神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植對帕金森病大鼠運動障礙的影響

李智高，徐蛟天，陳孝祥，林海，宋曉斌，楊智勇，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植對帕金森病大鼠運動障礙的影響

李智高，徐蛟天，陳孝祥，林海，宋曉斌，楊智勇，鄧興力

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，昆明650032)

目的 探討神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植改善帕金森病大鼠運動障礙的效果。方法 采用經(jīng)典6-羥基多巴胺毀損法構(gòu)建帕金森病大鼠模型36只，腹腔注射阿樸嗎啡連續(xù)誘導4周。APO注射第4周將36只帕金森病大鼠隨機分為對照組、多巴胺組、干細胞組及聯(lián)合組，每組9只，分別于右側(cè)紋狀體區(qū)立體定向注入生理鹽水、多巴胺神經(jīng)元懸液、神經(jīng)干細胞懸液、多巴胺神經(jīng)元與神經(jīng)干細胞懸液。計算各組移植后2、4、6、8周的旋轉(zhuǎn)次數(shù)；干細胞組及聯(lián)合組分別于移植后1、2、4、8周行MRI掃描，觀察移植區(qū)影像學變化；移植后8周取各組腦組織行普魯士藍染色，觀察移植細胞定植與遷移情況，免疫熒光法檢測移植細胞分化情況。結(jié)果 移植后2、4、6、8 周，對照組、神經(jīng)干細胞組、多巴胺組、聯(lián)合組旋轉(zhuǎn)次數(shù)依次降低，組間兩兩比較P均<0.01。MRI檢查結(jié)果：隨著時間延長，聯(lián)合組與干細胞組移植區(qū)T2 W/FFE成像上呈低信號影的區(qū)域逐漸變大，但聯(lián)合組低信號影范圍大于干細胞組。普魯士藍染色結(jié)果：干細胞組和聯(lián)合組移植的神經(jīng)干細胞及其分化后的細胞胞質(zhì)內(nèi)均可見大量藍色顆粒，大部分存留在移植針孔附近，僅少部分細胞向遠處遷移，但聯(lián)合組藍色顆粒數(shù)量以及擴散范圍均大于干細胞組。聯(lián)合組巢蛋白(Nestin)、酪氨酸羥化酶(TH)、綠色熒光蛋白(GFP)陽性細胞數(shù)及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干細胞組，酸性纖維蛋白(GFAP)陽性細胞數(shù)及GFAP/GFP均低于干細胞組(P均<0.01)。結(jié)論 神經(jīng)干細胞與多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植可顯著改善帕金森病大鼠的運動障礙，更有助于神經(jīng)干細胞的定植、遷移及分化成為多巴胺神經(jīng)元。

帕金森??；神經(jīng)干細胞；多巴胺神經(jīng)元；神經(jīng)干細胞移植；神經(jīng)元移植

帕金森病是一種與多巴胺神經(jīng)元變性缺失相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，最終引起一系列運動障礙癥狀，目前尚無根治的方法[1]。隨著對帕金森病研究的深入，以替代和補充變性缺失的多巴胺神經(jīng)元來實現(xiàn)神經(jīng)元修復和功能重塑，在帕金森病治療中具有巨大的潛在應用價值[2]。綠色熒光蛋白(GFP)基因標記技術(shù)是一種新型的細胞示蹤技術(shù)，用其標記神經(jīng)干細胞可穩(wěn)定表達GFP，具有敏感性強、存在時間久、不影響細胞功能等特點[3]。超順磁氧化鐵(SPIO)是一種新型MRI對比劑，用其標記的神經(jīng)干細胞可在移植后不同時間點采用MRI動態(tài)觀察移植細胞的存活、分化以及遷移情況[4]。 2015年9月～2016年9月，本研究觀察了GFP、SPIO雙標神經(jīng)干細胞聯(lián)合多巴胺神經(jīng)元移植對帕金森病大鼠運動障礙的改善作用及移植后神經(jīng)干細胞的遷移及分化情況，旨在為細胞替代療法治療帕金森病提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠36只，SPF級，體質(zhì)量180～220 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。主要試劑及儀器：堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、Alex-Fluor 594羊抗兔IgG及酸性纖維蛋白(GFAP)、酪氨酸羥化酶(TH)、β-3-tubulin多克隆抗體均購自美國Proteintech公司，F(xiàn)BS、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自碧云天生物技術(shù)研究所；大鼠腦三維立體定向儀(美國Stoelting公司)。

