HPLC法測定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸的含量

付林+古銳+澤翁擁忠+天喜格勒?í?

【摘要】目的： 建立高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測定牛蒡中牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸含量的方法，比較3種成分在不同部位以及牛蒡子不同炒制時(shí)間的含量。方法：采用Welchrom C18柱（5μm，46mm×250mm）；流動(dòng)相為甲醇-01%磷酸水梯度洗脫；流速為10mL/min；檢測波長為280nm；柱溫為30℃。結(jié)果： 3種成分的進(jìn)樣量分別在42844～514128μg，03254～39048μg，03072～36864μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，平均加樣回收率分別為9964%，10081%，9792%，RSD值均小于15%；牛蒡葉和牛蒡根中幾乎沒有牛蒡子苷和牛蒡子苷元；牛蒡子所有炒制品與生品比較，三者的總含量均下降，炒制時(shí)間從10～40min時(shí)，牛蒡子苷、綠原酸的含量下降，牛蒡子苷元的含量增加。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確，精密度、重復(fù)性良好，可為牛蒡子質(zhì)量控制提供依據(jù)，不同部位、炒制時(shí)間結(jié)果可以為牛蒡綜合開發(fā)提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】HPLC；牛蒡子苷；牛蒡子苷元；綠原酸；含量測定

【中圖分類號(hào)】R932【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）11-0039-04

Simultaneous Determinate the Content of Arctiin，Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L.by HPLC

FU Lin1GU Rui2ZEWENG Yongzhong2TIANXI Gele3

1.College of Pharmacy， Chengdu University of TCM， Chengdu 611137，China；2College of Ethnic Medicine， Chengdu University of TCM， Chengdu 611137，China；3.Maerkang L ye Biotechnology Development Limited Liability Company， Maerkang 624000，China

Objective To establish a HPLC method for the content determination of Arctiin ， Arctigenin and Chlorogenic acid in Arctium lappa L.and to make a comparison of content of this three components among different parts as well different time that ArctiiFructus fried. Methods The separation was carried on Welchrom C18（5μm ， 46mm×250mm）column with mobile phase consisted of acetonitrile-01% phosphoric（gradient elution） at the flow rate of 10mL·min-1.The detection wavelength was set at 280nm.The column temperature was 30℃.Results The linear range were 42844～514128μg for Arctiin， 03254～39048μg for Arctigenin and 03072～36864μg for Chlorogenic acid. Average recovery rates were 9964%，10081%，9792%， with RSD less than 15%. There was little Arctiin and Arctigenin both in Arctium lappa leaves and Arctium lappa root.Compared with ArctiiFructus that wasnt fried， total content of three components in fried ArctiiFructus decreased. Content of Arctiin and Chlorogenic acid decreased while Arctigenin increased when frying time changed from 10 minutes to 40 minutes.Conclusion The HPLC method is accurate， reliable and reproducible to analyze three components in Arctium lappa L ， which can provide the scientific basis for formulating the quality standard of ArctiiFructus.Results of different parts as well different time that ArctiiFructus fried can provide the scientific basis for comprehensive development of Arctium lappa L.

HPLC； Arctiin ； Arctigenin ； Chlorogenicacid ； Content determination

牛蒡子為菊科二年生草本牛蒡Arctium lappa L的干燥成熟果實(shí)，由于藥用價(jià)值較高，全國各地亦有普遍栽培[1]。其可生用或炒用（炒牛蒡子），用時(shí)搗碎，其藥性辛、苦、寒，歸肺、胃經(jīng)，具有疏散風(fēng)熱、利咽透疹、解毒消腫的功效，屬于發(fā)散風(fēng)熱藥[2]。現(xiàn)代研究表明，牛蒡子具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖等多種藥理作用，而其主要含牛蒡子苷、牛蒡子苷元等木脂素類[3]，綠原酸等有機(jī)酸類和黃酮類等成分[4]。牛蒡根主要含硫炔類、多炔類、多酚類、揮發(fā)油、菊糖以及氨基酸等化學(xué)成分，具有抗菌、抗突變、防癌、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂和免疫調(diào)節(jié)等藥理作用[5]。牛蒡葉主要含黃酮類、多糖、多酚類化合物，具有一定的抗氧化、抑菌作用[6]。此外，牛蒡還是藏藥—齊嵩的來源，被各地藏醫(yī)所用，而《晶珠本草》記載，齊嵩有破痞塊，除結(jié)石，舒脈之效[7]。研究采用HPLC法測定牛蒡中有效成分牛蒡子苷、牛蒡子苷元、綠原酸的含量，并比較3種成分在牛蒡不同部位以及牛蒡子不同炒制時(shí)間的含量，為牛蒡的質(zhì)量控制和綜合開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1儀器與材料

11儀器LC-2010A島津高效液相色譜儀；SB-52000超聲波清洗器（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司）；DZKW-S-4電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；ULUP-1-10T型超純水機(jī)（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）。

12材料牛蒡子苷對(duì)照品（批號(hào)：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>985%）；牛蒡子苷元對(duì)照品（批號(hào)：MUST-15093011，成都曼斯特生物科技有限公司，含量：9962%）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：PS11111001，成都普思生物科技股份有限公司，含量>985%）；甲醇（色譜純），甲醇（分析純），水為超純水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21對(duì)照品溶液的制備稱取綠原酸對(duì)照品001536g、牛蒡子苷對(duì)照品021422g、牛蒡子苷元對(duì)照品001627g，共同置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，制備成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。則綠原酸的濃度為03072mg/mL，牛蒡子苷的濃度為42844mg/mL，牛蒡子苷元的濃度為03254mg/mL。

22供試品溶液的制備取牛蒡子粉末（過60目篩）約05g，精密稱定，置50mL容量瓶中，加甲醇約45mL，超聲提取30min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

