斑馬魚胚胎急性毒性實驗法檢測趕山鞭化學(xué)成分胚胎發(fā)育毒副作用

吳夢華,董建勇*

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院,浙江 杭州 310000;2.溫州醫(yī)科大學(xué),浙江 溫州 325000）

斑馬魚胚胎急性毒性實驗法檢測趕山鞭化學(xué)成分胚胎發(fā)育毒副作用

吳夢華1,董建勇2*

（1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院,浙江 杭州 310000;2.溫州醫(yī)科大學(xué),浙江 溫州 325000）

目的 利用斑馬魚胚胎急性毒性實驗檢測趕山鞭化學(xué)成分胚胎發(fā)育毒副作用。方法 以孵育6 h的斑馬魚胚胎為實驗?zāi)Ｐ?，設(shè)DMSO對照組和quercetin,rutin,hyperin,quercertin-3-O-α-L-arabinofuranoside,quercertin-3-O-β-D-glucoside五種趕山鞭單體化合物樣品組，觀察記錄72 hpf（受精后72小時）時的致死率、致畸率、孵化率。結(jié)果 72 hpf,在各濃度梯度范圍內(nèi)，5種化合物對斑馬魚胚胎致死致畸抑制孵化效應(yīng)明顯（P＜0.05），高濃度時愈加明顯（P＜0.01），且呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)?；晤愋椭饕獮樾姆磕宜[、體節(jié)彎曲。結(jié)論 上述5種化合物可能對胚胎發(fā)育有一定的毒性。

趕山鞭;斑馬魚胚胎;急性毒性

趕山鞭系藤黃科金絲桃屬植物Hypericum attenuatum的全草。該屬植物在我國分布廣泛，有抑制血管、抗抑郁、抗病毒等藥理作用[1]，有光敏性皮炎、眩暈、疲乏等毒副作用[1]。關(guān)于該屬植物的有效活性成分研究較多，但是關(guān)于其導(dǎo)致毒副作用的化學(xué)成分研究較少。傳統(tǒng)毒理學(xué)研究多數(shù)是以小鼠為模型評估藥物毒性[2]，但成本高、周期長、結(jié)果不易觀察。近年來，因斑馬魚與人類各器官系統(tǒng)極其相似[3]、周期短、胚胎透明易觀察、對毒性物質(zhì)反應(yīng)靈敏[4]等優(yōu)點，逐漸作為新模型應(yīng)用于藥物毒性評價[5],本文通過對斑馬魚胚胎的急性毒性觀察，初步檢測趕山鞭導(dǎo)致胚胎發(fā)育毒副作用的化學(xué)成分。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

斑馬魚（無病原體AB品系，由美國Oregon州立大學(xué)提供）,飼養(yǎng)在專用的循環(huán)系統(tǒng)中，水溫28℃，魚室光周期設(shè)定為14 h光/10 h暗。早晚各一次飼喂豐年蟲（Artemien,Salina），中午輔以商品魚飼料。實驗前挑選健康性成熟的斑馬魚放入孵化箱中，每個孵化罐中的雌雄比例保持為2∶1，次日亮燈后半個小時即可收集胚胎。使用系統(tǒng)水將胚胎沖洗干凈，棄掉成魚糞便等雜質(zhì)，以及未受精和發(fā)育不良的胚胎（呈白色不透明狀）。將剩余胚胎置于培養(yǎng)皿中加入胚胎培養(yǎng)液，放入28℃、光周期14 h光/10 h暗的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥品與試劑

趕山鞭（甘肅宕昌縣，樣本保存在浙南特色中藥重點實驗室）；quercetin(化合物1),rutin(化合物2),hyperin(化合物 3),quercertin-3-O-α-L-arabinofuranoside(化合物 4),quercertin-3-O-β-D-glucoside(化合物5)（均從趕山鞭中分離得到，經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院董建勇教授鑒定）。

胚胎 培 養(yǎng) 液 （稱 取 0.8 g NaCl、0.04 g KCl、0.003 58 g Na2HPO4、0.006 g KH2PO4、0.144 g Ca-Cl2、0.246 g MgSO4·7H2O、0.35 g NaHCO3·800 mL超純水置于1 L燒杯中，攪拌至完全溶解，再用超純水定容至1 L,滴加1 M NaOH調(diào)pH至7.2）?；衔锬敢号渲埔姳?。

