芍藥分生組織決定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息學(xué)分析

吳彥慶，成夢琳，趙大球，陶 俊，

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

芍藥分生組織決定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息學(xué)分析

吳彥慶1，成夢琳2，趙大球2，陶 俊1，2

(1.揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué) 園藝與植物保護(hù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

花分生組織決定基因APETALA2(AP2)屬于植物ABCDE模型基因，在花器官發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用。為進(jìn)一步了解芍藥AP2基因的生物學(xué)功能，利用RACE擴(kuò)增和測序技術(shù)克隆plAP2基因序列，利用生物信息學(xué)在線程序?qū)ζ湫蛄刑卣鳌⒌鞍捉Y(jié)構(gòu)及功能、亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，并利用MEGA 5.0構(gòu)建不同植物AP2分子進(jìn)化樹，最后利用qPCR檢測其在內(nèi)外花瓣中的差異表達(dá)情況。結(jié)果顯示，克隆獲得芍藥AP2基因(plAP2)cDNA序列全長1 935 bp，其ORF全長為1 578 bp，編碼525個氨基酸。蛋白結(jié)構(gòu)與功能分析表明，plAP2蛋白為親水性不穩(wěn)定蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽，表明為非分泌蛋白；核定位信號位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS)；二級結(jié)構(gòu)包括α-螺旋(24%)、β-折疊(19%)、β-轉(zhuǎn)角(28%)和無規(guī)則卷曲(28%)；plAP2蛋白存在8個糖基化位點(diǎn)和64個磷酸化位點(diǎn)，plAP2蛋白包含2個相同的保守結(jié)構(gòu)域：AP2/(Ethylene-Responsive factors，ERF)(151-213aa和243-306aa)。亞細(xì)胞定位主要在細(xì)胞質(zhì)(45.0%)中，少量分布于微體、線粒體基質(zhì)間隙和溶酶體；進(jìn)化樹分析表明，芍藥AP2基因與牡丹高度同源且親緣關(guān)系最近；qPCR檢測顯示外瓣AP2表達(dá)量均極顯著高于內(nèi)瓣(P<0.01)?？寺〕錾炙嶢P2全長cDNA序列，系統(tǒng)地揭示了plAP2蛋白基本結(jié)構(gòu)、功能位點(diǎn)區(qū)域、細(xì)胞定位以及組織表達(dá)情況，為今后深入研究plAP2基因功能提供基礎(chǔ)素材和理論參考。

芍藥；APETALA2基因；RACE；生物信息學(xué)

花器官形成作為被子植物生長發(fā)育與進(jìn)化過程中的重要環(huán)節(jié)，是一個比較復(fù)雜的形態(tài)和生理生化變化的過程，并且受到多基因調(diào)控[1]，因此花器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制研究受到許多學(xué)者的廣泛關(guān)注。 目前，有關(guān)花器官發(fā)育的分子機(jī)制研究主要集中在擬南芥 (Arabidopsisthaliana)、金魚草(Antirrhinummajus)、矮牽牛(Petuniahybrid)等模式植物上，植物花器官發(fā)育ABC模型在1991年被首次提出來[2]，并發(fā)現(xiàn)FBP(Floral binding protein)7和FBP11 基因在模式生物矮牽牛胚珠發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用[3]，隨后ABCD模型被Colombo等[4]提出；此外，Pelaz等[5-6]在擬南芥中分離出SEP1/2/3(SEPALLATA1/2/3) 基因，并研究發(fā)現(xiàn)在SEP1/2/3突變導(dǎo)致花器官形態(tài)發(fā)生改變，變成萼片狀結(jié)構(gòu)，從而提出花器官發(fā)育ABCDE模型。其中，APETALA2(AP2) 基因?qū)儆谥参锘ㄆ鞴侔l(fā)育ABCDE模型家族基因，在植物萼片和花瓣形成過程中起著重要的調(diào)控作用[7]。目前，在擬南芥 (Arabidopsisthaliana)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、玉米(Zeamays)、草莓(Fragariaananassa)、蘋果(Malusdomestica) 等植物上，已成功分離出AP2 基因cDNA全長[8-12]。芍藥 (PaeonialactifloraPall.)作為我國的傳統(tǒng)名花，其花型優(yōu)劣直接關(guān)系到芍藥科植物的觀賞價值和商業(yè)價值，然而芍藥AP2(plAP2) 基因的序列信息和功能機(jī)制尚不清楚。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和計算機(jī)信息時代的發(fā)展，cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends，RACE)和生物信息學(xué)目前已經(jīng)被廣泛用于初步揭示未知基因的結(jié)構(gòu)與功能[13-15]。因此，本研究以芍藥托桂型品種向陽奇花的花瓣為試驗(yàn)材料，利用RACE克隆測序獲得plAP2 基因全長cDNA序列，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測其序列特征、蛋白結(jié)構(gòu)與功能以及基因定位等信息，并分析不同植物間plAP2 分子進(jìn)化起源關(guān)系，為今后深入研究plAP2 基因功能提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)植物：本試驗(yàn)選用芍藥托桂型品種向陽奇花的內(nèi)外花瓣(來源于揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院芍藥種質(zhì)資源圃)為試驗(yàn)材料，進(jìn)行芍藥AP2(plAP2) 基因克?。簧噭篋L2000 Marker、RNA純化試劑盒DNase Ⅰ、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix ExTaqⅡ、3′-full和5′-full RACE Core Set Ver.2.0試劑盒均購于TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計

