補腎健脾中藥復方對骨質疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表達的影響

龔輝松

[摘要]目的 分析補腎健脾中藥復方對骨質疏松骨折骨痂中CTGF、Osterix因子表達的影響。方法 選擇6月齡清潔級健康雌性SD大鼠60只，隨機分為3組：模型組、西藥組和中藥組，每組20只。骨質疏松骨折模型成功后，中藥組和西藥組分別給予補腎健脾中藥復方和阿倫磷酸鈉混懸液灌服，模型組進行常規(guī)培養(yǎng)，1個月后取各組骨折的骨痂，進行體外培養(yǎng)，各組骨痂給予對應含藥血清進行培養(yǎng)。采用熒光定量PCR法檢測各組CTGF、Osterix因子的表達。結果 在CTGF表達方面，中藥組和西藥組中的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；在Osterix表達方面，中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組（P<0.05）。結論 補腎健脾中藥復方能在一定程度上促進骨痂的生長，從而促進骨折愈合，為骨質疏松性骨折愈合的機制和防治方法提供了一種新的途徑。

[關鍵詞]補腎健脾中藥；骨質疏松骨折；骨痂；結締組織生長因子；Osterix

[中圖分類號] R683 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）05（a）-0063-04

[Abstract]Objective To analyze the influence of Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen on CTGF and Osterix factor expression in callus of osteoporotic fracture.Methods 60 female SD rats of clean-class aged six-month were selected and they were randomly divided into 3 groups：model group，western medicine group and traditional Chinese medicine group （TCM group） （n=20）.After the success of the osteoporosis′ fracture model，TCM group was given Chinese Herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen and the western medicine group was given sodium alendate suspension.The model group was given routine culture.After 1 month，the callus of each group was taken and cultured in vitro.The callus of each group was cultured with the corresponding serum.CTGF and Osterix expression in each group were detected by fluorescence quantitative PCR.Results The expression of CTGF mRNA in TCM group and western medicine group was significantly higher than that in model group （P<0.05）.Osterix mRNA level in TCM group and western medicine group were significantly higher than those in model group （P<0.05），and the content of Osterix mRNA in TCM group was higher than that in western medicine group （P<0.05）.Conclusion Chinese herbal Compound of Tonifying Kidney and Strengthening Spleen can promote the growth of callus to a certain extent，thus promote fracture healing，and it provides the new way for the mechanism and prevention and treatment methods osteoporosis′fracture healing.

[Key words]Chinese herbal medicine of tonifying kidney and strengthening spleen；Osteoporosis fracture；Callus；Connective tissue growth factor；Osterix

骨質疏松癥最嚴重的并發(fā)癥是骨質疏松性骨折，嚴重影響患者的生活質量。骨質疏松性骨折是由于骨強度下降所致。目前已知的影響骨強度的因素主要有骨量、骨微結構、骨的幾何形狀、皮質骨厚度和多孔程度、骨組織構成材料的內在性能等[1]。骨質疏松性骨折的防治已成為了全世界關注的課題。然而，目前國內外對骨質疏松性骨折愈合機制以及對骨質疏松性骨折局部骨痂的“質量”的研究相對較少，且主要針對體內環(huán)境中的骨痂進行探討。本研究通過建立骨質疏松性骨折模型及骨痂組織體外培養(yǎng)體系，運用中藥血清藥理學的研究方法，模擬中藥在體內作用于骨痂組織的模式，觀察補腎健脾中藥復方對體外環(huán)境中骨痂生物學特性的變化以及結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、Osterix因子表達的影響，揭示補腎健脾中藥復方對骨質疏松性骨折骨痂生物學特性影響的作用機制，為中醫(yī)“腎主骨”理論提供實驗依據。亦為研究骨質疏松性骨折愈合的生理病理機制和治療方法提供一種新的思維模式。

1材料與方法

1.1試驗動物

6月齡清潔級健康雌性SD大鼠60只，其體重為（260±30）g。隨機分為3組：模型組、西藥組和[l1]中藥組；每組20只。所有動物均為廣州中醫(yī)藥大學動物中心提供。

1.2實驗藥物

中藥組采用補腎健脾中藥復方灌服，藥物的主要組成包括：黃芪12 g，補骨脂15 g，淫羊藿15 g，菟絲子12 g，肉蓯蓉15 g，熟地15 g，白芍10 g等組成。根據臨床用藥劑量及新藥研究中動物用藥劑量要求，該方的提取藥物，含生藥量1.65 g/ml。西藥組采用阿倫磷酸鈉片配制成0.055 mg/ml濃度的阿倫磷酸鈉混懸液（杭州默沙東制藥有限公司提供，國藥準字J20080069）。

