌株的解磷能力最低,質(zhì)量濃度大于或小于1 g/L時,M-3-01菌株的解磷能力均增強,說明草酸銨質(zhì)量濃度約為1 g/L時,是M-3-01菌株解磷能力的閥值.在試驗設(shè)置的3個磷礦粉質(zhì)量濃度下,隨著磷礦粉質(zhì)量濃度的增加,M-3-01菌株的解磷能力呈遞減趨勢,說明磷礦粉質(zhì)量濃度太大會限制解磷菌的解磷能力.在試驗設(shè)置的3個無機鹽質(zhì)量濃度中,質(zhì)量濃度為1.92 g/L時M-3-01菌株的解磷能力最高.

2.5 培養(yǎng)條件對M-3-01菌株解磷能力影響試驗

2.5.1 起始pH值對M-3-01菌株解磷能力的影響在正交試驗確定了最優(yōu)培養(yǎng)基組合的基礎(chǔ)上,通過調(diào)節(jié)最優(yōu)組合培養(yǎng)基的初始pH值,研究起始pH值對解磷菌M-3-01的解磷能力的變化情況.不同初始pH值對M-3-01菌株解磷能力的影響見圖5.

圖5 初始pH值對M-3-01菌株解磷能力的影響Fig.5 Effectsof initialpH ofmedium on the phosphate-solubilizingabilityofstrain M-3-01

由圖5可知,不同的初始pH值對M-3-01菌株解磷能力的影響比較明顯.在整個培養(yǎng)過程中,初始pH值為3.0～6.0時的解磷效果變化較小,一直處于穩(wěn)步上升狀態(tài),說明M-3-01菌株在強酸的條件下也能旺盛生長；在初始pH值為6.0時,M-3-01菌株表現(xiàn)出較強的解磷活性,解磷量最大,溶解磷量達54.04mg/L；當pH值高于6.0時,M-3-01菌株的解磷能力開始下降.因此,初始pH值在5.0～6.0較為適合.培養(yǎng)基的pH值會影響培養(yǎng)基中某些營養(yǎng)物和中間代謝產(chǎn)物的解離,還會影響酶分子和底物分子的帶電狀況,從而影響營養(yǎng)物質(zhì)的吸收與利用、酶的合成和代謝產(chǎn)物的分泌.因此,培養(yǎng)基的pH值太高或太低都不適于菌體的生長和有利于代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生.針對這一情況,可以在培養(yǎng)基中加入較高質(zhì)量濃度的緩沖液,以避免培養(yǎng)過程中搖瓶內(nèi)培養(yǎng)基pH值產(chǎn)生劇烈變化.從圖5可以看出,解磷菌M-3-01菌株的最適初始pH值為6.0. 2.5.2轉(zhuǎn)速對M-3-01菌株解磷能力的影響在最適初始pH值為6.0的條件下,將供試菌株M-3-01分別接種于優(yōu)化的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,于不同轉(zhuǎn)速恒溫（37℃）搖床中培養(yǎng)3 d.不同轉(zhuǎn)速對M-3-01菌株解磷能力的影響見圖6.

圖6 轉(zhuǎn)速對M-3-01菌株解磷能力的影響Fig.6 Effectsofspeed on the phosphate-solubilizingability ofstrain M-3-01

由圖6可知,轉(zhuǎn)速會明顯影響解磷菌M-3-01菌株對難溶性磷的溶解效果.在培養(yǎng)條件的搖床轉(zhuǎn)速設(shè)置為150 r/min時,M-3-01菌株表現(xiàn)出較強的解磷活力,解磷量達59.84 mg/L；在培養(yǎng)轉(zhuǎn)速設(shè)置為0 r/min時,M-3-01菌株的解磷能力最差.這充分說明轉(zhuǎn)速條件會直接影響解磷菌M-3-01菌株的生長.解磷菌M-3-01菌株在一定的轉(zhuǎn)速范圍值內(nèi)培養(yǎng),表現(xiàn)出的解磷活性與轉(zhuǎn)速成正比,當轉(zhuǎn)速超過一定值時,會限制解磷菌代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,反而抑制了M-3-01菌株溶解磷礦粉的能力.

