高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蝦中萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素殘留量

薛婷婷，黃冬梅，嚴(yán)敏鳴，韓 峰,王 政，史永富,田良良

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程，上海 201306； 2.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，上海 201202)

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高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定蝦中萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素殘留量

薛婷婷1,2，黃冬梅1*，嚴(yán)敏鳴3，韓 峰1,王 政3，史永富1,田良良1

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程，上海 201306； 2.上海市浦東新區(qū)農(nóng)產(chǎn)品檢測(cè)中心，上海 201202)

建立了蝦中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)方法。樣品經(jīng)0.1%甲酸-乙腈(9∶1，體積比)混合溶液提取，乙腈飽和的正己烷除脂，PCX結(jié)合Florisil固相萃取柱進(jìn)行凈化后，以乙腈和0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相，經(jīng)CAPCELL PAK MG-C18色譜柱分離后，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜在多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行測(cè)定，以雙去氯萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo)物，內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明：萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素在2～250 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。在5，25，50 μg/kg加標(biāo)水平下，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的平均回收率為87.2%～102%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.3%～8.7%。方法的檢出限(LOD)為2.0 μg/kg，定量下限(LOQ)為5.0 μg/kg。該方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，適用于蝦類(lèi)中萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素殘留量的測(cè)定。

萬(wàn)古霉素；去甲萬(wàn)古霉素；雙去氯萬(wàn)古霉素；蝦；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)

萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素是由東方鏈霉菌代謝產(chǎn)生的糖肽類(lèi)抗生素[1]。這種藥物通過(guò)抑制細(xì)胞壁中磷脂和多肽的生成,進(jìn)而干擾細(xì)胞壁的合成[2],對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌與桿菌具有強(qiáng)大抗菌作用[3]。此外，萬(wàn)古霉素因其特殊的分子結(jié)構(gòu)，可有效治療一些耐藥菌株，如超級(jí)病菌NDM-1等[4]。因此萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素作為抗生素被不法經(jīng)營(yíng)者用于養(yǎng)殖業(yè)的情況日漸增多[5]。該類(lèi)藥物可通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，導(dǎo)致人類(lèi)聽(tīng)力減退甚至缺失，腎小管受損，甚至造成腎衰竭[6]。一些國(guó)家制定了相關(guān)食品中的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)[7]，日本規(guī)定牛奶中萬(wàn)古霉素的限量值為10 μg/kg[8]。而我國(guó)農(nóng)業(yè)部第560號(hào)公告中規(guī)定萬(wàn)古霉素為禁用獸藥[9]，未提出萬(wàn)古霉素在食品中的最大殘留限量MRL值。衛(wèi)生部將萬(wàn)古霉素列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第1-5批匯總)》，并注明需研制針對(duì)動(dòng)物性食品中該藥物的檢測(cè)方法[10]。目前雖有豬肉[5]和乳制品[6]中萬(wàn)古霉素殘留量的相關(guān)檢測(cè)文獻(xiàn)，但水產(chǎn)品領(lǐng)域中的相關(guān)研究尚屬空白。我國(guó)是蝦類(lèi)主要養(yǎng)殖大國(guó)，蝦產(chǎn)品出口貿(mào)易呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，因此，建立一種適用于蝦類(lèi)中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素殘留量的檢測(cè)方法具有重要的意義。

國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道的萬(wàn)古霉素等糖肽抗生素含量的主要檢測(cè)方法有免疫法[11-16]、高效液相色譜法(HPLC)[17-20]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[21-24]。對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜的樣品，免疫法因?qū)傩暂^差，所以較少采用。相對(duì)HPLC法，HPLC-MS/MS具有靈敏度高、定性更準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)。而選用內(nèi)標(biāo)法定量，可有效降低實(shí)際操作中條件波動(dòng)對(duì)分析結(jié)果的影響。本文選擇雙去氯萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo)物，利用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀測(cè)定蝦類(lèi)中萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素，該方法具有較好的檢測(cè)準(zhǔn)確性和靈敏度，可滿足殘留檢測(cè)的要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000高效液相色譜-串聯(lián)TSQ ENDURA三重四極桿質(zhì)譜(美國(guó)Thermo Fisher公司)；Genius 3旋渦混合器(德國(guó)IKA公司)；5510超聲波清洗儀(美國(guó)Branson公司)；Multifuge X 3R高速離心機(jī)(Thermo公司)；BCD-215DC冰箱(中國(guó)Haier公司)；N-EVAPTM111型氮吹儀(美國(guó)Organomation Aossociates公司)；VisiprepTMDL固相萃取裝置(美國(guó)Supelco公司)；PCX固相萃取柱(200 mg/6 mL，Aglient公司)；Florisil固相萃取柱(500 mg/6 mL，Agela公司)。