1.3含藥血清的制備

每組中10只大鼠給予相應的藥物連續(xù)灌胃2周，其中西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度，每日灌胃1次，模型組給予正常飲食。最后1次給予動物灌胃后的2 h，對動物行心臟采血。獲得的全血置于含EDTA抗凝試管中，5～10 min后，以3000 r/min離心15 min，吸取上清，加以滅活，抽濾除菌，放置-20℃冰箱保存。

1.4 動物造模

每組中另外10只作動物模型，采用10%水合氯醛溶液作麻醉，以0.33 ml/100 g腹腔注射，待5 min后，大鼠麻醉完全，采用背側入路行雙側卵巢摘除術以造模。3個月后，行骨密度檢查，證實模型成功后，對各組麻醉，消毒右下肢，取膝內側髕旁切口約1 cm，逐層分離切開，將髕骨及韌帶向外側推開，暴露膝關節(jié)，屈曲膝關節(jié)，暴露髁間窩，鉆入0.5 mm克氏針，至股骨轉子下，做髓內固定，剪斷克氏針，殘端長度以不影響關節(jié)活動為度。利用骨折發(fā)生裝置將股骨造成閉合性骨折[2-3]。

1.5給藥方法

骨質疏松骨折的模型成功后，各組開始灌胃治療，灌胃給藥容積為10 ml/kg，模型組灌服蒸餾水；西藥組和中藥組以蒸餾水定容至上述所需濃度，每日灌胃1次，治療時間為1個月。

1.6骨痂的體外培養(yǎng)

摘取眼球取大鼠外周血3～4 ml，取血后處死，置于75%的乙醇浸泡15 min，置于無菌臺上，切開皮膚及皮下，分離肌肉，暴露骨折段，取出骨痂，PBS漂洗后放于Eppendorf管作備用。大鼠處死前24 h禁食。將新鮮骨痂標本切成1 mm×1 mm×1 mm大小，經過兩次含有青霉素及鏈霉素的PBS液漂洗后，放入培養(yǎng)板，加等量bGJB培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2中靜置培養(yǎng)，24 h后換液，根據分組情況分別加用含藥血清與bGJB培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，1周后收集標本進行相關指標檢測。

1.7 指標的檢測及結果的計算

采用熒光定量PCR檢測各組骨痂中的CTGF 和 Osterix 的mRNA含量。使用引物和探針設計軟件Primer 5.0，除了考慮引物、探針設計的通用原則外，此引物Tm值要求在58～60℃，探針Tm值在68～70℃，以保證探針特異性雜交。序列表見表1。

按照抽提的總RNA應馬上進行反轉錄：取2 μl RNA模板做逆轉錄反應，反轉錄反應程序：30℃ 10 min，42℃ 20 min，99℃ 5 min，4℃ 5 min；取1 μl反轉錄產物（cDNA）進行熒光定量PCR。根據實時熒光定量RT-PCR的原理，以β-actin基因mRNA的表達為內對照。ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（β-actin），然后計算實驗組各樣本的ΔCt與對照組樣本的ΔCt的差值，從而得到ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt（實驗組）-ΔCt（對照組）。采用2-ΔΔCt進行計算。表示實驗組測定基因的表達相對于對照組樣本基因的表達的變化倍數，將2-ΔΔCt作為最后的定量結果用于統(tǒng)計分析。

1.8統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件包分析，計量資料用x±s表示，采用方差分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

在CTGF表達方面，中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），但中藥組與西藥組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；在Osterix表達方面，中藥組和西藥組的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組（P<0.05）（表2）。

3討論

中醫(yī)學認為骨質疏松屬“骨痿“范疇?！端貑枴ゐ粽摗吩疲骸按四四I水不足，水不勝火；則骨枯髓虛，故足不任身，發(fā)為骨痿?！逼洳∫虿C，當首責于腎虛。由于各種原因導致腎（氣、陰、陽）的不足，影響骨髓和血之化源，精不生髓，骨失髓血充養(yǎng)，易發(fā)生骨骼脆弱無力之證，即骨質疏松性骨折。同時，中醫(yī)學亦認為骨質疏松性骨折愈合就是“瘀去、新生、骨合”的過程，且在“腎主骨”理論指導下進行組方用藥，國內的研究[4]表明補腎中藥提高了機體內分泌腺系統(tǒng)的功能，改善了下丘腦-垂體-性腺軸的功能，增加了體內的性激素，調整了內環(huán)境，從而達到抑制骨吸收，增加骨形成的目的，起到提高骨量的作用。魏合偉等[5-6]的研究已證明以“補腎法”擬定的中藥骨康方對骨代謝有雙向作用，既可抑制骨吸收，又可促進骨形成，縮短再造周期，提高骨生物力學性能，改善骨的質量，是一個較理想的治療骨質疏松癥的藥物。同時，發(fā)現其含藥血清中含有類性激素樣作用的物質；能促進成骨細胞增殖和礦化，并促進成骨細胞分泌Ⅰ型膠原。

