花生MAPK基因的篩選和鹽脅迫分析

孔祥遠(yuǎn)，陳冠旭，秦貴龍，隋炯明，喬利仙，王晶珊，徐麗麗

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

花生MAPK基因的篩選和鹽脅迫分析

孔祥遠(yuǎn)，陳冠旭，秦貴龍，隋炯明，喬利仙，王晶珊，徐麗麗

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆脅迫過程中發(fā)揮重要作用。為了解花生中MAPK基因的情況，利用RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)花生耐鹽突變體(S2)和對(duì)照(S4)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出了14個(gè)MAPK基因，位于花生野生種基因組A組的6條染色體上。聚類分析表明，花生14個(gè)MAPK基因中13個(gè)可以聚到已報(bào)道的4個(gè)亞類中。利用花生S2和S4構(gòu)建了鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜，根據(jù)調(diào)整后的P值，篩選出6個(gè)MAPK基因在S2和(或)S4受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，分別屬于A(1個(gè))和D亞類(5個(gè))。為花生MAPK基因的功能驗(yàn)證和利用奠定了基礎(chǔ)。

花生；MAPK基因；鹽脅迫；RNA測(cè)序

促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是重要的信號(hào)通路之一，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程起著重要作用[1]。MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及MAPK、MAPKK和MAPKKK 3個(gè)蛋白激酶。MAPK傳導(dǎo)通路主要過程為：MAPKKK被磷酸化后激活MAPKK，MAPKK被磷酸化之后再激活MAPK，最后由MAPK對(duì)細(xì)胞的生理周期進(jìn)行一系列的調(diào)控，其中MAPK是位于級(jí)聯(lián)途徑的最下游區(qū)域[2]。

MAPK基因與某些生物和非生物脅迫有著密切關(guān)系。擬南芥的AtMAPK基因在抵抗非生物脅迫和病害中有重要作用[3-5]。將玉米中ZmMAPK1基因轉(zhuǎn)到擬南芥中可提高轉(zhuǎn)基因植株抵抗干旱和熱脅迫的能力[6]。亞麻L(zhǎng)uMAPK基因受鹽堿脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[7]。GhMAP16是棉花MAPK基因D組中一個(gè)新的脅迫響應(yīng)基因，轉(zhuǎn)入擬南芥后可提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱和抗病能力[8]。煙草的17個(gè)NtMAPK基因在植株防御病害中有重要作用，并且有6個(gè)NtMAPK基因?qū)Ω珊得{迫有響應(yīng)[9]。西瓜中很多ClMAPK成員對(duì)不同非生物脅迫(如干旱、鹽、冷、熱處理)有響應(yīng)[10]。此外番茄和黃瓜的MAPK基因也具有抵抗非生物脅迫的作用[11-12]。

為了分析花生MAPK基因的情況，筆者構(gòu)建了花生葉片轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，篩選了花生MAPK家族基因，并進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析、染色體定位和聚類分析。然后利用鹽脅迫處理前后的表達(dá)譜，分析了MAPK基因在鹽脅迫處理前后表達(dá)量的變化，為了解花生MAPK基因和鹽脅迫之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

在前期試驗(yàn)中，利用化學(xué)誘變(以平陽(yáng)霉素為誘變劑)進(jìn)行了花生離體誘變，并在含羥脯氨酸的培養(yǎng)基中進(jìn)行定向篩選，經(jīng)過多代檢測(cè)后獲得了1個(gè)穩(wěn)定遺傳的耐鹽突變體(S2)，其種子在0.7% NaCl 溶液中的發(fā)芽率顯著高于對(duì)照花育20(S4)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 用250 mmol/L NaCl處理生長(zhǎng)1個(gè)月的耐鹽突變體(S2)和對(duì)照(S4)植株，在0，6，12，24，48 h取葉片，每個(gè)樣品2次生物學(xué)重復(fù)，所有20個(gè)樣品混合后構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。用NR、NT、SwissProt、PFAM、KOG、GO、KEGG這七大數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了基因功能注釋。

1.2.2 花生葉片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建 對(duì)上述20個(gè)樣品進(jìn)行數(shù)字化表達(dá)譜測(cè)序，構(gòu)建表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)，并以上述轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)為參考，對(duì)表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(kù)Unigene序列進(jìn)行分析。

1.2.3MAPK基因的篩選和分析 根據(jù)上述七大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)，搜索MAPK基因。利用生物信息學(xué)軟件分析蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)。從花生全基因組數(shù)據(jù)，并根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)和比對(duì)結(jié)果進(jìn)行外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析。根據(jù)與A組野生種比對(duì)后的結(jié)果，繪制每個(gè)基因在染色體上的位置。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 通過ClustalX 程序?qū)APK蛋白進(jìn)行多序列聯(lián)配分析，序列聯(lián)配結(jié)果使用MEGA 7.0程序。采用鄰接法生成MAPK基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap 值設(shè)置為1 000。