1.2 神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元建立

1.2.1 大鼠胚胎中腦神經(jīng)干細胞分離及鑒定 取孕12.5天的SD大鼠1只，無菌條件下取出胚胎中腦組織并剪碎，吹打后200目篩網(wǎng)過濾，1 000 r/min離心5 min，取細胞懸液并調(diào)整細胞密度為1×105個/mL，接種于培養(yǎng)瓶。37 ℃、5% CO2條件下采用神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)， 神經(jīng)干細胞培養(yǎng)液：含1% N2的DMEM/F12培養(yǎng)基、bFGF(20 μg/L)、EGF(20 μg/L)、1%雙抗。高倍鏡(×200)下觀察細胞生長情況，結(jié)果顯示細胞形成神經(jīng)球，懸浮生長，球中心較暗，周邊折光率較強，未見突起。根據(jù)細胞代謝情況每2～3天半量加液，取培養(yǎng)5天的細胞，采用免疫細胞化學法檢測神經(jīng)干細胞標志物巢蛋白(Nestin)的表達情況，結(jié)果顯示Nestin表達呈陽性。將細胞經(jīng)血清誘導分化培養(yǎng)3天，神經(jīng)球貼壁并呈分化生長，采用免疫細胞化學法檢測神經(jīng)元特異性標志物β-3-tubulin、神經(jīng)膠質(zhì)細胞特異性標志物GFAP和多巴胺神經(jīng)元特異性標志物TH的表達，二抗分別為Alex-Fluor594、Alex-Fluor594、FITC羊抗兔IgG，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。結(jié)果顯示分化后存在以下細胞：呈多角形、有單個或多個突起、GFAP陽性的星形膠質(zhì)樣細胞；細胞體較大、有軸突和數(shù)個短小突起、β-3-tubulin陽性的神經(jīng)元；細胞體呈梭形或椎體形、發(fā)出單個或多個突起、TH陽性的神經(jīng)元。以上均證實分離出的細胞為神經(jīng)干細胞。

1.2.2 SPIO、GFP雙標神經(jīng)干細胞建立 參考前期研究方法[5]，建立SPIO、GFP雙標神經(jīng)干細胞。

1.2.3 多巴胺神經(jīng)元分離及標記 參考前期研究方法[6]，分離培養(yǎng)并鑒定多巴胺神經(jīng)元，以CM-DiI進行標記。結(jié)果證實多巴胺神經(jīng)元純度>90%并用于以下試驗。

1.3 帕金森病模型建立 取36只SD大鼠，以經(jīng)典6-羥基多巴胺(6-OHDA)毀損法為基礎(chǔ)[7]，改進毀損位點建立帕金森病模型。方法如下：將大鼠以7%水合氯醛(0.6 mL/100 g)腹腔注射麻醉，以前囟為基準點，分別于右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(A/P：-3.6 mm；L：+2.0 mm；V：-8.5 mm)及紋狀體(A/P：+0.4.0 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)注射15 μg 6-OHDA(3 μg/μL)，術(shù)后1周腹腔注射阿樸嗎啡(APO)0.40 mg/kg誘發(fā)大鼠做偏側(cè)旋轉(zhuǎn)運動，每周1次，連續(xù)誘導4周，觀察大鼠行為學改變。結(jié)果顯示部分大鼠術(shù)后1周開始出現(xiàn)運動遲滯、四肢震顫等運動障礙；術(shù)后2周開始出現(xiàn)向健側(cè)異常旋轉(zhuǎn)運動。隨著時間推移，旋轉(zhuǎn)動物數(shù)量、旋轉(zhuǎn)圈數(shù)均逐漸遞增，術(shù)后4周，趨于穩(wěn)定。每只大鼠術(shù)后第4周注射APO 5 min后，計數(shù)10 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)情況及旋轉(zhuǎn)次數(shù)，以平均向健側(cè)(左側(cè))旋轉(zhuǎn)速度>7 r/min定義為模型建立成功。結(jié)果顯示，36只大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)運動，且旋轉(zhuǎn)速度>7 r/min，證實建模成功并用于后續(xù)實驗。

