NOX通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用

王井，汪洪濤，馬華，孫美群，趙衛(wèi)東

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥 230001;2 蚌埠醫(yī)學(xué)院)

NOX通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用

王井1，汪洪濤2，馬華2，孫美群2，趙衛(wèi)東1

(1安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院，合肥 230001;2 蚌埠醫(yī)學(xué)院)

目的 探討煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用。方法 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同類型宮頸癌細(xì)胞內(nèi)在的總活性氧(ROS)水平及NOX途徑抑制劑DPI處理前后不同類型宮頸癌細(xì)胞內(nèi)線粒體途徑和NOX途徑ROS水平；DPI預(yù)處理、H2O2作用后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同類型宮頸癌細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 人乳頭瘤病毒(HPV)陽性宮頸癌細(xì)胞內(nèi)在ROS水平明顯高于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞(P<0.05)，兩類宮頸癌細(xì)胞線粒體途徑來源ROS水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與預(yù)處理前比較，DPI預(yù)處理后HPV陽性宮頸癌細(xì)胞內(nèi)在ROS水平均明顯降低(P均<0.05)。與誘導(dǎo)前及HPV陰性宮頸癌細(xì)胞比較，H2O2誘導(dǎo)后HPV陽性宮頸癌細(xì)胞凋亡率均明顯升高，且高于DPI預(yù)處理及DPI預(yù)處理+H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞(P均<0.05)。結(jié)論 NOX通路在HPV感染導(dǎo)致宮頸癌的過程中具有重要作用，促氧化治療可能更好地殺傷HPV陽性宮頸癌細(xì)胞。

宮頸癌；人乳頭瘤病毒；氧化應(yīng)激；活性氧；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

宮頸癌在全球婦女癌癥病死率中位居第二，僅次于乳腺癌，在一些發(fā)展中國家甚至居于首位，并具有年輕化趨勢；全球每年大約有50萬婦女發(fā)病，我國每年有13～15萬新發(fā)宮頸癌病例，占全球新發(fā)病例的1/3，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的健康和生命[1]。人乳頭瘤病毒(HPV)感染是宮頸癌的主要致病因子，宮頸上皮組織暴露與氧化應(yīng)激，促進(jìn)了病毒的持續(xù)和慢性感染。在宿主細(xì)胞中病毒基因組的整合產(chǎn)生遺傳重排，基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致致瘤轉(zhuǎn)化的風(fēng)險增加[2,3]。研究表明，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞比HPV陰性宮頸癌細(xì)胞對化療和放療有更好的反應(yīng)性[4,5]，化療和放療主要通過產(chǎn)生高濃度活性氧(ROS)引起細(xì)胞凋亡。因此，闡明ROS的分子信號機(jī)制，有助于我們理解HPV致病機(jī)制及優(yōu)化治療HPV相關(guān)腫瘤的策略。2015年8月～2016年8月我們進(jìn)行了如下研究，旨在探討不同類型宮頸癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，以及NOX通路在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞系：HPV-16陽性細(xì)胞株(SiHa、CaSki)，HPV-18陽性細(xì)胞株(HeLa、C4-I)，HPV陰性細(xì)胞株(C33A細(xì)胞)；其中SiHa、CaSki、HeLa、C33A細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院北京協(xié)和細(xì)胞庫，C4-I由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研中心提供。主要試劑及儀器：DMEM，MEM培養(yǎng)基，F(xiàn)BS(Gibco)；DCHF-DA分子探針(Sigma)，線粒體特異性超氧化物分子探針MitSox(Invitrogen)，diphenyleneiodonium chloride (DPI, Sigma)；Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit (碧云天)，F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) C33A細(xì)胞使用含10% FBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，其他宮頸癌細(xì)胞均使用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，每1 mL培養(yǎng)液中含青、鏈霉素各100 U，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天或隔天進(jìn)行換液，2～3天傳代一次，每次實驗使用對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 宮頸癌細(xì)胞基礎(chǔ)ROS水平檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制備成2×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，更換用無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，200 μL/孔，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次(以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA)。消化，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測。ROS水平以平均熒光強度(MFI)表示。

1.4 DPI處理前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制備成2×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后棄去培養(yǎng)基，加入用無血清培養(yǎng)基稀釋的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)途徑特異性抑制劑DPI(終濃度1 μmol/L)，作用60 min。負(fù)載探針MitoSox (終濃度5 μmol/L)，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min。消化，收集細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測。ROS水平以MFI表示。

1.5 H2O2誘導(dǎo)前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平及細(xì)胞凋亡率檢測 取對數(shù)生長期的宮頸癌細(xì)胞，胰酶消化處理，完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制備成2×105個/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，2 mL/孔，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿70%～80%瓶底，DPI預(yù)處理1 h(終濃度1 μmol/L)或不處理，更換含100 μmol/L H2O2的完全培養(yǎng)基作用6 h(H2O2濃度和作用時間通過預(yù)實驗確定)，消化，收集細(xì)胞，Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率。ROS水平檢測方法同1.3。