1.2.5 蛋白多序列的比對(duì)分析及部分保守基序(Motif)分析 使用ClustalX軟件的多序列比對(duì)功能對(duì)MAPK蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)，參數(shù)均使用默認(rèn)值。使用MEME 4.11.1在線分析系統(tǒng)(http：//meme-suite.org/index.html)對(duì)MAPK蛋白進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)。

1.2.6MAPK基因的鹽脅迫響應(yīng)分析 將S2或S4樣品中，在0，6，12，24，48 h，某一基因在任意2個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量進(jìn)行比較，如果達(dá)到顯著水平(調(diào)整后的P<0.05)，則認(rèn)為該基因?qū)}脅迫有響應(yīng)。根據(jù)FPKM (Fragments kilobase of exon model per millon mapped reads)值利用軟件HemI_1.0制作熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生MAPK基因的鑒定、結(jié)構(gòu)及其在染色體位置上的分布

根據(jù)上述七大數(shù)據(jù)庫(kù)的基因功能預(yù)測(cè)結(jié)果及SMART在線工具分析其結(jié)構(gòu)域，從花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出23個(gè)候選MAPK基因。將其與公布的花生A組野生種基因組序列比對(duì)，其中c31753_g1、c40388_g1、c41119_g3和c44286_g1 4個(gè)基因不含有完整讀碼框且比對(duì)不到A組野生種基因組，c37067_g2與c37067_g3、c38354_g1與c43036_g1、c58235_g1與64143_g1、c30953_g1與c33764_g1、c37424_g1與c39725_g2 分別比對(duì)到同一位置，最終得到了14個(gè)完整的花生MAPK基因，其基本信息列于表1和圖1。

由表1可以看出，不同成員間氨基酸殘基個(gè)數(shù)差別很大，為206～669個(gè)，分子量為22.82～76.39 kDa，等電點(diǎn)在5.63～9.89，外顯子數(shù)目2～16個(gè)。除c40125_g2、c33764_g1基因編碼產(chǎn)物定位到葉綠體和細(xì)胞壁外，其余基因編碼產(chǎn)物定位到細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)上。

通過與花生A組野生種基因組序列比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)14個(gè)MAPK基因共分布于6條染色體上，多數(shù)位于3，5號(hào)染色體上，分別有4，3個(gè)基因；1，4，7號(hào)染色體各有2個(gè)基因；2號(hào)染色體上有1個(gè)基因，其他染色體上暫時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)MAPK基因(圖2)。

2.2 花生MAPK基因的聚類和基序分類

擬南芥中至少有20個(gè)MAPK基因，可分為A、B、C、D 4個(gè)亞族[10]。根據(jù)MAPK基因家族成員長(zhǎng)度差異、含不同特征的結(jié)構(gòu)域等特點(diǎn)，對(duì)花生14個(gè)MAPK基因與擬南芥的MAPK基因進(jìn)行了多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果表明，13個(gè)花生MAPK基因能聚到擬南芥的A、B、C、D 4個(gè)亞族中，這4個(gè)亞類分別包含1，4，1，7個(gè)基因；而c39725_g2單獨(dú)聚為一類，可能是新的成員(圖3)。

表1 14個(gè)花生MAPK 基因的基本信息

圖1 14個(gè)花生MAPK 基因的結(jié)構(gòu)示意圖

通過MEME 4.11.1在線分析軟件對(duì)14個(gè)MAPK基因進(jìn)行motif分析，共發(fā)現(xiàn)15個(gè)motif，其中motif4和motif8是14個(gè)MAPK基因共有的，c39725_g2只含有4個(gè)motif，分別為motif4、motif5、motif7、motif8。motif15只出現(xiàn)在c33764_g1和c37067_g3這2個(gè)基因中(圖4)。

2.3 花生MAPK基因的鹽脅迫響應(yīng)分析

利用鹽脅迫處理前后的表達(dá)文庫(kù)譜，對(duì)14個(gè)MAPK基因在脅迫處理前后的任何2個(gè)時(shí)間段間的表達(dá)量進(jìn)行比較，根據(jù)調(diào)整后的P值，確定其是否受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)基因(c42537_g2、c38354_g1)在S2和S4中均受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；4個(gè)基因(c41648_g2、c40125_g2、c33764_g1、c43948_g1)只在S2中受脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。14個(gè)花生MAPK基因在各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)量也不同，S2中FPKM值為0～94.55，S4中FPKM值的變化為0～97.04(圖 5)。c40125_g2、c42537_g2和c43948_g1在S2、S4的表達(dá)模式相同，但它們的表達(dá)曲線并不一致，c40125_g2為上調(diào)-上調(diào)-下調(diào)-上調(diào)，c42537_g2為上調(diào)-下調(diào)-下調(diào)-上調(diào)，c43948_g1為下調(diào)-下調(diào)-上調(diào)-下調(diào)。c40125_g2、c33764_g1、c41648_g2這3個(gè)基因在S2與S4的表達(dá)模式不同(圖 5)。