1.4 神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植對SD大鼠運動障礙改善作用的觀察

1.4.1 分組處理 采用隨機數(shù)字表法將36只帕金森病模型大鼠隨機分為對照組、多巴胺組、神經(jīng)干細胞組(干細胞組)、聯(lián)合組，每組9只。多巴胺組、干細胞組分別將5 μL 多巴胺神經(jīng)元及SPIO、GFP雙標神經(jīng)干細胞細胞懸液(均含5×105個細胞)立體定向注入右側(cè)紋狀體區(qū)(A/P：+0.5 mm；L：+2.0 mm；V：-5.0 mm)。聯(lián)合組將多巴胺神經(jīng)元與SPIO、GFP雙標神經(jīng)干細胞按1∶2的比例進行配比，參照上述方法注入右側(cè)紋狀體區(qū)。對照組右側(cè)紋狀體區(qū)注射等體積生理鹽水。

1.4.2 運動功能改善情況觀察 記錄各組移植前及移植后第2、4、6、8周APO誘導后10 min內(nèi)的旋轉(zhuǎn)次數(shù)，以移植后旋轉(zhuǎn)次數(shù)/移植前旋轉(zhuǎn)次數(shù)計算移植后2、4、6、8周的旋轉(zhuǎn)次數(shù)相對比，比值越低說明治療效果越好。

1.5 神經(jīng)干細胞移植后的定植、遷移與分化觀察

1.5.1 神經(jīng)干細胞移植后的定植與遷移 ①MRI掃描。將干細胞組、聯(lián)合組分別于移植后1、2、4、8周進行MRI掃描，采用5英寸表面線圈，先進行三平面定位掃描，再行梯度回波T2加權(quán)(T2 W/FFE)成像。設(shè)置參數(shù)：TR 388 ms，TE 23 ms，翻轉(zhuǎn)角18°，F(xiàn)OV 120 mm，矩陣205×256，層厚 2.0 mm，掃描時間2 min 8 s。觀察各組移植區(qū)SPIO標記神經(jīng)干細胞定植、遷移情況。②普魯士藍染色。移植8周后干細胞組、聯(lián)合組常規(guī)采用生理鹽水及4%多聚甲醛進行心臟灌注，處死后開顱，取腦組織，用4%多聚甲醛固定，蔗糖梯度脫水，OTC包埋劑包埋，移植點連續(xù)10 μm厚度冰凍切片。腦組織切片行普魯士藍染色。200倍顯微鏡下觀察染色情況，以此反映SPIO標記神經(jīng)干細胞的定植、遷移情況。

1.5.2 神經(jīng)干細胞移植后的分化 采用免疫熒光法。取1.5.1中干細胞組、聯(lián)合組的腦組織切片，封片后10%山羊血清封閉，加入一抗(Nestin 1∶800、TH 1∶800、GFAP 1∶500)冷藏孵育過夜，次日漂洗后添加IgG熒光二抗(Alex-Fluor594羊抗兔IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200)，避光孵育，封片劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。200倍視野下，連續(xù)對5張組織切片移植點處的Nestin、TH、GFAP及GFP陽性細胞進行計數(shù)，取平均值。計算Nestin、TH、GFAP陽性細胞數(shù)占GFP陽性細胞數(shù)的百分比，分別記為Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP，比值越大說明移植神經(jīng)干細胞的分化率越高。

2 結(jié)果

2.1 各組運動障礙改善情況 見表1。

表1 各組旋轉(zhuǎn)次數(shù)相對比比較

注：與對照組比較，*P<0.01；與多巴胺組比較，#P<0.01；與干細胞組比較，△P<0.01。

2.2 神經(jīng)干細胞移植的定植與遷移情況 MRI檢查結(jié)果顯示：移植1周后，聯(lián)合組與干細胞組T2 W/FFE成像均可見細胞移植區(qū)呈類圓形低信號影，大部分細胞聚集在移植點附近；隨著時間延長，兩組移植區(qū)T2 W/FFE成像上仍呈低信號影，且區(qū)域逐漸變大，但聯(lián)合組的低信號影范圍大于干細胞組。普魯士藍染色結(jié)果顯示：移植8周，聯(lián)合組與干細胞組移植的神經(jīng)干細胞及其分化后的細胞胞質(zhì)內(nèi)均可見大量藍色顆粒，大部分存留在移植針孔附近，僅有少數(shù)部分細胞向遠處遷移；但聯(lián)合組藍色顆粒數(shù)量以及擴散范圍均大于干細胞組。

