比色法測(cè)定泰樂(lè)菌素發(fā)酵液油含量的研究

高宏偉 蘭秀娟 牛春

摘要[目的]探討一種泰樂(lè)菌素發(fā)酵液油含量測(cè)定方法。[方法]利用比色法測(cè)定泰樂(lè)菌素發(fā)酵液中的油含量。[結(jié)果]該法在油含量為0.6～6.6 g/L時(shí)呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 8），平均回收率為106.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.02%。[結(jié)論]該法精密度好、準(zhǔn)確性高，可用于泰樂(lè)菌素發(fā)酵液油含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞泰樂(lè)菌素；比色法；油含量

中圖分類號(hào)TQ92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）14-0006-02

Abstract[Objective] The aim was to explore a colorimetric method for determination of tylosin oil content. [Method] We determined tylosin fermentation broth oil content by colorimetric method. [Result] The method had a good linear relationship（R2=0.999 8） when the oil content was 0.6-6.6 g/L； the average recovery was 106.7%； and the relative standard deviation was 1.02%. [Conclusion] The improved colorimetric method has good precision and high accuracy， so it can be used for determination of tylosin fermentation broth oil content.

Key wordsTylosin；Colorimetric method；Oil content

泰樂(lè)菌素的發(fā)酵以油為主要碳源，在發(fā)酵過(guò)程中主要以補(bǔ)油來(lái)滿足菌體對(duì)碳源的需求，油中的油酸、亞油酸經(jīng)甲基化形成甲基油酸，它是泰樂(lè)菌素生物合成的前體物質(zhì)，發(fā)酵液中油含量的高低對(duì)菌體的呼吸代謝和產(chǎn)物的合成有重要影響，含量低，不利于產(chǎn)物的合成，含量高，菌體不能完全利用，產(chǎn)生脂肪酸積累，pH下降，影響代謝[1]。因此，必須嚴(yán)格控制發(fā)酵液中的油含量。目前，泰樂(lè)菌素發(fā)酵中主要通過(guò)乙醚提取法測(cè)定發(fā)酵液中脂肪含量的方法控制油含量，該法測(cè)定結(jié)果受人為因素的影響大，測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確，不能很好地指導(dǎo)補(bǔ)油，另外，乙醚極易揮發(fā)、易燃易爆、毒性大，對(duì)人體有麻醉作用，污染環(huán)境[2]。

比色法是一種能夠快速測(cè)定游離脂肪酸含量的有效方法，曾兆國(guó)等[3]利用該法測(cè)定莫能菌素發(fā)酵液中油含量，取得了很好的效果。劉永樂(lè)等[4]用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中液體脂肪的含量，其結(jié)果準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)便、快速。筆者對(duì)該法進(jìn)行了一定的改進(jìn)，并測(cè)定了泰樂(lè)菌素發(fā)酵液中的油含量，旨在為泰樂(lè)菌素發(fā)酵液中油含量的嚴(yán)格控制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑。油酸、異辛烷、吡啶、醋酸銅、氫氧化鉀、無(wú)水乙醇、鹽酸均為分析純，油（發(fā)酵用）。

1.1.2主要儀器。TE612-L電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；MTV-100多管漩渦混合儀，上海之信儀器有限公司；TD25B低速自動(dòng)平衡離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.2方法

1.2.1試劑的配制。

1.2.1.10.25 mol/L乙醇制KOH溶液的制備。取14.0 g 氫氧化鉀置于燒杯中，加適量無(wú)水乙醇溶解并定容至1 000 mL。

1.2.1.25.0%醋酸銅溶液的制備。取5.0 g醋酸銅，用純化水溶解，過(guò)濾，并定容至100 mL，搖勻后，用吡啶調(diào)節(jié)pH為6.1～6.4。

1.2.1.33.0 mol/L鹽酸溶液的制備。在1 000 mL燒杯中加入752 mL蒸餾水，再緩慢加入248 mL鹽酸，攪拌，冷卻。

1.2.1.41.5%油酸基準(zhǔn)液的配制。稱取1.5 g油酸于100 mL容量瓶中，用異辛烷溶解并定容，搖勻。

1.2.2脂肪酸測(cè)定流程。試樣乙醇KOH溶液水解→定容無(wú)水乙醇離心HCl還原醋酸銅顯色→測(cè)定。

1.2.3油酸基準(zhǔn)液吸收曲線的測(cè)定。取11.0 mL 1.5%油酸基準(zhǔn)液于25 mL 容量瓶中，用異辛烷定容，搖勻。吸取5.0 mL于25 mL比色管中，加入1.0 mL醋酸銅溶液，旋渦振蕩90 s后，靜置20 s，以異辛烷為空白，在650～750 nm波長(zhǎng)內(nèi)每隔10 nm測(cè)量1次，在最大吸收處每隔5 nm測(cè)1次，以波長(zhǎng)λ為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制吸收曲線。

