CRISPR系統(tǒng)在染色體標(biāo)記方面的應(yīng)用

張淑賢

摘 要 在細(xì)胞分化和發(fā)育過程中，細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)也在不斷的改變。哺乳動(dòng)物基因組在細(xì)胞核內(nèi)的裝配不是隨機(jī)的，且被認(rèn)為與基因的調(diào)控有關(guān)，而且細(xì)胞核裝配缺陷還會(huì)造成一些人類疾病的產(chǎn)生。但是基因定位與基因表達(dá)簡單因果關(guān)系至今尚不明確，主要因?yàn)榛蛭恢脛?dòng)態(tài)變化的分析依舊受限。隨著CRISPR系統(tǒng)的出現(xiàn)，其在標(biāo)記方面的應(yīng)用價(jià)值逐漸顯露出來。在CRISPR系統(tǒng)中，將Cas9蛋白替換為不具有切割能力的dCas9蛋白，將熒光蛋白與dCas9結(jié)合或與sgRNA的支架結(jié)構(gòu)相結(jié)合，CRISPR系統(tǒng)便可用于染色體的標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 CRISPR 染色體標(biāo)記 Casilio系統(tǒng) F+E修飾 多色標(biāo)記

中圖分類號：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

CRISPR-dCas9系統(tǒng)中，dCas9可以與熒光蛋白融合表達(dá)，sgRNA結(jié)合到特定基因位點(diǎn)后，熒光蛋白也被牽引到該處從而顯示基因的位置。除此之外，sgRNA后連有一段支架序列，用于dCas9蛋白的附著，若對支架進(jìn)行修飾也可以提供其他的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，用于招募熒光蛋白。sgRNA與蛋白質(zhì)相比對基因組DNA的親和力更強(qiáng)，因此CRISPR可以作為一種簡單且效率高的手段，應(yīng)用于活細(xì)胞中各種基因組位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)標(biāo)記觀察中。傳統(tǒng)的CRISPR系統(tǒng)存在sgRNA表達(dá)水平較低，且與Cas9結(jié)合效率不高的問題，嚴(yán)重限制的了CRISPR標(biāo)記系統(tǒng)功能的發(fā)揮。為了改進(jìn)這一缺點(diǎn)，多種修飾過的CRISPR標(biāo)記系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

1 Casilio系統(tǒng)

2016年，Haoyi Wang等學(xué)者提出了Casilio系統(tǒng)，該系統(tǒng)是將CRISPR-dCas9與Pumilio/fem–3-binding factor （PUF）相結(jié)合，即對sgRNA的支架結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，將其改造成PUF蛋白的結(jié)合區(qū)域（PUF binding site， PBS），再由PUF蛋白實(shí)現(xiàn)對其他效應(yīng)因子的招募 。效應(yīng)因子包括轉(zhuǎn)錄激活因子，熒光蛋白等，因此該系統(tǒng)不僅可用于染色體標(biāo)記，還可用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控。PUF作為一種8序列重復(fù)蛋白由36個(gè)氨基酸組成，可以識別一段8nt的RNA序列。這種能與RNA結(jié)合的結(jié)構(gòu)域相當(dāng)保守，PUF的識別原則如下：半磅氨酸和谷氨酰胺結(jié)合腺嘌呤，天冬氨酸和谷氨酰胺結(jié)合尿嘧啶，絲氨酸和谷氨酰胺結(jié)合鳥嘌呤，精氨酸和絲氨酸結(jié)合胞嘧啶 。利用這種簡單的配對原則，一種特殊8nt長的RNA序列（PUF binding site， PBS）被設(shè)計(jì)為sgRNA支架作為PUF的識別位點(diǎn)。PUF結(jié)構(gòu)域與其他效應(yīng)因子或蛋白標(biāo)簽融合，如綠色熒光蛋白，可用于染色體標(biāo)記。