由于芍藥基因組信息尚未公布，參考前期芍藥花色嵌合體品種金輝花瓣的無參轉(zhuǎn)錄組de novo測序獲得的plAP2 部分mRNA序列[16]，設(shè)計3′-full和5′-full RACE擴(kuò)增引物以及熒光定量引物(表1)，并送上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 plAP2基因引物信息

1.3 RNA提取及RACE克隆

根據(jù)TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒(大連寶生物工程有限公司)提取方法，分別提取芍藥內(nèi)外花瓣總RNA。以總RNA為模板(1.0 μg)，參考3′和5′-full RACE Core Set Kit試劑盒說明書分別進(jìn)行3′-full和5′-full RACE擴(kuò)增，2輪PCR擴(kuò)增結(jié)束后將產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。最后，PCR產(chǎn)物純化回收后，將目的片段與克隆載體pMD18-T連接、轉(zhuǎn)化并挑取質(zhì)粒送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.4 序列同源性分析

克隆產(chǎn)物經(jīng)測序獲得芍藥plAP2 基因cDNA序列后，利用ORF Finder軟件(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測出芍藥plAP2基因編碼序列(ORF)和氨基酸序列。此外，利用Blast軟件對芍藥plAP2基因與擬南芥、葡萄、蘋果、番茄、矮牽牛、毛果楊等不同植物進(jìn)行同源性分析 (http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，并通過DNAMAN軟件生成不同植物plAP2基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 蛋白理化性質(zhì)與基本結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ProtParam軟件(http：//web.expasy.org/protparam/)分析芍藥plAP2蛋白的理化性質(zhì)，ProtScale軟件(http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)預(yù)測 plAP2蛋白疏水性區(qū)域；TMHMM 2.0軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測plAP2蛋白跨膜螺旋結(jié)構(gòu)；SignalP 4.0軟件[17]分析信號肽，Antheprot 5.0 (Universite Claude Bernard，Lyon，http：//www.intute.ac.uk)軟件分析plAP2蛋白二級結(jié)構(gòu)，其中包括α螺旋(α-helix)、β折疊(β-sheet)、β轉(zhuǎn)角(β-turn)、無規(guī)則卷曲(Random coil)；NLStradamus[18]分析核定位信號以及NetNES1.1[19]軟件分析核運(yùn)出信號。

1.6 蛋白功能位點(diǎn)及保守功能域分析

在真核生物中，磷酸化和糖基化是最常見的2種組蛋白翻譯后修飾方式，其中糖基化主要發(fā)生于天冬酰胺(Asn)殘基，而磷酸化主要發(fā)生于絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)等殘基[20-21]。利用NetNGlyc軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測芍藥plAP2蛋白潛在的糖基化位點(diǎn)以及NetPhos軟件預(yù)測潛在的磷酸化位點(diǎn)[22]，以及利用NCBI CDD軟件[23]和SMART軟件[24]綜合分析蛋白保守功能區(qū)域。