1.2.4油酸基準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。分別取1.5%油酸基準(zhǔn)液1.00、3.00、5.00、7.00、9.00、11.00 mL置于25 mL 容量瓶中，用異辛烷定容，搖勻，得到0.60、1.80、3.00、4.20、5.40、6.60 g/L系列濃度油酸溶液。每種濃度的溶液各吸取5.00 mL于25 mL比色管中，加入1.00 mL醋酸銅溶液，旋渦振蕩90 s，靜置20 s，以異辛烷為空白，測(cè)定有機(jī)系OD值，以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，油酸基準(zhǔn)液濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5發(fā)酵液油含量測(cè)定。稱取1.5～2.5 g發(fā)酵液于25 mL比色管中，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液搖勻，于60～80 ℃水浴中水解20 min（每隔5 min振蕩1 min），水解完全，冷卻后，用無(wú)水乙醇定容至10 mL，搖勻后3 000 r/min離心10 min，取用無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋后的上清液5.0 mL于25 mL比色管中，加3 mol/L鹽酸溶液10.0 mL，搖勻，再加異辛烷5.0 mL，充分振蕩提取5 min，靜置1 min，取上層有機(jī)溶液2.0 mL于10 mL比色管中，加3.0 mL異辛烷，混勻后加1.0 mL醋酸銅顯色劑，振蕩90 s，靜置20 s，用異辛烷做空白測(cè)定有機(jī)系OD值，以標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程油含量。

油含量（g/100 g）=（5.396 6A+0.004 3）×稀釋倍數(shù)1V×A

式中，V為吸取萃取上清液體積（mL）；A為稱取發(fā)酵液的質(zhì)量（g）。

1.2.6水解時(shí)間的測(cè)定。稱取0.30 g油加水至2.00 g，加入6 mL 0.25 mol/L乙醇制KOH溶液，于70 ℃水解5、10、15、20、25、30 min，按“1.2.4”的方法進(jìn)行測(cè)定，以水解時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作圖。

2結(jié)果與分析

2.1油酸基準(zhǔn)液吸收曲線由圖1可知，當(dāng)波長(zhǎng)λ為700 nm時(shí)，達(dá)到最大吸收。因此，可確定最大吸收波長(zhǎng)為700 nm。

2.2油酸基準(zhǔn)液標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖2可知，回歸方程為y=5.396 6x+0.004 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。結(jié)果表明，油含量在0.6～6.6 g/L時(shí)有良好的線性關(guān)系。

2.3水解時(shí)間由圖3可知，當(dāng)水解時(shí)間達(dá)20 min時(shí)，吸光值達(dá)到最大且基本不變。

2.4精密度對(duì)同一樣品按“1.2.5”的方法測(cè)定5個(gè)平行樣。結(jié)果表明，該方法有較高的精密度和重復(fù)性，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.02%。

2.5加樣回收率分別稱取發(fā)酵液1.5～2.5 g于6支25 mL比色管中，在其中的5支比色管中加入0.1 g油，按“1.2.5”的方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。計(jì)算公式：加樣回收率=（A-B）/C×100%，其中A為加油樣油含量（mg/g）；B為發(fā)酵液油含量（mg/g）；C為加油量/發(fā)酵液重量（mg/g）。由表1可知，該方法有較高的回收率，平均加樣回收率為106.7%。

3結(jié)論

采用分光光度法測(cè)定發(fā)酵液中的殘油含量具有以下特點(diǎn)：①試驗(yàn)所需檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單。②靈敏度高，可檢測(cè)0.6～6.6 g/L的油含量。③精密度好，準(zhǔn)確度高，樣品回收率高。④分析速度快，能夠及時(shí)、快速、準(zhǔn)確地反映出發(fā)酵液中的油含量，為泰樂(lè)菌素發(fā)酵過(guò)程中油的控制提供參數(shù)，一般可在1.5 h內(nèi)完成。因此，該測(cè)定方法可用于泰樂(lè)菌素發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中油含量的測(cè)定[5-6]。

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