表1化合物母液配制及濃度

1.3 主要儀器

全封閉斑馬魚循環(huán)系統(tǒng)（AHAB），體式顯微鏡（Nikon SMZ 1500），光照恒溫培養(yǎng)箱（RXZ智能型，寧波江南儀器廠）。

1.4 胚胎急性毒性實驗[6]

通過預(yù)實驗設(shè)定濃度梯度：化合物1～2為0、1、2、4、8、16 μg/μL;化合物 3～5 為：0、1、2、4、8、16、32 μg/μL。同時設(shè)DMSO對照組。配制化合物工作液：取最高濃度化合物母液，邊振蕩邊加入胚胎培養(yǎng)液中，稀釋1 000倍，配制成最高濃度工作液，溶液中DMSO濃度為0.1%；低濃度工作液用高濃度工作液逐級稀釋。將DMSO邊振蕩邊加入胚胎培養(yǎng)液中，配制含0.1%DMSO的對照溶液。各溶液于實驗前現(xiàn)配現(xiàn)用。挑選胚胎：收集胚胎6 h左右，在體式顯微鏡下從收集到的胚胎中挑選發(fā)育正常、已進入半包期的受精胚胎。暴毒：取96孔培養(yǎng)板，DMSO組每孔加入200 μL胚胎培養(yǎng)液，占16個孔。各實驗組分別加入200 μL不同濃度的工作液，每個濃度的溶液均占16個孔，將挑選出來的胚胎隨機放入96孔培養(yǎng)板中，每孔1枚胚胎。將培養(yǎng)板放回光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，不能疊放，以防各組胚胎發(fā)育不均衡。實驗重復(fù)3次。觀察：分別在胚胎受精后24、48、72、96 h時，于體式顯微鏡下進行觀察、記錄各組胚胎孵化、畸形、死亡等狀況，并使用CCD拍照?；危盒姆磕宜[，卵黃囊水腫，下頜異常，體節(jié)異常，尾部形態(tài)異常，黑色素細(xì)胞形成異常，心跳緩慢，活動能力差等與正常斑馬魚明顯不同的發(fā)育狀態(tài)。死亡：15 s內(nèi)沒有觀察到心跳，即判定為死亡。孵化率=（胚胎孵化數(shù)/胚胎原數(shù)）×100%;死亡率=1-（胚胎死亡個數(shù)/胚胎原數(shù)）×100%;畸形率=（胚胎畸形個數(shù)/胚胎原數(shù)）×100%+死亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析[6]

使用SPSS 22.0軟件通過one-way ANOVA對不同處理組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，使用origin 8.0軟件進行非線性擬合計算LC50值。

2 結(jié)果

2.1 各化合物對斑馬魚胚胎生長發(fā)育的影響

選取胚胎受精72 hpf的實驗結(jié)果進行分析,從圖1結(jié)合表2可以看出：空白和DMSO對照組胚胎孵化、畸形和死亡率無差異（P＞0.05）。在濃度梯度范圍內(nèi)，五種化合物對斑馬魚胚胎致死致畸抑制孵化效應(yīng)明顯(P＜0.05)，隨著濃度遞增，致死致畸抑制孵化效應(yīng)愈加明顯（P＜0.01），呈現(xiàn)良好的劑量效應(yīng)。

2.2 各個化合物的LC50值

化合物 1～5 LC50值大小分別為：4.14、6.07、15.08、13.61、13.37 μg/μL。

2.3 化合物的胚胎畸形類型

高濃度(8～16 μg/μL)樣品對胚胎的 72 hpf致死率較高，畸形率主要來源于死亡率，存活下來的幼魚中畸形個體少。低濃度(1～4 μg/μL)樣品對胚胎致死率不高，存活下來的幼魚畸形類型主要有心房囊水腫和體節(jié)彎曲，參見圖2[7]。

圖1化合物1～5對斑馬魚胚胎的致死率（mortality）、孵化率(hatch)、致畸率(malformation)