2 F +E CRISPR-dCas9系統(tǒng)

2014年Baohui Chen等學(xué)者在將CRISPR系統(tǒng)應(yīng)用于染色體標(biāo)記時(shí)發(fā)現(xiàn)，單純的將Cas9蛋白替換成dCas9蛋白時(shí)，用于標(biāo)記癌細(xì)胞的端粒時(shí)，每個(gè)細(xì)胞中只能看到10-40個(gè)亮點(diǎn)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于細(xì)胞的端粒數(shù)。鑒于傳統(tǒng)的sgRNA結(jié)構(gòu)存在穩(wěn)定性差的原因，研究者對sgRNA的支架進(jìn)行了修飾，sgRNA Pol-III莖環(huán)結(jié)構(gòu)中連續(xù)的4個(gè)尿嘧啶堿基可能形成終止子， 造成U6 Pol-III轉(zhuǎn)錄過早的被終止，影響sgRNA結(jié)構(gòu)的形成，因此利用堿基互補(bǔ)配對的方法，將第四個(gè)尿嘧啶堿基替換成腺嘌呤，得到sgRNA F，為了提高sgRNA與dCas9結(jié)合的穩(wěn)定性，新增5對互補(bǔ)堿基對延長了sgRNA支架上發(fā)卡結(jié)構(gòu)，得到sgRNA E。改變后結(jié)合在一起構(gòu)成F+E CRISPR-dCas9系統(tǒng)，F(xiàn)+E的改變使sgRNA更加穩(wěn)定的同時(shí)增強(qiáng)了其對Cas9蛋白的聚集作用。dCas9蛋白與熒光蛋白融合后便可應(yīng)用于染色體標(biāo)記 。

3多色標(biāo)記系統(tǒng)

CRISPR-dCas9除了能應(yīng)用于單色標(biāo)記之外，還能應(yīng)用于多色標(biāo)記。為了實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記，2015年Hanhui Ma等學(xué)者使用了三種不同來源的Cas9蛋白，即來自S. pyogenes的sp Cas9，來自 Neisseria meningitidis的Nm Cas9和來自Streptococcus thermophilus 的St1 Cas9，并將三者同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞中對基因進(jìn)行標(biāo)記 。這三種蛋白各自擁有自身與sgRNA的結(jié)合位點(diǎn)，互不沖突。這種CRISPR標(biāo)記系統(tǒng)是將三種Cas9蛋白通過氨基酸突變的方式轉(zhuǎn)變成dCas9蛋白，然后分別融合不同顏色的熒光蛋白，即綠色熒光（GFP），藍(lán)色熒光（BFP）和紅色熒光（RFP），然后在其序列前添加相同或不同的sgRNA序列，構(gòu)建成一個(gè)完整的系統(tǒng)。三種融合不同熒光的Cas9蛋白在同一質(zhì)粒中表達(dá)，若sgRNA相同，則同一位點(diǎn)就能被三種顏色所顯示，若三種dCas9蛋白分別對應(yīng)不同的sgRNA，則不同的位點(diǎn)顯示不同的顏色，從而達(dá)到多色標(biāo)記的效果。除上述使用不同的Cas9蛋白進(jìn)行三色標(biāo)記系統(tǒng)外，還有一種CRISPR系統(tǒng)僅憑一種spCas9便可實(shí)現(xiàn)雙色標(biāo)記。2016年，Siyuan Wang等學(xué)者采用對sgRNA進(jìn)行修飾的方法，即在sgRNA支架上分別添加供MS2外殼蛋白（MCP）結(jié)合的MS2寡核苷酸適配子和與PP7外殼蛋白（PCP） 結(jié)合的PP7寡核苷酸適配子，兩種蛋白分別融合表達(dá)不同的熒光，使得該系統(tǒng)在只使用一種spCas9的前提下同時(shí)表達(dá)兩種熒光 。這種策略曾用于在同一細(xì)胞中招募不同功能的分子化合物以區(qū)分不同的基因組位置。若將兩種sgRNA支架的修飾方法融合應(yīng)用于同一sgRNA中或兩種支架使用同種sgRNA時(shí)，則同一位點(diǎn)就能被兩種顏色所顯示，若兩者支架不在同一系統(tǒng)中，且分別對應(yīng)不同的sgRNA，則不同的位點(diǎn)顯示不同的顏色。

參考文獻(xiàn)

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