本研究所用方由黃芪、補骨脂、淫羊藿、菟絲子、肉蓯蓉、熟地、白芍等組成，全方諸藥共奏補腎壯骨、健脾益氣之功效。該方以補骨脂補腎助陽壯骨為君藥。輔之肉蓯蓉、淫羊藿、菟絲子加強其補腎壯陽之功為臣藥。同時配以黃芪補中益氣；熟地、白芍滋陰益精，培補后天生化之源以充腎精，又可達到補中寓通，補而不滯的目的，共為佐藥，故本方具有補腎壯骨、健脾益氣的作用。

骨折修復的最終目的是盡可能恢復受傷骨的最大力學強度，修復骨折不僅要恢復骨形態(tài)的連續(xù)，更重要的是重建骨的支撐功能[7]。骨痂被認為是一種黏彈性物質，會隨著骨愈合過程而發(fā)生變化，由此出現剛度與強度變化的不同步[8]。張勝利等[9]的研究表明，骨質疏松后，皮質骨和松質骨的生物力學性能均發(fā)生了改變：在骨折愈合的不同時期骨痂局部的形狀、截面積、均勻性等發(fā)生變化，對于骨質疏松骨折而言，骨皮質變薄，骨彈性下降，骨脆性增加，骨骼的生物力學性能下降。隨著分子生物學的發(fā)展，人們對骨折愈合的認識不斷深化，現已知有大量的細胞生長因子在骨折愈合的不同階段參與并調控了實質過程，如CTGF及Osterix因子對骨細胞的增殖和分化有重要作用。

CTGF是CCN家族中的成員，是一種由349個氨基酸組成，分子量為34～38 KD的富含半胱氨酸的分泌肽，目前該家族共有CTGF/fisp-12，cef10/Cyr61和Nov三個成員，參與了體內的多種病理生理過程，在骨折愈合中發(fā)揮重要作用。研究表明[10-11]，其可促進軟骨細胞、生長板軟骨細胞、肥大軟骨細胞的增殖，并參與膜內骨化和骨建?；蛑厮?，因此在維持骨量方面有重要作用。在本研究中，中藥組和西藥組的CTGF mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學與意義，說明補腎健脾中藥復方能進一步提高骨痂的生長。

Osterix是一種含有鋅指結構的，對成骨細胞分化很重要的轉錄因子，屬于Sp/XKLF家族，定位局限于細胞核。它只在發(fā)育的骨組織中特異表達，被Lee等[12]認為是直接調節(jié)骨形成protein-2-runx2通路主要因子。另一方面，Osterix被認為是sox9和軟骨細胞的一種負向調控因子，可阻止骨或軟骨的祖細胞向軟骨細胞的分化。Baek等[13]的研究表明，Osterix失去可以延遲成骨細胞的成熟，導致不成熟的成骨細胞的積累和減少骨形成的成骨細胞功能的缺陷，無明顯骨吸收，因此，認為Osterix在積極調控成骨細胞分化和骨形成具有重要作用。Kang等[14]用機械牽張力結合超聲波刺激成骨細胞前體細胞，發(fā)現Osterix結合機械刺激可加速成骨細胞的基質成熟。Sinha等[15]認為，Osterix是成骨細胞特異性轉錄因子，它能激活早期成骨細胞分化成更多成熟的骨細胞。在本研究中，中藥組和西藥組中的Osterix mRNA含量明顯高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義，且中藥組的Osterix mRNA含量高于西藥組，差異有統(tǒng)計學意義，說明補腎健脾中藥復方在提高骨痂的生長有明顯的影響。

綜上所述，補腎健脾中藥復方能在一定程度上可促進骨痂的生長，從而促進骨折愈合，為防治骨質疏松性骨折、促進骨折愈合的治療方法提供了一種新的途徑。

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（收稿日期：2017-03-08 本文編輯：許俊琴）