不同化學(xué)萃取次數(shù)對(duì)同種異體肌腱生物學(xué)性能的影響

陳鵬，江長(zhǎng)青，申麗，陳國(guó)飛，尤田，江小成，李偉，

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518036；2.深圳市坪山區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳 518000；3.深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院 骨科，廣東 深圳 518000）

肌腱損傷及肌腱缺損是臨床上常見(jiàn)的創(chuàng)傷性疾病[1]，肌腱移植是其主要的修復(fù)手段。自體肌腱不存在排斥反應(yīng)，是修復(fù)肌腱缺損的最好方法，也是臨床中最常用的肌腱移植替代物。但由于自體肌腱來(lái)源有限，很多情況下無(wú)法滿足臨床需要，尤其是多發(fā)韌帶損傷的患者。組織工程肌腱目前仍處于試驗(yàn)階段，因其生物相容性及力學(xué)強(qiáng)度等難題仍未克服，尚無(wú)法大規(guī)模應(yīng)用于臨床[2]。同種異體肌腱來(lái)源相對(duì)比較充足，應(yīng)用方便，而且不對(duì)患者造成二次損傷，又可以根據(jù)患者的具體傷情選擇相應(yīng)長(zhǎng)短、粗細(xì)的肌腱，所以同種異體肌腱移植是目前肌腱修復(fù)或重建的主要方法。

尋求生物活性好、力學(xué)強(qiáng)度高且免疫原性低的同種異體肌腱是目前需要解決的重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題。目前同種異體肌腱的制備方法主要有深低溫凍存法、深低溫凍存干燥法、乙醇浸泡法等[3]，但上述方法不能從根本上解決免疫原性和肌腱力學(xué)強(qiáng)度等問(wèn)題。化學(xué)萃取是利用陰離子表面活性劑磷酸三丁酯(TBP)對(duì)肌腱組織進(jìn)行脫細(xì)胞處理。本實(shí)驗(yàn)深入探討不同次數(shù)化學(xué)萃取法在同種異體肌腱制備中的應(yīng)用效果。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組

新西蘭大白兔，體重2.5～3.0 kg，雄性，共16只，由北京華阜康生物科技股份有限責(zé)任公司提供。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平均分為四組：A組：萃取一遍；B組：萃取兩遍；C組：萃取三遍；D組：不經(jīng)任何處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)

動(dòng)物房12 h晝夜交替，保持新西蘭大白兔自由飲水、進(jìn)食，溫度23℃～25℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 跟腱取材

新西蘭大白兔7%水合氯醛耳緣靜脈注射麻醉，后腿備皮，剪開(kāi)腿部皮膚，暴露肌肉組織以及肌腱，分離肌肉充分暴露肌腱，剪下肌腱，注意避免操作過(guò)程中夾取或牽拉肌腱。

1.2.3 跟腱萃取

萃取方法：⑴肌腱于200 mL無(wú)菌蒸餾水中水平振蕩6h，無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍；⑵4%Triton X-100約200 mL中水平振蕩12 h，無(wú)菌蒸餾水再次沖洗3遍；⑶重復(fù)第一步；⑷4%脫氧膽酸鈉液約200 mL中振蕩12 h，無(wú)菌蒸餾水沖洗3遍；⑸最后在無(wú)菌蒸餾水200 mL中水平振蕩12 h。

1.2.4 萃取頻率

A組：按方法萃取一遍；B組：按方法萃取兩遍；C組：按方法萃取三遍；D組：將未經(jīng)任何處理的去除結(jié)締組織的肌腱作為對(duì)照組。

1.2.5 肌腱組織HE染色

標(biāo)本經(jīng)固定及石蠟包埋后做成石蠟切片，行蘇木精-伊紅染色，再脫水封片，光鏡下觀察。

1.2.6 樣品導(dǎo)電處理及電鏡觀察

標(biāo)本用戊二醛固定及梯度酒精脫水后，浸入50%的乙腈溶液中，然后依次更換70%，80%，90%，95%、100%的乙腈溶液，每次浸泡 1 5～20 min，最后更換100%乙腈溶液。進(jìn)行真空干燥，靜置30 min。待樣品干燥，溫度升至室溫后，取出樣品。用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動(dòng)，先噴碳，后噴金，噴鍍均勻，完成后電鏡下觀察。