1.7 亞細(xì)胞定位分析

基因亞細(xì)胞定位(Subcellular localization)是研究植物生長、形態(tài)發(fā)育機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，也為初步分析與推測其基因可能發(fā)揮的生物學(xué)功能提供一定的參考信息。本研究利用TargetP[25]軟件以及PSORTⅡPrediction軟件(http：//psort.hgc.jp/form.html)對plAP2 基因亞細(xì)胞定位進(jìn)行綜合分析。

1.8 基因表達(dá)分析

利用BIO-RAD CFX96 TM Real-time System (C1000 TM Thermal Cycler) (Bio-Rad，USA)系統(tǒng)檢測plAP2 基因定量表達(dá)水平。25 μL定量反應(yīng)體系包括12.5 μL 29 SYBR Premix Ex TaqTM，50× ROX Reference Dye Ⅱ 0.5 μL，2 μL cDNA模板，2 μL Primer引物，8 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 芍藥plAP2 基因克隆及序列分析

RACE擴(kuò)增結(jié)果顯示(圖1)，芍藥plAP2基因5′端擴(kuò)增獲得2 500 bp序列，3′端擴(kuò)增獲得550 bp序列，經(jīng)測序拼接到一條全長為1 935 bp的cDNA序列，ORF Finder分析發(fā)現(xiàn)該cDNA序列包括一個1 578 bp的開放閱讀框(ORF)，222 bp 5′端非翻譯區(qū)(5′-UTR)，135 bp 3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)，編碼525個氨基酸(圖2)。通過Blast分析發(fā)現(xiàn)，該基因與牡丹(Paeoniasuffruticosa，HQ222889)、擬南芥 (Arabidopsisthaliana，NM_119856)、蘋果(Malusdomestica，NM_001293950)、油菜(Brassicanapus，XM_013852206)、葡萄(Vitisvinifera，NM_001280952)、矮牽牛(Petuniahybrid，AF132001)、番茄(Solanumlycopersicum，EU677382)同源性分別達(dá)到92.7%，45.9%，54.7%，45.7%，59.9%，58.5%，48.7%。利用MEGA 5.0構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，芍藥與牡丹聚為一類，矮牽牛和番茄聚為一類，葡萄和蘋果聚為一類，擬南芥和油菜聚為一類(圖3)。

M.DL2000 Marker;3′.3′端擴(kuò)增產(chǎn)物；5′.5′端擴(kuò)增產(chǎn)物。

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)與功能的生物信息學(xué)分析

2.2.1 基本理化性質(zhì) ProtParam程序分析蛋白理化性質(zhì)結(jié)果顯示，芍藥plAP2蛋白分子式為C2528H3937N769O815S19，相對分子質(zhì)量約為58.75 kDa，理論等電點(diǎn)pI為7.67，帶負(fù)電荷和正電荷的氨基酸殘基數(shù)分別為67，68個；plAP2蛋白脂溶指數(shù)為53.31，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)為51.94 (大于40)，總平均親水性(GRAVY)為-0.912，表明plAP2為不穩(wěn)定、親水性蛋白[26]。

圖2 芍藥plAP2基因cDNA序列

圖3 芍藥與不同植物plAP2基因進(jìn)化樹分析

2.2.2 跨膜螺旋與疏水性 ProtScale程序分析親/疏水性結(jié)果顯示，親水性區(qū)域大于疏水性，并且芍藥plAP2蛋白最大親水性值處于第140位氨基酸，最大疏水性處于第45位氨基酸；TMHMM 2.0程序分析跨膜結(jié)構(gòu)顯示，plAP2蛋白無跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。

2.2.3 信號肽預(yù)測 信號肽是引導(dǎo)蛋白肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行加工合成的一段疏水性區(qū)域(通常位于分泌蛋白N端15-35氨基酸，信號肽剪切位點(diǎn)有無主要根據(jù)Y最大值(Max.Y)來判斷，而是否為分泌蛋白根據(jù)S平均值(Mean S)來判斷，本研究結(jié)果表明(圖4)，Max.Y值為0.108，Mean S值為0.107(均小于0.5)，表明plAP2無信號肽剪切位點(diǎn)，為非分泌蛋白。此外，使用NetNES 1.1 prediction預(yù)測核運(yùn)出信號肽，NES評分的估計是通過HMM(隱馬爾柯夫模型)和NN(人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型)方法綜合評分，結(jié)果顯示plAP2蛋白不存在核運(yùn)出信號肽，其次利用NLStradamus對核定位信號專門進(jìn)行預(yù)測，選擇隱馬爾科夫模型4，閾值(Threshold)默認(rèn)為0.6[18]，預(yù)測結(jié)果顯示(圖4-B)plAP2蛋白中氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS)為核定位信號。