2.5.3 接種量對M-3-01菌株解磷能力影響根據(jù)方法1.2.3,在其他條件相同的情況下,接種量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、4.0%、7.0%、10.0%,培養(yǎng)3 d后測定培養(yǎng)基上清濾液可溶性磷,探討不同接種量對M-3-01菌株解磷能力的影響.結(jié)果見圖7.

圖7 接種量對M-3-01菌株解磷能力的影響Fig.7 Effectsof inoculation quantity on the phosphate-solubilizingability ofstrain M-3-01

由圖7可知,接菌量對M-3-01菌株的解磷活性能力影響顯著.接種量為0.5%、1.0%、1.5%時,培養(yǎng)3 d后,發(fā)酵液上清液可溶性磷量在增長,但可溶性磷量差別不大；接種量為2.0%時,M-3-01菌株解磷活性最強,解磷值為55.68mg/L；當接種量大于2%時,M-3-01菌株解磷能力反而有所下降.一般接入較大量的菌液可以縮短菌體的生長峰值期,明顯縮短發(fā)酵時間,但過量接菌反而會因菌體過多產(chǎn)生較多的代謝廢物,抑制菌株的生長或活性產(chǎn)物代謝.因此考慮到實際需要,解磷菌M-3-01菌株發(fā)酵的適合接種量確定為2.0%.

2.5 驗證實驗

綜合參考前面優(yōu)化培養(yǎng)基單因素試驗及正交試驗的結(jié)果,最終確定以葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L,草酸銨質(zhì)量濃度為1.5 g/L,磷礦粉質(zhì)量濃度為2.5 g/L,無機鹽質(zhì)量濃度為1.92 g/L,起始pH值為6.0,轉(zhuǎn)速為150 r/min,接種量為2.0%作為M-3-01菌的優(yōu)化培養(yǎng)基,標記為T.以無機磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對照（CK）,進行驗證試驗,37℃培養(yǎng)3 d,測其上清液有效磷含量.培養(yǎng)基發(fā)酵液及鉬銻顯色效果見圖8,驗證實驗結(jié)果見表4.

圖8 培養(yǎng)基發(fā)酵液及鉬銻顯色效果圖Fig.8 The pictureofvalidation test

由圖8可知,優(yōu)化培養(yǎng)基比對照培養(yǎng)基的發(fā)酵效果明顯要好.優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵液顏色發(fā)白,稠度比對照高；對照培養(yǎng)基發(fā)酵液顏色清,磷礦粉可見.發(fā)酵液進行可溶性磷含量測定,鉬銻顯色結(jié)果表明,優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵液顯色后顏色明顯較對照培養(yǎng)基發(fā)酵液顏色深.

表4 驗證實驗結(jié)果Tab.4 The test resultsofverification

由表4的驗證實驗結(jié)果可知,優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度達88.64mg/L,是對照培養(yǎng)基發(fā)酵液中有效磷質(zhì)量濃度的2.34倍.通過測量培養(yǎng)基發(fā)酵液的活菌數(shù)OD600可知,優(yōu)化培養(yǎng)基發(fā)酵液中有效活菌數(shù)是對照培養(yǎng)基發(fā)酵液的1.41倍.

3 結(jié)論與討論

微生物的正常生長繁殖不僅需要充足的碳、氮源,還需要磷、鉀、鎂等無機鹽,部分微生物還需要特殊的生長因子.解磷菌溶解難溶性磷酸鹽的能力主要受菌體自身基因特性的影響.研究表明,對解磷菌枯草芽孢桿菌X1055進行紫外線誘變選育,篩選出的優(yōu)良解磷突變株,其解磷量達5.22mg/L,解磷能力較原菌株提高17.8%[11].解磷能力還與培養(yǎng)條件有關(guān),虞偉斌[12]、李福后等[13]研究表明，碳源、氮源的種類,培養(yǎng)條件等都是影響解磷菌溶解難溶性磷酸鹽能力的因素.本研究通過單因素試驗與正交試驗,確定了解磷細菌M-3-01溶解磷礦粉能力的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件.高效解磷細菌M-3-01的最終發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為：葡萄糖質(zhì)量濃度15 g/L,草酸銨質(zhì)量濃度1.5 g/L,磷礦粉質(zhì)量濃度2.5 g/L,無機鹽質(zhì)量濃度1.92 g/L,接菌量2.0%,pH值為6.0,轉(zhuǎn)速為150 r/min,培養(yǎng)溫度37℃.