2 結(jié)果

2.1 不同類型宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較 HPV陽性宮頸癌細(xì)胞內(nèi)基礎(chǔ)ROS水平為46 000±285(SiHa、CaSki、HeLa、C4-1分別為46 145±288、45 832±279、44 731±266、45 175±274)，HPV陰性宮頸癌細(xì)胞C33A為4 200±62，二者比較P<0.05。

2.2 DPI處理前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平比較 不同類型宮頸癌細(xì)胞線粒體水平來源ROS水平比較無明顯差異(P>0.05)。DPI處理后HPV陽性宮頸癌細(xì)胞株細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低(P<0.05)，而線粒體途徑超氧化物水平比較無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 DPI處理前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)總ROS及線粒體途徑ROS水平比較

注：與DPI處理前比較，*P<0.05。

2.3 H2O2誘導(dǎo)前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化及細(xì)胞凋亡 H2O2誘導(dǎo)不同宮頸癌細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)總ROS水平均明顯升高(P均<0.05)，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P均<0.05)；與HPV陰性宮頸癌細(xì)胞相比，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.01)；NOX途徑抑制劑DPI預(yù)處理后，能明顯降低H2O2誘導(dǎo)的HPV陽性宮頸癌細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見表2、3。

表2 H2O2誘導(dǎo)前后不同宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平比較

注：與H2O2誘導(dǎo)前比較，*P<0.05。

表3 H2O2誘導(dǎo)及NOX途徑抑制劑DPI預(yù)處理后宮頸癌細(xì)胞凋亡情況

注：與H2O2誘導(dǎo)前比較，*P<0.05，△P<0.01；與C33A細(xì)胞同時間點比較，#P<0.01；與H2O2誘導(dǎo)后比較，▲P<0.05。

3 討論

在活細(xì)胞中，內(nèi)源性ROS是新陳代謝的副產(chǎn)物，大部分內(nèi)源性的活性氧產(chǎn)生于線粒體電子傳遞鏈[5～8]。ROS也可以來源于內(nèi)外源性刺激，如UV輻射，射線輻射及化學(xué)藥物等刺激，通過NOX途徑產(chǎn)生[9]。在所有需氧細(xì)胞，ROS和抗氧化物質(zhì)處于一種生理平衡狀態(tài)，一旦這種平衡被打破，發(fā)生氧化應(yīng)激，ROS產(chǎn)生增加。ROS產(chǎn)生氧化應(yīng)激會通過脂質(zhì)過氧化，DNA損傷和蛋白質(zhì)破壞，促進(jìn)正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞[10,12]。ROS也可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移[13～15]，因此長期以來ROS被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)的重要因素。然而，近年來對ROS的研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體可以利用ROS控制癌細(xì)胞的生長，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移[16～18]，所以細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)很可能成為潛在的治療靶標(biāo)。

高危型HPV感染與宮頸癌關(guān)系密切，其中HPV16和HPV18是最常見的兩種類型[6]。很多研究表明，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞比HPV陰性宮頸癌細(xì)胞對化療和放療有更好的反應(yīng)性[4,5]。為了探討氧化應(yīng)激與HPV是否存在一定的關(guān)聯(lián)，我們分別選取了HPV16陽性、HPV18陽性及HPV陰性宮頸癌細(xì)胞作為研究對象，利用DCHF-DA分子探針檢測這些癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平。本研究結(jié)果表明，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的胞內(nèi)ROS水平明顯高于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞，與Marullo等[19]在HPV相關(guān)頭頸癌細(xì)胞的研究結(jié)果類似。Marullo等[19]研究結(jié)果顯示HPV相關(guān)頭頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS的升高與致瘤蛋白HPV E6/E7的作用有關(guān)。HPV陽性宮頸癌細(xì)胞內(nèi)高水平的ROS暗示其胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)存在缺陷，放化療治療通?？梢鹧趸瘧?yīng)激產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞毒害作用，引起腫瘤細(xì)胞死亡。HPV陽性宮頸癌細(xì)胞對放化療比HPV陰性細(xì)胞敏感可能與宮頸癌細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)。ROS有兩種主要途徑：線粒體途徑和NOX途徑。我們研究發(fā)現(xiàn)，NOX途徑是HPV陽性宮頸癌細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要來源，NADPH氧化酶最早發(fā)現(xiàn)于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此又稱呼吸爆發(fā)氧化酶或巨噬細(xì)胞氧化酶，在先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。吞噬細(xì)胞NADPH氧化酶生成的ROS主要起細(xì)胞防御功能，而非吞噬細(xì)胞中NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS通常作為信號分子，參與機(jī)體內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、衰老和凋亡等。大量研究證明腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有比正常細(xì)胞較高的ROS，來幫助維系其異常增殖[20～22]。