A.核運(yùn)出位信號預(yù)測；B.核定位信號預(yù)測；C.剪切信號肽預(yù)測。

2.2.4 糖基化和磷酸化位點(diǎn) NetNGlyc程序分析糖基化位點(diǎn)顯示(圖5)，芍藥plAP2蛋白存在8個糖基化位點(diǎn)，分別位于32/205/220/328/334/383/423/439號氨基酸；NetPhos軟件預(yù)測磷酸化位點(diǎn)顯示，plAP2蛋白存在64個潛在磷酸化位點(diǎn)，其中包括44個絲氨酸(Ser)位點(diǎn)、15個蘇氨酸(Thr)位點(diǎn)和5個酪氨酸(Tyr)位點(diǎn)。

2.2.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 Antheprot 5.0軟件基于Garnier方法預(yù)測二級結(jié)構(gòu)顯示，plAP2蛋白中α-螺旋(α-helix)占24%，β-折疊(β-sheet)占19%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(β-turn)占28%，無規(guī)則卷曲(Random coil)占28%。

2.2.6 保守功能域分析 利用SMART和NCBI CDD程序綜合分析保守結(jié)構(gòu)域顯示(圖6)，plAP2蛋白具有2個相同的保守結(jié)構(gòu)域-AP2 domain，分別位于151-213號和243-306號氨基酸之間。研究發(fā)現(xiàn)，乙烯應(yīng)答元件結(jié)合因子(Ethylene-responsive factors，ERF)在植物生長發(fā)育過程中起著重要作用，并且該調(diào)控元件存在于AP2結(jié)構(gòu)域[27]。

A.SMART預(yù)測結(jié)果；B.NCBI CDD預(yù)測結(jié)果。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

TargetP亞細(xì)胞定位分析顯示(表2)，plAP2蛋白主要定位在細(xì)胞其他位置(分值：0.946)，而很少分布在線粒體(分值：0.078)和信號肽分泌途徑(分值：0.046)上；此外，利用PSORTⅡPrediction分析發(fā)現(xiàn)主要在細(xì)胞質(zhì)(Cytoplasm，45.0%)中發(fā)揮生物學(xué)功能，并且在微體、線粒體基質(zhì)間隙和溶酶體中也有少量分布。綜合分析表明，plAP2為非分泌蛋白。

表2 plAP2蛋白的亞細(xì)胞定位分析

2.4 芍藥內(nèi)外花瓣AP2 基因差異表達(dá)分析

利用qPCR分析芍藥花型托桂型品種向陽奇花內(nèi)外花瓣(各4份)中AP2 基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示(圖7)，向陽奇花外瓣AP2 表達(dá)量均極顯著高于內(nèi)瓣(P<0.01)。

**.內(nèi)瓣與外瓣之間AP2基因表達(dá)水平差異極顯著(P<0.01)。

**.The highly significant difference ofAP2 gene expression between outer-petal and inner-petal(P<0.01).

圖7 芍藥內(nèi)外花瓣差異表達(dá)分析

Fig.7 Differential expression analysis between outer-petal and inner-petal inPaeonialactiflora