圖2 14個(gè)花生MAPK基因在染色體上的位置

圖3 擬南芥和花生MAPK基因的進(jìn)化樹

結(jié)合聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述6個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)的MAPK基因涉及A和D 2個(gè)亞類，其中A亞類(1/1)和D亞類(5/7)的基因受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)；而B和C 2個(gè)亞類的6個(gè)基因均不受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。

3 討論

MAPK基因在植物中廣泛存在，他們?cè)趲椭参锏钟巧锩{迫中發(fā)揮重要作用，有些成員在受到非生物脅迫時(shí)可被誘導(dǎo)表達(dá)。當(dāng)植物體在經(jīng)歷各種情況下的環(huán)境脅迫時(shí)，如干旱、極端溫度、輻射脅迫等[13-14]，MAPK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)能將細(xì)胞外的刺激透過細(xì)胞膜傳導(dǎo)到細(xì)胞膜內(nèi)乃至細(xì)胞核，使膜外的刺激物與膜內(nèi)的受體結(jié)合起來從而使細(xì)胞做出一系列反應(yīng)[15]。MAPK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)還參與細(xì)胞的防御反應(yīng)等多條途徑[5]。由此可見，深入研究MAPK的功能對(duì)于作物抗逆育種具有重要的理論和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。目前，許多植物的MAPK基因均已被分離出，其中MAPK基因家族在擬南芥中共發(fā)現(xiàn)20個(gè)AtMAPK基因[16]，水稻有17個(gè)OgMAPK基因[17]，玉米有19個(gè)ZmMAPK基因[18]。煙草有17個(gè)NtMAPK基因[19]，番茄有16個(gè)SiMAPK[20]。目前在花生中還沒有關(guān)于MAPK基因的報(bào)道。

為了分析花生中MAPK基因的情況，利用花生葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)篩出了14個(gè)MAPK基因，他們位于花生A組野生種的6條染色體上，不同染色體上的MAPK基因數(shù)目差異很大。根據(jù)已有報(bào)道，擬南芥MAPK基因可分為A、B、C、D 4個(gè)亞類，對(duì)花生的14個(gè)MAPK基因進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明其中13個(gè)MAPK基因分別聚到擬南芥的4個(gè)亞類中。

圖4 14個(gè)花生MAPK基因的基序分析

單位為FPKM。

利用花生耐鹽突變體(S2)和對(duì)照(S4)構(gòu)建了鹽脅迫處理前后各時(shí)間段的表達(dá)譜，進(jìn)行基因鹽脅迫表達(dá)分析，結(jié)果表明14個(gè)MAPK基因中6個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，這6個(gè)基因涉及A和D 2個(gè)亞類，D亞類中受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的成員最多(5個(gè))，同一亞家族內(nèi)的基因表達(dá)模式并不完全相同；而B和C亞類中的6個(gè)成員均不受鹽脅迫誘導(dǎo)。本試驗(yàn)為今后花生中MAPK基因的研究與利用提供了理論依據(jù)。

[1] 范衡宇， 佟 超， 孫青原.絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的研究進(jìn)展[J].動(dòng)物學(xué)雜志，2002，37(5)：98-102.

[2] 張振才， 梁 燕， 李 翠.植物MAPK級(jí)聯(lián)途徑及其功能研究進(jìn)展[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，42(4)：207-214.

[3] Tsuyoshi M，Kazuya I，Riichiro Y，et al.MAP kinase cascades inArabidopsis：their roles in stress and hormone responses[J].Springer Berlin Heidelberg，2000,27(1)：29-38．

[4] Kannan P，Pandey D，Gupta A，et al.Expression analysis of MAP2K9 and MAPK6 during pathogenesis ofAlternariablight inArabidopsisthalianaecotype Columbia[J].Molecular Biology Reports，2012，39(4)：4439-4444.

[5] Asai T，Tena G，Plotnikova J，et al.MAP kinase signalling cascade inArabidopsisinnate immunity[J].Nature，2002，415(6875)：977-983.