表2 5個化合物對斑馬魚胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

表2 5個化合物對斑馬魚胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

C(μg/μL)化合物1(%) 化合物2(%) 化合物3(%)mor hat mal mor hat mal mor hat mal 0 1 2 4 8 1 6 32 0.00±0.00 6.25±0.00*27.08±3.61**56.25±6.25**91.67±3.61**100.0±0.00**-100.00±0.00 91.67±3.61*85.42±3.61**79.17±3.61**43.75±6.25**33.33±3.61**-0.00±0.00 10.42±3.61**27.08±3.61**54.17±3.61**79.17±3.61**100.0±0.00**-0.00±0.00 16.67±3.61**31.25±6.25**43.75±6.25**58.33±3.61**100.0±0.00**-100.00±0.00 91.67±6.25 85.42±6.25*79.17±6.25**43.75±6.25**33.33±3.61**-0.00±0.00 10.42±3.61**27.08±3.61**54.17±12.5**79.17±3.61**100.0±0.00**-0.00±0.00 8.33±3.61*16.67±7.22**27.08±3.61**33.33±3.61**47.92±3.61**100.0±0.00**100.00±0.00 91.67±3.61**85.42±3.61**72.92±3.61**45.83±3.61**39.58±3.61**35.42±3.61**0.00±0.00 12.50±6.25**20.83±3.61**33.33±3.61**45.83±3.61**52.08±3.61**100.0±0.00**

續(xù)表2 5個化合物對斑馬魚胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

續(xù)表2 5個化合物對斑馬魚胚胎的致死率(mor)、孵化率(hat)、致畸率(mal) （±s,n=3）

注：與對照組比較：*P＜0.05,**P＜0.01。

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圖2各化合物致AB品系斑馬魚胚胎72 hpf時的主要畸形表型

3 討論

實驗表明 hyperin 在高濃度(16 μg/μL)時，對斑馬魚胚胎基本致死致畸且顯著抑制孵化 （P＜0.01），據(jù)文獻(xiàn)報道，hyperin對胎鼠生長發(fā)育有一定影響，建議懷孕婦女慎用[8]。其它幾種化合物均對斑馬魚胚胎致死致畸抑制孵化效應(yīng)明顯，建議懷孕婦女慎用。

據(jù)各化合物L(fēng)C50，提示毒副作用：化合物3＜化合物4＜化合物5＜化合物2＜化合物1?；晤愋陀行姆磕宜[和脊柱彎曲，前者是心臟血管功能障礙引起[9]，斑馬魚心臟的發(fā)育需要細(xì)胞增殖、遷移、分化和不同起源的細(xì)胞之間的相互作用，與多種基因的表達(dá)有關(guān)[10]，具體作用機制待進一步研究；斑馬魚魚體脊柱彎曲可能與胚胎sepn1基因表達(dá)有關(guān)[11]，機制待進一步研究。此5種化合物均為黃酮類化合物，提示黃酮類化合物可能是造成趕山鞭胚胎發(fā)育毒副作用的主要成分。

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（本文編輯 楊 瑛）

Toxic and Side Effects of Chemical Constituents from Hypericum attenuatum on Embryonic Development of Zebrafish

WU Menghua1,DONG Jianyong2*
(1.Children's Hospital Affiliated to Zhejiang University School of Medicine,Hangzhou,Zhejiang 310000,China;2.Wenzhou Medical University,Wengzhou,Zhejiang 325000,China)

Objective To detect the toxic and side effects of chemical components from Hypericum attenuatum on embryonic development of zebrafish by acute toxicity test.Methods The 6 h post-fertilization zebrafish was used as experimental models,randomly divided into the control group with DMSO and the sample groups with quercetin,rutin,hyperin,quercertin -3 -O -α -L -arabino furanoside, quercertin -3 -O -β -D -glucoside of Hypericum attenuatum.The mortality,malformation,hatchability at 72 hpf(72 hours after fertilization)were observed.Results The five constituents show obvious inhibiting hatchability on embryonic development of zebrafish(P＜0.05),which show stronger inhibition at high concentration,with dose-dependent effect.Conclusion The five components may have a certain toxicity to embryonic development.

Hypericum attenuatum;embryos of zebrafish;acute toxicity

R285.5；R994.39

A

doi：10.3969/j.issn.1674－070X.2017.06.006

本文引用：吳夢華,董建勇.斑馬魚胚胎急性毒性實驗法檢測趕山鞭化學(xué)成分胚胎發(fā)育毒副作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017,37（6）：602-605.

2016-10-25

吳夢華，男，藥師，碩士，研究方向：中藥活性成分提取。

* 董建勇，男，教授，碩士研究生導(dǎo)師，E-mail：491195878@qq.com。