3 討論

目前,廣泛用于解釋花器官發(fā)育的分子機(jī)制主要是ABCDE模型，其中A類功能基因大多是AP2 類轉(zhuǎn)錄因子基因。AP2 基因在1994年首次在擬南芥(Arabidopsisthaliana)模式植物中被分離出[8]，隨后在草莓(Fragariaananassa)、牡丹(Paeoniasuffruticosa)、玉米(Zeamays)、蘋果(Malusdomestica)等植物中也進(jìn)行了相關(guān)研究[9-12]。隨著高通量測序的出現(xiàn)，許多物種的全基因組序列信息已經(jīng)公布于GenBank數(shù)據(jù)庫，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、水稻 (Oryzasativa)、葡萄(Vitisvinifera)、蘋果(Malusdomestica)等物種，為基因的功能研究提供了序列參考。然而，由于芍藥基因組尚未公布，芍藥未知基因序列的分離與克隆陷入困境。新一代測序技術(shù)—轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)的出現(xiàn)，可以對無參考基因組的物種進(jìn)行高通量測序，因此前期對芍藥花色嵌合體品種金輝花瓣進(jìn)行了無參轉(zhuǎn)錄組de novo測序[16]，獲得了大量未知Unigene的部分mRNA序列，同時cDNA末端的快速擴(kuò)增RACE是一種以部分的已知區(qū)域序列為起點(diǎn)，擴(kuò)增基因轉(zhuǎn)錄本未知區(qū)域，從而獲得 mRNA(cDNA)完整序列的有效方法，本研究參考轉(zhuǎn)錄組測序并運(yùn)用RACE方法成功克隆出芍藥AP2(plAP2)基因cDNA全長序列1 935 bp，為今后利用qPCR、過表達(dá)等技術(shù)來深入研究plAP2基因功能提供有利的素材。

研究發(fā)現(xiàn)，AP2類轉(zhuǎn)錄因子參與乙烯、脫落酸等有機(jī)酸合成信號傳導(dǎo)途徑，在植物生長、花器官發(fā)育、抗逆性等過程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能[28-30]。一般而言，基因發(fā)揮生物學(xué)功能與蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域密切相關(guān)。本研究利用生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)plAP2蛋白具有64個潛在磷酸化位點(diǎn)和8個糖基化位點(diǎn)，并且含有2個保守的結(jié)構(gòu)域-AP2(也叫Ethylene-responsive factor，ERF)，這與Jofuku等[8]在擬南芥中研究結(jié)果一致。此外，有關(guān)學(xué)者在煙草(NicotianatabacumL.)中同樣分離出乙烯響應(yīng)元件結(jié)合蛋白ERF結(jié)構(gòu)域[31]，由此表明AP2/ERF是植物中一個保守的基因家族。本研究在芍藥AP2蛋白中預(yù)測出1個核定位信號肽(139-147)以及2個ERF保守結(jié)構(gòu)域(151-213位和243-306位氨基酸)，為今后篩選功能性SNPs位點(diǎn)以及利用基因沉默技術(shù)(RNAi和CRISPR/Cas9)來驗(yàn)證plAP2基因功能提供理論參考。此外，雖然有研究發(fā)現(xiàn)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族的結(jié)構(gòu)和進(jìn)化在擬南芥、水稻和大豆中是相對保守的[32]，但是ABCDE模型在不同雙子葉植物類群中保守性差異很大[33]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻ERF結(jié)構(gòu)域家族基因具有XI-XIV亞組，而在擬南芥中沒有發(fā)現(xiàn)此亞組基因[34]，并且水稻中部分基因雖然與擬南芥、金魚草等物種具有高度同源性，但是在發(fā)揮生物學(xué)功能上出現(xiàn)一定的區(qū)別[35]。本研究發(fā)現(xiàn)芍藥AP2基因與牡丹高度同源(達(dá)90%以上)，而與擬南芥、葡萄、矮牽牛等植物同源性較低(接近50%)，由此推測花器官發(fā)育模型ABCDE的作用機(jī)制是否完全適用于芍藥還有待進(jìn)一步研究。

[1] 曾 英， 胡金勇， 李志堅.植物MADS盒基因與花器官的進(jìn)化發(fā)育[J].植物生理學(xué)通訊，2001，37(4)：281-287.

[2] Coen E S，Meyerowitz E M.The war of the whorls：genetic interactions controlling flower development[J].Nature，1991，353(6339)：31-37.

[3] Angenent G C，F(xiàn)ranken J，Busscher M，et al.A novel class of MADS box genes is involved in ovule development in petunia[J].The Plant Cell，1995，7(10)：1569-1582.

[4] Colombo L，F(xiàn)ranken J，Koetje E，et al.The petunia MADS box geneFBP11 determines ovule identity[J].The Plant Cell，1995，7(11)：1859-1868.

[5] Pelaz S，Ditta G S，Baumann E，et al.B and C floral organ identity functions require SEPALLATA MADS-box genes[J].Nature，2000，405(6783)：200-203.