2.3 神經(jīng)干細胞的分化情況 見表2、3。

表2 干細胞組與聯(lián)合組腦組織陽性細胞計數(shù)比較(個

注：與干細胞組比較，*P<0.01。

3 討論

移植胚胎多巴胺神經(jīng)元可提高局部多巴胺水平，從而顯著改善帕金森病動物模型的癥狀[8]，但是移植后多巴胺神經(jīng)元的存活數(shù)量以及生存時間仍有待提高。神經(jīng)干細胞存在于幼年及成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)發(fā)生相關(guān)區(qū)域，特別是腦室下區(qū)(SVZ)、齒狀回的粒下層(SGZ)[9]。作為多種細胞的祖細胞，神經(jīng)干細胞的增殖和分化能力受到多種因素的調(diào)節(jié)，其中一些神經(jīng)元對神經(jīng)干細胞分化的方向也有至關(guān)重要的影響[10]。國內(nèi)研究證實，胚胎中腦多巴胺神經(jīng)元與誘導神經(jīng)干細胞分化移植治療帕金森病大鼠均具有顯著療效，但同樣都面臨神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元分化率較低的困境[11]。故本研究在此基礎(chǔ)上聯(lián)合原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞和多巴胺神經(jīng)元共移植治療帕金森病，以期待實現(xiàn)更好的治療效果。本研究結(jié)果顯示，移植后2、4、6、8 周，干細胞組旋轉(zhuǎn)次數(shù)高于多巴胺組，說明移植神經(jīng)干細胞治療運動障礙的帕金森病療效不如移植多巴胺；這是由于神經(jīng)干細胞本身是一種前體細胞，分化成為多巴胺神經(jīng)元才能發(fā)揮作用。本研究中，聯(lián)合組移植后2、4、6、8 周旋轉(zhuǎn)次數(shù)相對比均低于其他組，可能是由于神經(jīng)干細胞可定向分化成為多巴胺神經(jīng)元，其移植后一方面增加了多巴胺神經(jīng)元的數(shù)量，另一方面可能通過刺激因子作用分化成為不同神經(jīng)元的同時，分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，從而更有利于多巴胺神經(jīng)元的存活。

表3 干細胞組與聯(lián)合組腦組織Nestin/GFP、TH/GFP、GFAP/GFP比較

注：與干細胞組比較，*P<0.01。

SPIO是一種組織特異性磁共振對比劑，具有超順磁性。SPIO顆粒分布于組織后可擾亂內(nèi)部磁場，引起質(zhì)子自旋快速失相位，從而縮短組織的T2和T1值，特別是T2值的縮短更明顯，故可采用T2 FFE觀察SPIO標記神經(jīng)干細胞移植后的定植和遷移情況[12]。動態(tài)MRI掃描能提供近細胞級分辨率的圖像和整體影像，分辨率、敏感度均較高。通過MRI示蹤SPIO標記的神經(jīng)干細胞，能夠在活體上進行直觀追蹤，從而了解其在大鼠腦內(nèi)的分布、遷徙、分化情況，有助于臨床上進行移植治療后的在體療效觀察和功能恢復評估。GFP基因標記技術(shù)具有高效、穩(wěn)定的特點，可在活細胞穩(wěn)定表達且易于檢測。本研究中SPIO、GFP雙標NSC，相對于單標可以更加直觀有效地實現(xiàn)對移植活細胞實時定位的追蹤和觀察。CM-DiI是一種無細胞毒性的熒光染料，不影響細胞的生長，適合標記和示蹤細胞，故本研究采用CM-DiI對多巴胺神經(jīng)元進行標記；MRI檢查結(jié)果顯示，聯(lián)合組停留在移植原位的細胞隨著移植時間延長逐漸向移植點周圍擴散，擴散范圍大于干細胞組；普魯士藍染色顯示，聯(lián)合組相較干細胞組也有上述趨勢。以上均說明，聯(lián)合移植相對于單獨神經(jīng)干細胞移植細胞存活數(shù)量更多，細胞遷移的范圍更廣。本研究聯(lián)合組Nestin、TH、GFP陽性細胞數(shù)及Nestin/GFP、TH/GFP均高于干細胞組，GFAP陽性細胞數(shù)及GFAP/GFP均低于干細胞組；表明聯(lián)合移植神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元的分化率高于單獨神經(jīng)干細胞移植，更有利于神經(jīng)干細胞向多巴胺神經(jīng)元分化，但是其具體機制有待進一步研究。