1.2.7 生物力學(xué)檢測(cè)

肌腱拉伸斷裂強(qiáng)度檢測(cè)中，肌腱兩端用紗布包裹，然后將其固定在檢測(cè)儀兩端，檢測(cè)時(shí)用生理鹽水不斷噴濕肌腱，防止風(fēng)干對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。將肌腱拉伸至完全斷裂，拉伸速度為10 mm/min，在肌腱拉伸斷裂檢測(cè)過(guò)程中，用相應(yīng)軟件詳細(xì)記錄結(jié)果；在檢測(cè)肌腱拉伸斷裂延伸率過(guò)程中，延伸率計(jì)算方法為（拉伸斷裂長(zhǎng)度-初始長(zhǎng)度）/初始長(zhǎng)度×100%[4]。

1.2.8 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定

用含0.2%膠原酶RPM I 1640液將四組肌腱標(biāo)本切碎后分別消化，分離獲得其中的細(xì)胞成分，將濃度調(diào)整為1×106/mL，作為刺激細(xì)胞；采取受體兔靜脈血，分離獲取其淋巴細(xì)胞，將濃度調(diào)整為1×106/mL，作為反應(yīng)細(xì)胞。將刺激細(xì)胞與反應(yīng)細(xì)胞分別等量混合培養(yǎng)，各組做6個(gè)復(fù)孔，混合培養(yǎng)7 d后，獲取細(xì)胞懸液，離心后將沉淀制片，行瑞姬氏染色，光鏡下計(jì)數(shù)總淋巴細(xì)胞數(shù) (約500個(gè))及轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法如下：

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 =轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的淋巴細(xì)胞總數(shù)×100%。

計(jì)算各組6個(gè)復(fù)孔轉(zhuǎn)化率并計(jì)算其均值，作為此組轉(zhuǎn)化率。分別取4只供體兔肌腱標(biāo)本及4只受體兔靜脈血試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)以（±s）形式表示，以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS公司，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織形態(tài)學(xué)

2.1.1 大體觀察

D組肌腱為表面光滑的長(zhǎng)條狀乳白色組織，縱截面長(zhǎng)徑3.6～4.7 mm，短徑1.0～1.6 mm，質(zhì)地較柔軟，彈性、韌性良好，肌腱完整無(wú)損；A組外觀與D組基本相同；B組肌腱為表面光滑的長(zhǎng)條狀瓷白色組織，彈性及韌性稍遜于D組肌腱，基本完好無(wú)損；C組肌腱為無(wú)光澤的長(zhǎng)條狀瓷白色組織，表面較粗糙，彈性及韌性明顯較D組肌腱差，部分肌腱纖維松散。

2.1.2 HE染色

A組肌腱束間可見(jiàn)疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束；B組肌腱束間可見(jiàn)疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束，偶可見(jiàn)膠原纖維中斷；C組肌腱束間隔不清，膠原纖維排列較混亂；D組肌腱束間可見(jiàn)疏松結(jié)締組織，膠原纖維平行排列成束，其間可見(jiàn)散在腱細(xì)胞（圖1）。

圖1 四組HE染色后肌腱束比較（×400）

2.1.3 電鏡觀察

A組肌腱：有少許殘留細(xì)胞，細(xì)胞無(wú)明顯腫脹，膠原纖維排列較規(guī)則，呈波浪形，部分肌腱纖維輕度腫脹，纖維間隙稍增大（圖2-A）。B組肌腱：無(wú)殘留細(xì)胞，膠原纖維排列較規(guī)則，大多呈波浪形，肌腱纖維之間相互交聯(lián)，部分纖維較腫脹（圖2-B）。C組肌腱：無(wú)殘留細(xì)胞，膠原纖維之間排列較紊亂，無(wú)規(guī)則形狀，纖維間相互交織，纖維腫脹明顯（圖2-C）。D組肌腱：細(xì)胞無(wú)腫脹，膠原纖維排列較規(guī)則、緊密，纖維粗細(xì)均勻，呈波浪形，纖維之間相互交織（圖2-D）。