23[JP3]色譜條件色譜柱：Welchrom C18柱（5μm，46mm×250mm，柱號(hào) W1021170）；[JP]流動(dòng)相為甲醇-01%磷酸水（梯度洗脫：0～3min，30%甲醇；3～10min，30%～50%甲醇；10～30min，50%～65%甲醇）；流速為10mL/min；檢測波長為280nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10μL。

24系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按照上述色譜條件進(jìn)行分析，各對(duì)照品峰理論塔板數(shù)均大于5000，相鄰兩峰的分離度R大于15，系統(tǒng)適用性良好，各組分的色譜峰分離良好，色譜圖見圖1。

25方法學(xué)考察

251線性關(guān)系考察分別精密吸取“21”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液10、20、40、80、100、120μL，按照“23”項(xiàng)下的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。表明3種成分在線性范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系；強(qiáng)制過原點(diǎn)后，r值均能達(dá)到09999，可采用外表一點(diǎn)法計(jì)算該3種成分的含量。

252穩(wěn)定性試驗(yàn)取“21”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別在0、2、6、8、24h時(shí)按照“23”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄3種成分各自的峰面積，計(jì)算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為085%，034%，097%，表明混合對(duì)照品儲(chǔ)備液在24h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性。

253精密度試驗(yàn)精密量取“21”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5μL，按照“23”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各自峰面積，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算相應(yīng)的RSD值，得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為119%、025%、146%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

254重復(fù)性試驗(yàn)取同一批次的牛蒡子粉末（過60目篩）各05g，按“22”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按照“23”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，計(jì)算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分含量的RSD分別為076%、110%、069%。結(jié)果表明該試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

255耐用性試驗(yàn)取制備的同1份供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、24h時(shí)，按照“23”項(xiàng)下色譜條件，依次進(jìn)樣分析，記錄3種成分各自的峰面積，計(jì)算得到綠原酸、牛蒡子苷、牛蒡子苷元3種成分峰面積的RSD分別為149%、136%、143%，結(jié)果表明該供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

256加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的牛蒡子粉末（綠原酸為0616%，牛蒡子苷為11000%，牛蒡子苷元為0887%，過60目篩）6份，每份約02g，精密稱定。并精密加入“21”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，使其與樣品中各成分含量相同或相近。按“22”項(xiàng)下方法制備加樣溶液，按照“23”項(xiàng)下色譜條件，分別進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2～4。表明該試驗(yàn)方法準(zhǔn)確度良好。

26含量測定取13批不同來源的牛蒡子、葉、根樣品，打粉，過60目篩；另從批號(hào)為“馬爾康”牛蒡子樣品中取出部分，將其分為4份，進(jìn)行炒制，炒制時(shí)間分別為10、20、30、40min，打粉，過60目篩。合計(jì)樣品批數(shù)為17批。分別從每1份粉末中稱取約05g，按“22”項(xiàng)下方法制得相應(yīng)供試品溶液，并按照“23”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測定，各成分含量見表5。

3討論

本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)提取方法、提取溶劑種類和濃度、提取時(shí)間等因素進(jìn)行了考察。比較了超聲30min，超聲60min，回流30min3種方法，結(jié)果表明，超聲30min時(shí)牛蒡子中3種成分總含量最高，而回流提取操作不便，結(jié)果偏差較大；比較了50%甲醇、甲醇、50%乙醇、無水乙醇4種提取溶劑。結(jié)果表明，用甲醇提取時(shí)，3種成分總含量最高；比較了超聲10、20、30、40、60min5個(gè)提取時(shí)間，結(jié)果表明，超聲30min時(shí)，3種成分總含量最高。因此，本實(shí)驗(yàn)以甲醇為提取溶劑，超聲30min為提取方法。

流動(dòng)相的選擇最初建立在文獻(xiàn)[8]的基礎(chǔ)上，以甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰型不好且分離不完全，因此改為甲醇-01%磷酸水，調(diào)整出“23”項(xiàng)下的梯度。用PDA檢測器在200～400nm波長進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)綠原酸在326nm處有最大吸收，牛蒡子苷在277nm處有最大吸收，牛蒡子苷元在280nm處有最大吸收，綜合考慮故測定波長選定為280nm。

含量測定結(jié)果顯示，不同來源的牛蒡子，其3種成分獨(dú)自的含量以及總含量都相差較大，出于對(duì)牛蒡子有炒用和生用兩種用法的考慮，本文對(duì)“馬爾康”批次牛蒡子樣品炒制不同時(shí)間后測定含量。結(jié)果表明，所有炒制品與其生品比較，三者的總含量均下降；炒制時(shí)間從10～40min時(shí)，牛蒡子苷、綠原酸的含量有下降的趨勢，牛蒡子苷元的含量有增加的趨勢。可見，炒制時(shí)間對(duì)牛蒡子中此3種成分的含量有一定的影響。從結(jié)構(gòu)上來看，綠原酸是由咖啡酸與奎尼酸形成的酯，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚3個(gè)不穩(wěn)定部分，因此不能經(jīng)受高溫、強(qiáng)光及長時(shí)間加熱[9]。牛蒡子苷是苷元和糖結(jié)合的結(jié)構(gòu)，水溶性較大，易被酶或酸水解，分子中又含內(nèi)酯環(huán)，可能存在熱不穩(wěn)定性。這種結(jié)果提示，不同來源的牛蒡子可能存在不同程度的受熱影響。此外，牛蒡葉和牛蒡根中幾乎沒有牛蒡子苷和牛蒡子苷元，這與前期的文獻(xiàn)[10]研究大致相符。

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（收稿日期：2017-04-05編輯：梁志慶）