供試菌株M-3-01的解磷能力受到供給氮源種類及質(zhì)量濃度影響明顯,可能與氮素參與合成微生物某些活性代謝物質(zhì)有關(guān).過高或過低的氮源質(zhì)量濃度都不利于M-3-01菌株溶解磷礦粉.磷礦粉質(zhì)量濃度對解磷細菌的解磷能力影響很大,磷礦粉質(zhì)量濃度越大,M-3-01菌株溶解磷的效果越不明顯.有研究表明,不同青霉菌株對培養(yǎng)基中磷礦粉用量的敏感程度不同[14],且與氮源有關(guān).磷礦粉質(zhì)量濃度超過20 g/L時,溶磷量大幅度降低[15].本研究結(jié)果與上述結(jié)論基本一致.

覃麗金等[16]對無磷細菌G12-6（Bacillusspp.）進行培養(yǎng)條件優(yōu)化,當?shù)礊橄跛徕?、碳源為蔗糖時,解磷活性表現(xiàn)最好.本研究得到的最優(yōu)培養(yǎng)基中碳氮源較覃麗金等研究的結(jié)果有所不同,這可能是菌株屬性的差異所致.本研究通過最優(yōu)的配方組合進行培養(yǎng)條件優(yōu)化,結(jié)果表明,M-3-01菌株在不同的培養(yǎng)環(huán)境下,解磷活性均有不同程度的變化.M-3-01菌株在不同起始pH值條件下均能較好地生長,說明其對pH的適應(yīng)性很強,當pH值為6.0時,M-3-01菌株解磷活性最強,表明代表菌株M-3-01表現(xiàn)解磷活性的最適pH值為6.0；菌株在不同轉(zhuǎn)速條件搖床培育時,解磷活性變化不明顯；M-3-01菌株解磷活性在接菌量為2.0%時達到峰值.

本研究對M-3-01菌株的培養(yǎng)基組合進行優(yōu)化并確定了適宜條件,今后將對中試發(fā)酵罐發(fā)酵條件應(yīng)用進行研究,以確定M-3-01液體菌肥生產(chǎn)工藝,從而為其用于高效微生物菌肥的生產(chǎn)提供理論參考.

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Optim ization of fermentation process of phosphate-solubilizing bacteria M-3-01（Serratia nematodiphila）

KE Chunliang1,LIShujuan2,DUAN Yajie3
（1.Guangdong University ofPetrochemical Technology,Maoming525000,China；2.Maoming No.17 Middle School,Maoming 525000,China；3.South SubtropicalCrops Research Institute,Chinese Academy of TropicalAgricultural Sciences,Zhanjiang524091,China）

The single factor testwas used to study the effect of three kinds of key impact factors,carbon,nitrogen and ground phosphorite and their concentrations on the phosphorus dissolving efficiency of phosphate-solubilizing bacteria M-3-01,and the formula process of M-3-01 was optimized by orthogonal test in L9（34）.The results showed that the final optimization result were：15 g/L of glucose,1.5 g/L of ammonium oxalate,2.5 g/L of phosphate rock powder,1.92 g/L of inorganic salt,2%of inoculation quantity,6.0 of pH,150 r/min and 37℃.After formula optimization,its formula were verified experiment,which optimized the set of effective phosphorus content up to 88.64 mg/L,which was 2.34 times that of CK effective phosphorus content.The consequence provides convincing data support for the formula to be applied in actual production.

phosphate-solubilizing bacteria；orthogonal test；medium optimization

Q5

A

1008-7516（2017）03-0006-10

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.03.002

2007-04-20

海南省自然科學(xué)基金面上項目（20163110）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費（1630062015010）

柯春亮（1988―）,男,廣東茂名人,碩士,助教.主要從事生物防控研究.

段雅婕（1983―）,女,山西臨汾人,碩士,助理研究員.主要從事香蕉病害的生物防治研究.