圖2 四組掃描電鏡下肌腱比較（×1000）。

2.2 生物力學(xué)檢測(cè)

檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，肌腱拉伸斷裂強(qiáng)度(Pmax)、功耗(Wmax)、延伸率(＆max)各實(shí)驗(yàn)組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定

C組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率（1.21±0.19）%，顯著低于A組（5.36±0.54）%、B 組（3.84±0.36）%及D組（P＜0.05）；B組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率也低于A組（P＜0.05）（表2）。說(shuō)明化學(xué)萃取法幾乎消除了肌腱的免疫源性，萃取次數(shù)越多，肌腱的免疫原性越低。

表1 四組肌腱生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果(n=4，±s)

表1 四組肌腱生物力學(xué)檢測(cè)結(jié)果(n=4，±s)

組別 Pmax(N) Wmax(J) ＆max(%)A 組 173±36 0.68±0.09 21.15±1.65 B 組 168±31 0.62±0.07 20.32±1.28 C 組 159±35 0.53±0.10 18.86±1.37 D 組 176±23 0.73±0.08 22.04±1.31 F值 0.379 0.957 2.844 P值 0.594 0.143 0.095

表2 四組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果(n=4，±s)

表2 四組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率結(jié)果(n=4，±s)

組別 轉(zhuǎn)化率（%）A組 5.36±0.54 B組 3.84±0.36 C組 1.21±0.19 D組 10.59±0.67 F值 0.247 P值 ＜0.001

3 討論

臨床中，肌腱移植在外科重建與修復(fù)中應(yīng)用廣泛，無(wú)論是運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)科還是手外科，對(duì)肌腱移植材料的需求都很大[3]。目前，肌腱移植材料主要分為自體肌腱、同種異體肌腱、組織工程肌腱以及人工肌腱等[6，7]。自體肌腱移植雖排斥反應(yīng)較小，但因其來(lái)源有限且有創(chuàng)，無(wú)法滿足臨床需要。同種異體肌腱來(lái)源廣泛，且不會(huì)造成新的創(chuàng)傷，近年來(lái)一直是組織工程研究中的熱點(diǎn)。

目前來(lái)說(shuō)，限制同種異體肌腱應(yīng)用主要有兩方面因素。一是肌腱本身的免疫原性。若未經(jīng)免疫原性處理的肌腱植入受體內(nèi)，將會(huì)引起嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，導(dǎo)致手術(shù)失敗甚至危及受體生命安全。二是經(jīng)處理后肌腱的強(qiáng)度變化。本質(zhì)上說(shuō)，肌腱在體內(nèi)就是起到力量傳遞作用，所以肌腱本身必須保持一定的抗拉伸強(qiáng)度及韌度，若肌腱經(jīng)處理后強(qiáng)度下降較大，也將直接導(dǎo)致手術(shù)的失敗[4]。

本實(shí)驗(yàn)中，A組及B組均與D組有相似的形態(tài)、色澤及拉伸斷裂強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)組在很大程度上保留了肌腱纖維強(qiáng)度的同時(shí)，去除了肌腱的免疫原性，使其能夠被異體接受。HE染色及電鏡下觀察，C組肌腱纖維組織破壞較嚴(yán)重，肌腱纖維排列紊亂，而萃取一遍及二遍組肌腱的纖維可以得到較完整的保留。

