費(fèi)菜總黃酮分離純化方法研究

薛志忠 楊雅華 張國(guó)新

摘要 [目的]開發(fā)高純度費(fèi)菜總黃酮的分離純化工藝。[方法]以大孔樹脂為載體，對(duì)上樣量及層析條件進(jìn)行優(yōu)化，再進(jìn)一步采用結(jié)晶的方法進(jìn)行純化。[結(jié)果]選用聚合物納米微球PS RPC-300作為最佳層析填料，洗脫速度為5 mL/min，洗脫劑為70%乙醇，上樣量為5.0 g/kg填料，結(jié)晶溶劑為丙酮；在此優(yōu)化條件下所得產(chǎn)品的純度為95.1%。[結(jié)論]此分離純化方法簡(jiǎn)便可靠，分離效果好。

關(guān)鍵詞 費(fèi)菜；總黃酮；聚合物納米微球；分離純化

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）18-0113-02

Abstract [Objective] The research aimed to develop the separation and purification processes of highpurity total flavonoids from Sedum aizoon L.[Method]With the macroporous resin as the carrier，the loading volume and the chromatographic conditions were optimized，and then further purified by crystallization method.[Result]Type of PS RPC-300 nanoscale polymer particles was selected as the best chromatography filler.The optimal conditions were as follows：the elution speed was 5.0 mL/min，70% ethanol was used as the eluant，the amount of sample was 5 g/kg filter，and acetone was used as the crystallization solvent.The purity of the final product was 95.1% under the optimal conditions.[Conclusion]The separation and purification method is simple and reliable，and the separation effect is good.

Key words Sedum aizoon L.；Total flavonoids；Polymer nanospheres；Separation and purification

費(fèi)菜（Sedum aizoon L.）為景天科景天屬多年生草本植物，適應(yīng)性強(qiáng)，分布廣泛，在我國(guó)陜西、四川、江蘇、湖北、山東、寧夏、甘肅、河北等地均有分布[1]。它是一種藥食兼用植物，嫩莖葉富含各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，無(wú)任何異味，即可鮮食又可烹調(diào)；其根及全草富含生物堿、谷甾醇、齊墩果酸、景慶庚糖、馬栗樹皮素、楊梅樹皮苷、金絲桃苷、槲皮素、山奈酚、楊梅黃素、3-葡萄糖苷等[2]，對(duì)于提高人體免疫力、預(yù)防和治療心腦血管疾病具有較好的效果。

目前，費(fèi)菜提取物已在食品行業(yè)、醫(yī)藥及化妝品行業(yè)得到廣泛應(yīng)用[3-4]。但關(guān)于高純度的費(fèi)菜總黃酮提取物純化分離的文獻(xiàn)報(bào)道較少，而且已有的制備提取方法存在收率不高、純度偏低的缺點(diǎn)[5-6]。因此，筆者以費(fèi)菜總黃酮粗提物為試材，采用聚合物納米微球作為層析填料，對(duì)其進(jìn)行層析純化[7]，得到了純度較高的總黃酮，以期為費(fèi)菜提取物的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材

費(fèi)菜總黃酮粗提物（自制）；蘆丁對(duì)照品（中國(guó)生物制品檢定所）。聚合物納米微球（蘇州納微科技公司）；AB-8大孔樹脂（安徽三星科技公司）；201大孔樹脂（昆山嘉之美）；去離子水（自制）；乙腈（色譜純，Thermo公司）；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 中壓層析系統(tǒng)（瑞士Buchi公司）；高效液相色譜儀（996檢測(cè)器，515泵，Waters公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（Loborata 4000，Heidolph公司）。

1.3 方法

1.3.1 高效液相檢測(cè)條件。

色譜柱為Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水-醋酸體積比（48∶50∶2）；流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制備。

精密稱取蘆丁對(duì)照品12.6 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溫?zé)崛芙?，并稀釋至刻度搖勻備用。

1.3.3 吸附樹脂的篩選。分別用型號(hào)為PS RPC-300聚合物納米微球、AB-8、201大孔樹脂裝柱，取100 g備選樹脂用0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡2 h，水洗至中性，濕法裝柱，用去離子水平衡系統(tǒng)。取0.5 g費(fèi)菜總黃酮粗提物（純度為30%），用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于層析柱，用一倍柱體積的去離子水進(jìn)行洗滌處理，洗滌后再用不同濃度的乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫處理，中壓監(jiān)控收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測(cè)分離效果，每組試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)取平均值，以備選大孔樹脂對(duì)總黃酮的洗脫收率進(jìn)行篩選。

1.3.4 解吸液乙醇濃度的確定。

取0.5 g費(fèi)菜總黃酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于100 g聚合物納米微球PS RPC-300樹脂柱上，用一倍柱體積去離子水進(jìn)行洗滌處理，然后分別采用50%、60%、70%、80%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，分管收集乙醇洗脫液，通過(guò)中壓層析色譜檢測(cè)器在線監(jiān)測(cè)，以觀察總黃酮解吸狀況。