綜上所述，神經(jīng)干細胞與多巴胺神經(jīng)元聯(lián)合移植可顯著改善帕金森病大鼠的運動障礙，更有助于神經(jīng)干細胞的定植、遷移及分化成為多巴胺神經(jīng)元。

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Effect of combined transplantation of neural stem cells and dopaminergic neurons on dyskinesia in rats with Parkinson disease

LIZhigao,XUJiaotian,CHENXiaoxiang,LINHai,SONGXiaobin,YANGZhiyong,DENGXingli

(TheFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China)

ObjectiveTo explore the efficacy of combined transplantation of neural stem cells (NSCs) and dopaminergic (DA) neurons in treatment of dyskinesia in rats with Parkinson disease (PD).MethodsThirty-six rat models with PD were established by using the classical 6-hydrodopamine damage protocol, and followed by 4-week rotation induction via apomorphine (APO) intraperitoneal injection. These 36 PD rats were randomly divided into the following groups after 4 weeks of APO intraperitoneal injection: the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group, and normal saline (NS), CM-DiI labeled DA neurons, GFP-SPIO double labeled NSCs, and CM-Dil labeled DA neurons combined with double labeled NSCs neurons were transplanted into the right striatum of these groups by stereotactic injection, respectively. The rotation frequency of these groups was calculated at week 2, 4, 6, and 8 after the transplantation. Moreover, the NSCs group and DA-NSCs group were scanned by MRI at week 1, 2, 4, and 8. The brain tissues of these groups were collected to observe the migration and homing of the transplanted cells after 8 weeks through prussian blue staining, and the differentiation of NSCs was measured by immunofluorescence.ResultsThe rotation frequencies of the control group, the DA neurons group, the NSCs group, and the NSCs-DA group were decreased gradually, and significant difference was found between every two groups, allP<0.01. The results of MRI scan between NSCs group and NSCs-DA group were as following: over the time of transplantation, the hypointense signal area in T2 W/FFE imaging of both groups were larger than before, and the area in the NSCs-DA group was larger than that of the NSCs group. The results of prussian blue staining suggested that there were a lot of blue particles in the cytoplasm of NSCs and its differentiated cells, which were grafted from the NSCs group and NSCs-DA group. However, just a few cells migrated from the transplantation needle core to the distant, but the most of these blue particles were located on the transplantation sites. And the number of the blue particles in the NSCs-DA group was higher, and its diffusion range was larger than that of the NSCs group. Moreover, there were much more Nestin, TH and GFP positive cells in the NSCs-DA group than in the NSCs group, while the GFAP positive cells and the rates of GFAP/GFP were less than those of the NSCs group (allP<0.01).ConclusionThe combined transplantation of NSCs and DA neurons can improve the movement disorder of PD rats significantly, which helps to promote the grafted NSCs homing, migration, and differentiation into DA neurons.

Parkinson disease; neural stem cells; dopaminergic neuron; neural stem cell transplantation; neuron transplantation

國家自然科學基金資助項目(81241126,81360197)；云南省教育廳科學研究基金資助項目(2013C227)；云南省科技廳-昆明醫(yī)學院聯(lián)合專項(2014FB041) 。

李智高(1975-)，男，主治醫(yī)師，主要研究方向為干細胞移植治療帕金森。E-mail： 459920510@qq.com

鄧興力(1979-)，男，副教授，主要研究方向為干細胞移植治療帕金森。E-mail： dxlkmmu@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.007

R742.5

A

1002-266X(2017)20-0024-04

2016-10-23)