肌腱移植材料最重要的是要具備良好的生物力學(xué)性能，這樣才可以減少手術(shù)過(guò)程中縫合時(shí)的撕裂程度[3]，進(jìn)而減少術(shù)后再斷裂的概率，降低手術(shù)失敗率[8,9]。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)力學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試來(lái)探討經(jīng)不同萃取次數(shù)制備的肌腱對(duì)其生物力學(xué)性能有無(wú)影響，四組肌腱的Pmax、Wmax和＆max的結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05)，表明四組間力學(xué)強(qiáng)度未見(jiàn)明顯差異，化學(xué)萃取法制備的肌腱能夠較好地保留肌腱的生物力學(xué)性能。但萃取三遍組的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均明顯低于其他組，可能由于樣本量不夠大或測(cè)試條件等因素，導(dǎo)致結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

有研究表明CD 4+T，CD 8+T兩個(gè)淋巴細(xì)胞亞群參與機(jī)體免疫排斥反應(yīng)主要是通過(guò)細(xì)胞免疫和體液免疫兩個(gè)過(guò)程協(xié)同作用[10]，臨床上二者比值的變化常作為檢測(cè)移植物引起的排斥反應(yīng)的指標(biāo)[11]。本實(shí)驗(yàn)中，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，四組之間淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率均有明顯差異，空白組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率最大，萃取三遍組轉(zhuǎn)化率明顯低于其他各組（P＜0.05），萃取二遍組轉(zhuǎn)化率明顯低于萃取一遍組。說(shuō)明萃取次數(shù)越多，肌腱的免疫原性降低越明顯。

綜上所述，肌腱經(jīng)化學(xué)萃取法萃取二遍后，在保留了原有的肌腱纖維和良好的生物力學(xué)性能的同時(shí)，也明顯降低了其免疫原性，是一種相對(duì)較好的肌腱制備方法，為同種異體肌腱制備的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Kuleshova LL,Lopata A.Vitrification can be more favorable than slow cooling[J].Fertile Sterile,2002,78:449-454.

[2]Kim HW,Yeo IJ,Hwang KE,et al.Isolation and Charactele Collagens from Bones,Skins,and Tendons in Duck Feet[J].Korean J Food Sci Anim Resour,2016,36(5):665-670.

[3]Kowalski JB,Mosley GA,Merritt K,et al.Assessment of bioburden on human and animal tissues:Part 1-results of method development and validation studies[J].Cell Tissue Bank,2012,13(1):129-138.

[4]Nakano T,Betti M,Pietrasik Z.Extraction isolation and analysis of chondroitin sulfate glycosaminoglycans[J].Recent Pat Food Nutr Agric,2010,2(1):61-74.

[5]Mohamad NA,Mustafa S,El Sheikha AF,et al.Modification of gelatin-DNA interaction for optimised DNA extraction from gelatin and gelatin capsule[J].J Sci Food Agric,2016,96(7):2344-2351.

[6]Mokrejs P,Sukop S,Svoboda P.Three-stage extraction of gelatines from tendons of abattoir cattle:2-properties of gelatines[J].Appl Biochem Biotechnol,2012,168(2):434-445.

[7]Cartmell JS,Dunn MG.Effect of chemical treatments on tendon cellularity and mechanical properties[J].J Biomed Mater Res,2000,49(1):134-140.

[8]Sripunya N,Somfai T,Inaba Y,et al.A comparison of cryotop and solid msurface vitrification methods for the cryopreservation of in vitro matured bovine ocytes[J].J Reprod Dev,2010,56:176-181.

[9]Fan WX,Ma XH,Ge D,et al.Cryoprotectants for the vitrification of corneal endothelial cells[J].Cryobiology,2009,58:28-36.

[10]Brockbank KG,Chen ZZ,Song YC.Vitrification of porcine articular cartilageP[J].Cryobiology,2010,60:217-221．

[11]Srinivasan A,Sehgal PK.Characterization of biocompatible collagen fibers-a promising candidate for cardiacpatch[J].Tissue Eng Part C Methods,2010,16(5):895-903.