1.3.5 解吸液流速的選擇。

取0.5 g費(fèi)菜總黃酮粗提物，用乙醇完全溶解，然后均勻地加樣于100 g聚合物納米微球PS RPC-300樹脂柱上，用一倍柱體積去離子水進(jìn)行洗滌處理，用70%乙醇作為洗脫劑，然后分別以3、4、5、6、7 mL/min的洗脫速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測(cè)分離效果，將總黃酮單組分接收液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.3.6 上樣量的確定。

分別按照1 kg聚合物納米微球PS RPC-300加載2、3、5、8、10 g費(fèi)菜總黃酮粗提物，用一倍柱體積去離子水進(jìn)行洗滌處理，然后70%乙醇作為洗脫劑，以5 mL/min的洗脫速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，每管10 mL。高效液相色譜儀檢測(cè)分離效果，將總黃酮單組分接收液合并，計(jì)算洗脫收率。

1.3.7 結(jié)晶。

將費(fèi)菜總黃酮單組分的洗脫液合并，減壓濃縮處理，再加入適量的丙酮、乙酸乙酯、異丙醇等不同溶劑，抽濾，干燥，得到費(fèi)菜總黃酮結(jié)晶粉，高效液相色譜儀檢測(cè)各結(jié)晶粉含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置10 mL容量瓶中加甲醇定容至刻度，搖勻，進(jìn)樣量為10 μL，用液相色譜儀測(cè)定，得出回歸方程為Y=17 714X-89.686（r=0.999 4），表明總黃酮在0.005 04～0.050 40 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.2 大孔樹脂型號(hào)的確定

由圖1可知，PS RPC-300聚合物納米微球在乙醇濃度為50%、60%、70%、80%時(shí)對(duì)費(fèi)菜總黃酮的洗脫收率均高于AB-8、201這2種樹脂；并且通過(guò)高效液相色譜儀檢測(cè)，費(fèi)菜總黃酮單組分的分離效果也高于AB-8、201 這2種樹脂，因此該試驗(yàn)層析填料選擇PS RPC-300聚合物納米微球。

2.3 解吸液乙醇濃度的確定

由表1可知，用50%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，洗脫率最低，僅有50.6%；用60%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，解吸拖尾較為嚴(yán)重且解吸率偏低；用80%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，洗脫速度過(guò)快，總黃酮單組分不能有效分離；用70%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，分離費(fèi)菜總黃酮效果好，單組分可以有效洗脫，色譜純度最高，為91.2%。因此，最佳洗脫條件為：用70%乙醇以5 mL/min的速度進(jìn)行洗脫，中壓監(jiān)測(cè)分段收集洗脫液。

2.4 解吸液流速的選擇 由圖2可知，70%乙醇洗脫速度逐步增加時(shí)洗脫收率也隨之增加，但當(dāng)超過(guò)5 mL/min時(shí)，費(fèi)菜總黃酮洗脫過(guò)快，單組分夾雜雜質(zhì)。因此，選擇洗脫速度為5 mL/min。

2.5 上樣量的確定

由圖3可知，樣品上樣量直接影響著層析收率。當(dāng)費(fèi)菜總黃酮粗提物上樣量在2～10 g/kg時(shí)，總黃酮層析收率出現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。當(dāng)費(fèi)菜總黃酮上樣量為2 g/kg時(shí)，樣品在解吸過(guò)程中分散較為嚴(yán)重，層析收率最低，僅為40.0%左右；隨著總黃酮上樣量的增加，層析收率有所提高，當(dāng)達(dá)到5 g/kg時(shí)，層析收率達(dá)到最大值，為78.7%；當(dāng)上樣量再加大時(shí)，出現(xiàn)過(guò)載現(xiàn)象，費(fèi)菜總黃酮單組分重疊，層析效果減弱，洗脫收率出現(xiàn)顯著下降。因此，篩選出適宜上樣量是保證最佳層析收率的基礎(chǔ)，在保證分離度的情況下，上樣量為5 g/kg時(shí)，層析收率最高。

2.6 結(jié)晶

由表2可知，丙酮、乙酸乙酯、異丙醇3種結(jié)晶溶劑對(duì)費(fèi)菜總黃酮單組分精粉收率、純度的影響差異較大，其中丙酮的結(jié)晶收率偏低，為57.6%，但其能去除部分雜質(zhì)提高純度，純度高達(dá)95.1%。因此，綜合考慮選用丙酮作為結(jié)晶溶劑。

3 結(jié)論

以費(fèi)菜總黃酮粗提物為試材，采用聚合物納米微球作為層析填料，對(duì)其進(jìn)行層析純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)分離純化方法是：選用聚合物納米微球PS RPC-300作為最佳層析填料，70%乙醇作為洗脫劑分離純化，洗脫速度為5 mL/min，上樣量為5 g/kg填料，結(jié)晶溶劑為丙酮；在此優(yōu)化條件下能夠得到含量為95.1%的總黃酮，總收率為57.6%。該分離純化方法簡(jiǎn)便可靠，不但簡(jiǎn)化了提取工藝，而且提高了成品收率，為費(fèi)菜提取物的進(jìn)一步研究提供參考。

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