[6] Pelaz S，Gustafson-Brown C，Kohalmi S E，et al.APETALA1 and SEPALLATA3 interact to promote flower development[J].The Plant Journal：for Cell and Molecular Biology，2001，26(4)：385-394.

[7] Maes T，Van De Steene N，Zethof J，et al.Petunia Ap2-like genes and their role in flower and seed development[J].The Plant Cell，2001，13(2)：229-244.

[8] Jofuku K D，Den Boer B G，Van Montagu M，et al.Control of arabidopsis flower and seed development by the homeotic geneAPETALA2[J].The Plant Cell，1994，6(9)：1211-1225.

[9] 任 磊.牡丹花器官發(fā)育相關(guān)基因的克隆與表達(dá)[D].北京： 中國林業(yè)科學(xué)研究院，2011.

[10] 宿紅艷， 周盛梅， 王 磊， 等.草莓APETALA2同源基因的克隆及表達(dá)分析[J].西北植物學(xué)報，2005，25(10)：1937-1942.

[11] Zhuang J，Deng D X，Yao Q H，et al.Discovery，phylogeny and expression patterns of AP2-like genes in maize[J].Plant Growth Regulation，2010，62(1)：51-58.

[12] Zhuang J，Yao Q H，Xiong A S，et al.Isolation，phylogeny and expression patterns of AP2-like genes in apple(Malus×domesticaBorkh) [J].Plant Molecular Biology Reporter，2011，29(1)：209-216.

[13] 羅睿雄， 趙志常， 高愛平， 等.芒果4CL基因的克隆及其表達(dá)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2016，31(1)：57-62.

[14] 雷海英， 白鳳麟， 劉建霞， 等.玉米Zmcen基因的克隆，表達(dá)與生物信息學(xué)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報，2016，31(3)：18-24.

[15] 侯艷霞， 湯浩茹， 林源秀， 等.基于RACE方法的草莓Faapx-c基因克隆、表達(dá)及其生物信息學(xué)分析[J].北方園藝，2016(11)：88-92.

[16] Zhao D，Jiang Y，Ning C，et al.Transcriptome sequencing of a chimaera reveals coordinated expression of anthocyanin biosynthetic genes mediating yellow formation in herbaceous peony (PaeonialactifloraPall.) [J].BMC Genomics，2014，15(1)：689.

[17] Petersen T N，Brunak S，Von Heijne G，et al.SignalP 4.0：discriminating signal peptides from transmembrane regions[J].Nature Methods，2011，8(10)：785-786.

[18] Nguyen Ba A N，Pogoutse A，Provart N，et al.NLStradamus：a simple Hidden Markov Model for nuclear localization signal prediction[J].BMC Bioinformatics，2009，10(1)：202.

[19] La Cour T，Kiemer L，M?lgaard A，et al.Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals[J].Protein Engineering，Design & Selection，2004，17(6)：527-536.

[20] Mellquist J L，Kasturi L，Spitalnik S L，et al.The amino acid following an asn-X-Ser/Thr sequon is an important determinant of N-linked core glycosylation efficiency[J].Biochemistry，1998，37(19)：6833-6837.

[21] Kim J H，Lee J，Oh B，et al.Prediction of phosphorylation sites using SVMs[J].Bioinformatics，2004，20(17)：3179-3184.

[22] Blom N，Gammeltoft S，Brunak S.Sequence and structure-based prediction of eukaryotic protein phosphorylation sites[J].Journal of Molecular Biology，1999，294(5)：1351-1362.

[23] Marchler-Bauer A，Derbyshire M K，Gonzales N R，et al.CDD：NCBI′s conserved domain database[J].Nucleic Acids Research，2015，43：222-226.

[24] Schultz J，Milpetz F，Bork P，et al.SMART，a simple modular architecture research tool：identification of signaling domains[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1998，95(11)：5857-5864.

[25] Emanuelsson O，Nielsen H，Brunak S，et al.Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence[J].Journal of Molecular Biology，2000，300(4)：1005-1016.

[26] Wilkins M R，Gasteiger E，Bairoch A，et al.Protein identification and analysis tools in the ExPASy server[J].Methods in Molecular Biology，1999，112(112)：531-552.