子宮頸處于特殊位置，接觸和遭受病毒感染機(jī)會大。但并不是所有感染HPV的患者都最終發(fā)展成為宮頸癌，因此推測其他因素參與了宮頸癌的發(fā)生。病毒感染可引起人體廣泛的氧化應(yīng)激反應(yīng)，使局部組織的ROS水平持續(xù)升高，進(jìn)一步促進(jìn)病毒的損傷作用及病毒基因組整合到宿主細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。有人提出使用抗氧化劑治療腫瘤，但許多抗氧化劑不但沒有抗腫瘤作用，反而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[16～18]；而促氧化治療藥物卻取得了很好的治療作用，化療和放療主要通過產(chǎn)生高濃度ROS殺死腫瘤細(xì)胞。目前，增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平的藥物逐漸應(yīng)用于臨床，主要通過增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平加速腫瘤細(xì)胞凋亡從而達(dá)到治療目的。一些研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞(包括宮頸癌細(xì)胞)中ROS和抗氧化物含量均較高，高水平抗氧化物是腫瘤細(xì)胞用于抑制高水平的氧化物維持其生長的防御屏障，能提高其抗氧化應(yīng)激損傷能力[23,24]。本研究結(jié)果顯示，H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，使用NOX途徑特異性抑制劑可明顯降低HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的凋亡率。因此，抗氧化治療可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞受益要多于正常細(xì)胞，甚至?xí)铀倌[瘤的生長和轉(zhuǎn)移。增加腫瘤細(xì)胞內(nèi)氧化物水平，降低抗氧化物質(zhì)表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力下降，可能提高放化療的效果。

綜上所述，不同類型的宮頸癌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)不同，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平高于陰性宮頸癌細(xì)胞。NOX途徑是HPV陽性宮頸癌細(xì)胞ROS的主要來源，促氧化治療可能更好地殺傷HPV陽性宮頸癌細(xì)胞，為宮頸癌及HPV相關(guān)腫瘤的治療提供新靶標(biāo)。

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《山東醫(yī)藥》關(guān)于摘要與關(guān)鍵詞的說明

論著需附中、英文摘要(包括目的、方法、結(jié)果、結(jié)論四部分)。中文摘要300～500字，英文摘要400～500個實詞。英文摘要尚應(yīng)包括文題、作者姓名(漢語拼音)。論著、基礎(chǔ)研究、臨床研究、綜述與講座需標(biāo)引關(guān)鍵詞2～5個，盡量使用美國國立醫(yī)學(xué)圖書館編輯的最新版《Index Medicus》中醫(yī)學(xué)主題詞表(MeSH)所列的詞。英文關(guān)鍵詞中的縮寫詞應(yīng)按MeSH還原為全稱。

Effect of NOX pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells

WANGJing1,WANGHongtao,MAHua,SUNMeiqun,ZHAOWeidong

(1AnhuiProvincialHospital,Hefei230001,China)

ObjectiveTo investigate the oxidative stress status of different types of cervical cancer cells, and the role of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NOX) pathway in oxidative stress-induced apoptosis of cervical cancer cells.MethodsFlow cytometry (FCM) was employed to detect the levels of total reactive oxygen species (ROS) of different types of cervical cancer cells and intracellular ROS levels derived from mitochondrial and NOX pathway before and after treatment with a NOX inhibitor, DPI. After DPI pretreatment and H2O2action, flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of different types of cervical cancer cells.ResultsHPV-positive cells showed higher levels of ROS as compared with HPV-negative cells (P<0.05). No significant difference was found in the mitochondrial pathway-derived ROS level between HPV-negative cells and HPV-positive cells (P>0.05). NOX inhibitor DPI significantly reduced ROS level in HPV-positive cells as compared with that before treatment (P<0.05). Compared with the control group and the HPV-negative cells, the apoptosis rate of HPV-positive cells increased after H2O2induction and was higher than that of HPV-positive cells group with DPI pretreatment and with DPI pretreatment + H2O2induction.ConclusionNOX pathway plays an important role in the process of HPV inducing cervical cancer, and pro-oxidant treatment may be more effective in killing HPV-positive cervical cancer cells.

cervical carcinoma; human papilloma virus; stress; reactive oxygen species; nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase

安徽高校自然科學(xué)基金重點項目(KJ2016A472)。

王井(1983-)，女，本科，主治醫(yī)師，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail： 119877366@qq.com

趙衛(wèi)東(1970-)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要研究方向為婦科腫瘤。E-mail： victorzhao@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.004

R737.33

A

1002-266X(2017)20-0013-04

2016-09-06)