萬(wàn)古霉素(純度94.1%，Dr.Ehrenstorfer GmbH)；去甲萬(wàn)古霉素(純度83.4%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；雙去氯萬(wàn)古霉素(純度75%，Toronto Research Chemicals)；甲醇、乙腈(HPLC級(jí)，J,T.Baker)；甲酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；正己烷(HPLC級(jí)，J.T.Baker);0.1%甲酸溶液-乙腈混合溶液(7∶3，體積比)；5%氨化甲醇。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱(chēng)取萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和雙去氯萬(wàn)古霉素，用0.1%甲酸溶解，配制成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)液；再分別用0.1%甲酸稀釋成1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)液。根據(jù)需要，用0.1%甲酸溶液逐級(jí)稀釋成2，5，10，25，50，100,250 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)液濃度為50 ng/mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。以上標(biāo)準(zhǔn)溶液于4 ℃冰箱避光冷藏。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提 取 準(zhǔn)確稱(chēng)取蝦樣品2 g(精確至0.01 g)于50 mL聚丙烯離心管中，加入100 μL 1 μg/mL的雙去氯萬(wàn)古霉素內(nèi)標(biāo)液，用9 mL 0.1%的甲酸-乙腈混合溶液提取，渦旋混合1 min，超聲10 min，8 000 r/min離心6 min，取上清液至另一50 mL離心管中。殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并上清液,用提取液定容至20 mL，取10 mL待凈化。

1.3.2 凈 化 在上述溶液中加入5 mL乙腈飽和的正己烷，充分振蕩混勻，4 000 r/min離心10 min，去除上層正己烷層，重復(fù)去脂1次，下層溶液備用過(guò)柱。PCX固相萃取柱依次用5 mL乙腈和5 mL 0.1%甲酸溶液活化，F(xiàn)lorisil固相萃取柱依次用5 mL甲醇和5 mL 5%氨化甲醇活化。取溶液以每秒1滴的速度過(guò)PCX柱，10 mL蒸餾水淋洗，抽干柱子，5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液過(guò)Florisil柱，收集過(guò)柱液，3 mL 5%氨化甲醇淋洗，收集全部淋洗液，于45 ℃氮?dú)獯抵两?。? mL 0.1%甲酸復(fù)溶，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后，供 LC-MS/MS分析。

1.4 色譜條件

色譜柱：CAPCELL PAK MG-C18(100 mm×2.0 mm,5 μm)；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：25 μL；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸，B為乙腈。洗脫梯度：0～0.5 min，95% A；0.5～2.5 min，95%～75% A；2.5～5.0 min，75% A；5.0～6.1 min,75%～95% A；6.1～8.1 min，95% A。

表1 萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素及雙去氯萬(wàn)古霉素的質(zhì)譜參數(shù)

*quantitative ion

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)；掃描方式：正離子模式；噴霧電壓：3 000 V；鞘氣流量：35 mL/min；輔助氣流量：10 mL/min；離子傳輸毛細(xì)管溫度：350 ℃。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素和雙去氯萬(wàn)古霉素均為多肽類(lèi)抗生素，在一級(jí)質(zhì)譜中，易與H+結(jié)合，產(chǎn)生帶正電的雙電荷離子[M+H]2+，經(jīng)過(guò)二級(jí)碰撞后，產(chǎn)生不同強(qiáng)度的碎片離子，以豐度最大的m/z144.0，144.0，100.1分別作為3種化合物的定量離子。確定特征碎片離子后，對(duì)碰撞能量等其他質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)“1.5”及表1。