[27] Weigel D.The APETALA2 domain is related to a novel type of DNA binding domain[J].The Plant Cell，1995，7(4)：388-389.

[28] 豐 錦， 陳信波.抗逆相關(guān)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2011(7)：1-6.

[29] 趙利峰， 柴團(tuán)耀.AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育和脅迫應(yīng)答中的作用[J].植物學(xué)通報，2008，25(1)：89-101.

[30] 韓志萍， 安利佳， 侯和勝.AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與功能[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2006，22(2)：33-38.

[31] Ohme-Takagi M，Shinshi H.Ethylene-inducible DNA binding proteins that interact with an ethylene-responsive element[J].The Plant Cell，1995，7(2)：173-182.

[32] Zhuang J，Anyia A，Vidmar J，et al.Discovery and expression assessment of the AP2-like genes inHordeumvulgare[J].Acta Physiologiae Plantarum，2011，33(5)：1639-1649.

[33] 張 劍， 徐桂霞， 薛皓月， 等.植物進(jìn)化發(fā)育生物學(xué)的形成與研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報，2007，24(1)：1-30.

[34] 張計育， 王慶菊， 郭忠仁.植物AP2/ERF類轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展[J].遺傳，2012，4(7)：835-884.

[35] Kyozuka J，Kobayashi T，Morita M，et al.Spatially and temporally regulated expression of rice MADS box genes with similarity toArabidopsisclass A，B and C genes[J].Plant & Cell Physiology，2000，41(6)：710-718.

Cloning and Bioinformatics Analysis ofAPETALA2 (AP2) inPaeonialactiflora

WU Yanqing1，CHENG Menglin2，ZHAO Daqiu2，TAO Jun1，2

(1.College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2.School of Horticulture and Plant Protection，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

Flower-meristem-identity geneAPETALA2(AP2) belonging to ABCDE model plays a role in regulating the development of plant floral organ.In order to understand the biological function ofP.lactifloraAP2 gene，theplAP2 gene sequence ofPaeonialactiflorawas cloned using RACE and sequencing technique technology，meanwhile the sequence signature，protein structure and function，subcellular localization were analyzed by bioinformatics methods.Molecular phylogenetic tree ofAP2 from different plants were constructed by MEGA 5.0 software.Finally，we detected the differential expression between inner-petal and outer-petal by qPCR.Results showed，the full-length cDNA sequence ofplAP2 gene was 1 935 bp and consisted of a 1 578 bp open reading frame (ORF) encoding 525 amino acid proteins.Analysis of protein structure and function showed，plAP2 was a hydrophilic and unstable protein，meanwhile plAP2 was also non-secretory protein without signal peptide and transmembrane structure.Nuclear localization signal located between 139th and 147th amino acid (KKSRRGPRS).The secondary structure of plAP2 protein contained 24% α-helices，19% β-sheet，28% β-turn and 28% random coil.plAP2 protein had eight glycosylation sites and sixty-four phosphorylation sites.plAP2 protein had two same conservative domain：AP2/ Ethylene- Responsive factors (ERF)， which was located in the region between 151 and 213，between 243 and 306，respectively.Prediction of subcellular localization showed that plAP2 located mostly in cytoplasm (45.0%)，rarely in microbody， mitochondrial matrix and lysosome.Analysis of evolutionary tree showed that theAP2 ofPaeonialactiflorawere highly homologous and close toPaeoniasuffruticosa.qPCR showed the expression ofAP2 in outer-petal was extremely significant than that in inner-petal (P<0.01).In this study，we cloned the complete cDNA sequence ofAP2 gene inPaeonialactifloraand systematically revealed the basic protein structure，functional sites，domains，cellular localization and expression level，which will provide basic materials and theoretical references for further studyingplAP2 gene function.

Paeonialactiflora；APETALA2 gene； RACE； Bioinformatics

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金項目(31372097；31400592)；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目(CX(12)2019)

吳彥慶(1988-)，男，江蘇揚(yáng)州人，博士，主要從事觀賞園藝研究。

陶 俊(1966-)，男，江蘇揚(yáng)州人，教授，博士，主要從事觀賞植物栽培生理、遺傳育種與分子生物學(xué)研究。

Q78； S682.03

A

1000-7091(2017)03-0058-07

10.7668/hbnxb.2017.03.009