[6] Wu L，Zu X，Zhang H，et al.Overexpression of ZmMAPK1 enhances drought and heat stress in transgenicArabidopsisthaliana[J].Plant Molecular Biology，2015，88(4/5)：429-443.

[7] 于 瑩， 陳宏宇， 程莉莉， 等.亞麻MAPK基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46(3)：21-28.

[8] Shi J，Zhang L，An H，et al.GhMPK16，a novel stress-responsive group D MAPK gene from cotton，is involved in disease resistance and drought sensitivity[J].BMC Molecular Biology，2011，12(12)：22.

[9] Zhang X，Cheng T，Wang G，et al.Cloning and evolutionary analysis of tobaccoMAPKgene family[J].Molecular Biology Reports，2013，40(2)：1407-1415.

[10] Song Q，Li D，Dai Y，et al.Characterization，expression patterns and functional analysis of theMAPKandMAPKKgenes in watermelon (Citrulluslanatus) [J].BMC Plant Biology，2015，15(15)：298.

[11] Wu J，Wang J，Pan C，et al.Genome-wide identification of MAPKK and MAPKKK gene families in tomato and transcriptional profiling analysis during development and stress response[J].PLoS One，2014，9(7)：e103032.

[12] Wang J，Pan C，Wang Y，et al.Genome-wide identification of MAPK，MAPKK，and MAPKKK gene families and transcriptional profiling analysis during development and stress response in cucumber[J].BMC Genomics，2015，16(12)：386.

[13] Teige M，Scheikl E，Eulgem T，et al.The MKK2 pathway mediates cold and salt stress signaling inArabidopsis[J].Molecular Cell，2004，15(1)：141-152.

[14] Rohila J S，Yang Y.Rice mitogen-activated protein kinase gene family and its role in biotic and abiotic stress response[J].Journal of Integrative Plant Biology，2007，49(6)：751-759.

[15] 陳婭斐， 馮 斌， 趙小明， 等.MAPK級(jí)聯(lián)途徑在植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22(3)：357-365.

[16] Mizoguchi T，Hayashida N，Yamaguchi-Shinozaki K，et al.ATMPKs：a gene family of plant MAP kinases inArabidopsisthaliana[J].FEBS Letters，1993，336(3)：440-444.

[17] Lieberherr D，Thao N，Nakashima A，et al.A sphingolipid elicitor-inducible mitogen-activated protein kinase is regulated by the small GTPase OsRac1 and heterotrimeric G-protein in rice 1[J].Plant Physiology，2005，138(3)：1644-1652.

[18] Lalle M，Visconti S，Marra M，et al.ZmMPK6，a novel maize MAP kinase that interacts with 14-3-3 proteins[J].Plant Molecular Biology，2005，59(5)：713-722.

[19] Wilson C，Anglmayer R，Vicente O，et al.Molecular cloning，functional expression inEscherichiacoli，and characterization of multiple mitogen-activated-protein kinases from tobacco[J].European Journal of Biochemistry，1995，233(1)：249-257.

[20] Kong F，Wang J，Cheng L，et al.Genome-wide analysis of the mitogen-activated protein kinase gene family inSolanumlycopersicum[J].Gene，2012，499(1)：108-120.

Screening and Salinity Stress Analysis ofMAPKGenes in Peanut

KONG Xiangyuan，CHEN Guanxu，QIN Guilong，SUI Jiongming，QIAO Lixian，WANG Jingshan，XU Lili

(College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong，Qingdao 266109，China)

Mitogen activated protein kinase (MAPK) plays an important role in plant growth and development，and stress resistance in plant.In order to improve our understanding of theMAPKgenes in peanut，RNA-seq was used to analyze one transcriptomic library constructed using a mutant with higher salinity resistance (S2) and its control (S4) in this study，14MAPKgenes were screened and located on six chromosomes of A genome from wild species.Clustering analysis showed that 13 out of 14MAPKgenes were assorted to four subgroups reported previously.Digital gene expression profiles were constructed using S2 and S4 samples before and after salinity treatment，according to the adjustedPvalue，sixMAPKgenes were found to be responsive to salinity treatment in S2 and (or) S4，which belonged to A (1)and D (5) subgroups，respectively.This study can provide the basis for functional identification and application ofMAPKgenes in peanut.

Peanut；MAPKgene；Salinity stress；RNA-seq

2017-03-25

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(31571705；31301356；31471542)；山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GNC110002)

孔祥遠(yuǎn)(1989-)，男，山東菏澤人，在讀碩士，主要從事作物分子育種研究。

徐麗麗(1979-)，女，山東諸城人，講師，碩士，主要從事基因工程研究。

Q78；S565.03

A

1000-7091(2017)03-0027-06

10.7668/hbnxb.2017.03.005