2.2 色譜條件的選擇

因甲酸可為化合物提供必需的質(zhì)子來(lái)源，提高其離子化效率[5]，故在萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素殘留分析中使用的流動(dòng)相多為0.1%甲酸-乙腈體系。經(jīng)查閱，萬(wàn)古霉素在C18柱上有較好的保留效果[1]，本文比較了AgilentEC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)，AgilentGlycan-C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)和Capcell PAK MG-C18(2.0 mm×100 mm，5 μm) 3種不同C18色譜柱的效果，結(jié)果顯示Capcell PAK MG-C18色譜柱對(duì)萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的保留效果最好。在此條件下萬(wàn)古霉素、去甲萬(wàn)古霉素及雙去氯萬(wàn)古霉素的響應(yīng)值高，且峰形尖銳、對(duì)稱(chēng)。

圖1 4種不同提取溶液對(duì)萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的提取效果比較Fig.1 Comparison recoveries of vancomycin and norvancomycin by four different kinds of extract solutions

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取試劑的選擇 根據(jù)萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素易溶于水，微溶于乙腈的性質(zhì)，本文比較了0.1%甲酸、10%三氯乙酸、6%高氯酸以及純乙腈4種試劑作為提取溶液時(shí)對(duì)加標(biāo)回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。純乙腈的提取回收率最低，三氯乙酸和高氯酸的提取回收率僅為40%～60%，而0.1%甲酸的提取回收率最高，但會(huì)有水溶性蛋白溶出，造成雜質(zhì)較多，提取液較為渾濁，不利于下步凈化。因此本文在0.1%甲酸中加入一定比例的乙腈，采用0.1%甲酸-乙腈(7∶3，體積比)提取，該條件下提取回收率高，同時(shí)能沉淀部分蛋白和雜質(zhì)，利于下步凈化。

圖2 羅氏沼蝦加標(biāo)樣品圖(25 μg/kg)Fig.2 Spiked samples of Giant freshwater prawn(25 μg/kg)

2.3.2 凈化及固相萃取小柱的優(yōu)化 首先采用正己烷(乙腈飽和)去除提取液中的部分脂類(lèi)雜質(zhì)，而后采用固相萃取小柱進(jìn)一步凈化處理。萬(wàn)古霉素等目標(biāo)物分子結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)堿性的伯氨基團(tuán)，帶有弱堿性，而蝦類(lèi)樣品中富含色素等雜質(zhì)，因此本實(shí)驗(yàn)采用以水浸潤(rùn)型聚合物為基質(zhì)的陽(yáng)離子交換柱PCX柱和硅膠鍵合氧化鎂吸附劑的Florisil固相萃取柱聯(lián)合去雜，結(jié)果表明此方法能夠有效去除雜質(zhì)，具有良好的凈化效果，且兩種化合物的回收率均在80%～110%之間，能滿足檢測(cè)要求。 陰性羅氏沼蝦樣品中添加25 μg/kg目標(biāo)物的加標(biāo)譜圖見(jiàn)圖2。

2.4 內(nèi)標(biāo)物的選擇

目前已報(bào)道[25]用于萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素殘留的內(nèi)標(biāo)物有甲硝唑和維生素B12，但其在實(shí)際樣品前處理過(guò)程中損失較大，不能滿足本實(shí)驗(yàn)作為內(nèi)標(biāo)物的要求。作者通過(guò)萬(wàn)古霉素相關(guān)性質(zhì)資料查詢(xún)[26]，發(fā)現(xiàn)雙去氯萬(wàn)古霉素的結(jié)構(gòu)和基本性質(zhì)與萬(wàn)古霉素相似，滿足內(nèi)標(biāo)物的要求。因此，本文采用雙去氯萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo)物，使用該內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行復(fù)雜基質(zhì)樣品中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

2.5 線性范圍、檢出限與定量下限

將濃度分別為2，5，10，25，50，100，250 ng/mL的待測(cè)物系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液上機(jī)測(cè)定，以目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(x,ng/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素在2～250 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，其線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。在蝦空白樣品中添加2種目標(biāo)化合物，按樣品前處理步驟和儀器條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)信號(hào)響應(yīng)值，以3倍信噪比確定方法檢出限(LOD，S/N≥3)，10倍信噪比確定定量下限(LOQ，S/N≥10)，測(cè)得萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的檢出限均為2.0 μg/kg，定量下限均為5.0 μg/kg。本方法具有較高的靈敏度。

表2 萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限

2.6 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

選擇不含待測(cè)目標(biāo)物的羅氏沼蝦空白基質(zhì)樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加5，25，50 μg/kg 3個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)加標(biāo)濃度做6個(gè)平行樣，分別計(jì)算萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素的回收率，測(cè)得萬(wàn)古霉素的平均添加回收率為91.8%～102%，去甲萬(wàn)古霉素為87.2%～98.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.3%～8.7%(見(jiàn)表3)。綦艷等[24]采用LC-MS/MS 檢測(cè)乳制品中的萬(wàn)古霉素殘留量，在15,60，150 μg/kg加標(biāo)水平下的回收率約80%。數(shù)據(jù)表明，本文建立的方法準(zhǔn)確度較高，具有較好的精密度。

表3 羅氏沼蝦空白樣品中添加2種目標(biāo)物的平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.7 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從上海農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)南美白對(duì)蝦、基圍蝦、青蝦、河蝦等多種蝦類(lèi)樣品，在優(yōu)化條件下進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)做質(zhì)控樣品。結(jié)果在上述樣品中均未檢出萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素，質(zhì)控樣品中兩種化合物的回收率為81.4%～106%，精密度小于10%，達(dá)到殘留分析要求，數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。同時(shí)由3家經(jīng)過(guò)認(rèn)證的實(shí)驗(yàn)室對(duì)本方法做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明本方法滿足殘留檢測(cè)的各項(xiàng)指標(biāo)。

3 結(jié) 論

本文建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)蝦類(lèi)樣品中萬(wàn)古霉素和去甲萬(wàn)古霉素殘留的分析方法，該方法首次使用雙去氯萬(wàn)古霉素作為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量分析。優(yōu)化了樣品前處理、色譜及質(zhì)譜條件，有效提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。該方法回收率高，定量下限和精密度滿足殘留檢測(cè)的要求，適用于蝦類(lèi)中萬(wàn)古霉素及去甲萬(wàn)古霉素殘留量的同時(shí)檢測(cè)。

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Determination of Vancomycin and Norvancomycin Residues in Shrimps by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

XUE Ting-ting1,2,HUANG Dong-mei1*,YAN Min-ming3,HAN Feng1,WANG Zheng3,SHI Yong-fu1,TIAN Liang-liang1

(1.East China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Shanghai 200090,China;2.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China;3.Testing Center of Agricultural Products,Pudong New Area,Shanghai 201202,China)

A new method for the determination of vancomycin and norvancomycin residues in shrimps by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS) was established.Samples were extracted with 0.1% formic acid-acetonitrile solution,defatted withn-hexane saturated with acetonitrile and purified with PCX and Florisil solid phase extraction column.The separation of two targets was carried out on a CAPCELL PAK MG-C18column by gradient elution with 0.1% formic acid-acetonitrile as mobile phase．The identification of two analytes was performed in multi-reaction monitoring(MRM),and the quantification was carried out by the internal standard method.Dedichloro vancomycin was used as an internal standard.The calibration curves showed good linearities in the range of 2-250 ng/mL with correlation coefficients(r2) greater than 0.99.The detection limits(LOD) of this method were both 2.0 μg/kg,and the limits of quantitation(LOQ) were 5.0 μg/kg.The recoveries of the target compounds at spiked levels of 5,25,50 μg/kg were in the range of 87.2%-102%,with relative standard deviations(RSDs) of 1.3%-8.7%.The results indicated that this method had high sensitivity,accuracy and good reproducibility.It was suitable for the simultaneous determination of ancomycin and norvancomycin residues in shrimps.

vancomycin;norvancomycin;dedichloro vancomycin;shrimps;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS)

2017-01-17；

2017-03-06

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)制定和修定農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全項(xiàng)目(2130109)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.012

O657.63;O629.5

A

1004-4957(2017)06-0773-05

*通訊作者：黃冬梅，研究員，研究方向：食品質(zhì)量安全，Tel：021-65680121，E-mail:hdm2001@126.com