microRNA-30 抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制

趙 越 張明超 朱小東 徐孝東 楊 帆 郎 月 施少林 劉志紅

microRNA-30 抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制

趙 越 張明超 朱小東 徐孝東 楊 帆 郎 月 施少林 劉志紅

目的：探討microRNA-30(miR-30)緩解血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)所致足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。 方法：(1)通過皮下埋置滲透壓泵，給予小鼠AngⅡ[1 000 ng/(kg·min) ×28d]構(gòu)建腎損傷模型。利用原位雜交及qRT-PCR技術(shù)檢測小鼠腎小球中miR-30s的表達(dá)，運(yùn)用免疫組化及蛋白印跡檢測calcineurin信號重要分子細(xì)胞瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6(TRPC6)，鈣調(diào)磷酸酶(PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1)及活化T細(xì)胞核因子( NFATC3)表達(dá)。(2)給予miR-30s慢病毒尾靜脈注射，觀察其對AngⅡ誘導(dǎo)損傷模型的腎臟保護(hù)作用。(3)體外研究觀察miR-30a高表達(dá)能否抑制AngⅡ (10-6mol/L) 誘導(dǎo)的足細(xì)胞骨架損傷和足細(xì)胞凋亡。 結(jié)果：(1)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠腎小球中miR-30s水平下調(diào)，并上調(diào)TRPC6，激活calcium/calcineurin信號通路；(2)高表達(dá)的miR-30s能夠抑制AngⅡ?qū)е碌腸alcium/calcineurin信號活化從而緩解AngⅡ誘導(dǎo)的腎小球損傷；(3)miR-30s能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ所致足細(xì)胞骨架損傷及抑制其凋亡過程。 結(jié)論：miR-30s具有抑制AngⅡ誘導(dǎo)的足細(xì)胞損害作用，其機(jī)制可能與抑制calcium/calcineurin信號通路有關(guān)。

microRNA-30 血管緊張素Ⅱ calcium/calcineurin信號 足細(xì)胞

足細(xì)胞是一種終末分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞，附著于腎小球基膜(GBM)表面，在維持腎小球?yàn)V過屏障完整性中起重要作用。足細(xì)胞損傷是導(dǎo)致蛋白尿、腎小球硬化及腎功能進(jìn)行性惡化的重要病理基礎(chǔ)[1]。因此，探討足細(xì)胞損傷的分子機(jī)制將有助于尋找腎小球疾病的治療靶點(diǎn)。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)的異常激活在多種原發(fā)和繼發(fā)性腎臟疾病如局灶節(jié)段硬化性腎小球腎炎(FSGS)、糖尿病腎病及高血壓導(dǎo)致的腎損傷的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[2]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)是RAS中的重要活性成分，可通過AngⅡ 1型受體(AT1R)調(diào)控腎臟疾病進(jìn)展。有研究表明，足細(xì)胞過表達(dá)AT1R的轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)足細(xì)胞損傷及凋亡的增加及腎小球的局灶節(jié)段硬化[3]。Ding等[4]證實(shí)AngⅡ可誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞骨架損傷，并有文獻(xiàn)證實(shí)calcium/calcineurin信號通路的異常激活是AngⅡ所致足細(xì)胞凋亡及腎臟損傷的重要機(jī)制之一[5]。然而，AngⅡ通過何種機(jī)制激活calcium/calcineurin信號通路目前尚不明確。

微小核糖核酸(microRNA，簡稱miR)是一類長度約為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，可抑制靶基因轉(zhuǎn)錄或促進(jìn)目標(biāo)mRNA降解，從而負(fù)性調(diào)節(jié)基因表達(dá)[6]。本課題組之前的研究證實(shí)miR-30家族(包括miR-30a、b、c、d、e五個(gè)成員)在腎小球內(nèi)特異性表達(dá)于足細(xì)胞。給予體外培養(yǎng)的足細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)和嘌呤霉素核苷酸(PAN)等損傷因素刺激，可下調(diào)miR-30s家族成員表達(dá)水平[7]。疾病情況下調(diào)的miR-30s可直接作用于其靶基因TRPC6，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1和NFATC3，激活calcium/calcineurin信號通路，從而影響足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及腎小球功能?；赾alcium/calcineurin信號通路的異常激活可能是AngⅡ所致足細(xì)胞凋亡及腎臟損傷的重要分子機(jī)制，我們推測腎臟疾病情況下，AngⅡ很可能通過下調(diào)miR-30s，異常激活calcium/calcineurin通路，繼而引發(fā)足細(xì)胞及腎小球損傷。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過體內(nèi)研究完整闡釋miR-30s在RAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)腎臟生理病理過程中的重要作用，為更深入地了解腎小球疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找新的足細(xì)胞損傷干預(yù)靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性C57BL/6J小鼠，體重20～25g，清潔級(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院試驗(yàn)動(dòng)物中心提供)共36只。

主要試劑 永生化的人足細(xì)胞株(HPC)由英國Bristol大學(xué)Moin. A. Saleem教授惠贈(zèng)；RPMl l640培養(yǎng)基含10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100 U/mL (美國Gibco)及1% insulin-transferrin-Selenium(Invitrogen公司)。其他試劑包括：Ang II (Sigma)；TRPC6、PPP3CB和PPP3R1抗體(Abcam)，PPP3CA抗體 (EMD Millipore)，NFATC3抗體 (Santa Cruz，CA)；RNA提取試劑盒(Ambion)，TaqMan miRNA assay kit (ABI公司)；Alexa Fluor@647 Annexin V和Propidium Iodide Solution (Biouniquer)；羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(cytosleleton)； microRNA原位雜交試劑盒(Exiqon)。采用Albuwell M 及 Creatinine companion kits (Exocell Laboratories)測定小鼠尿蛋白及尿肌酐。

實(shí)驗(yàn)方法

足細(xì)胞培養(yǎng)及處理 足細(xì)胞在33℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行增殖，待細(xì)胞融合70%后轉(zhuǎn)入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中分化10～14 d后，給予10-6mol/L AngⅡ刺激24 h，進(jìn)行F-actin鬼筆環(huán)肽染色檢測足細(xì)胞骨架損傷，Annexin V染色后結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

AngⅡ腎損傷模型構(gòu)建 由于AngⅡ異常激活是慢性損傷的重要誘發(fā)因素，本研究造模采用8周齡C57BL/6J小鼠，給予皮下埋入膠囊滲透壓泵(Alzet model 2004)，恒量慢性輸注AngⅡ[1 000 ng/(kg·min)]28d，以等量生理鹽水作為對照。在AngⅡ輸注后第14天，給予miR-30a慢病毒注射100 μl(濃度：1×108PFU/μl，漢恒生物)。28d后采用磁珠灌注法獲取小鼠腎小球進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。

磁珠分選獲取腎小球 小鼠麻醉后，給予含磁珠(Invitrogen，life technology)的PBS腎臟灌注，腎組織被切碎，消化30 min后過篩，用磁力架收集腎小球進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

原位雜交實(shí)驗(yàn) 按照EXIQON-miRCURY LNATMmicroRNA ISH Optimization Kit (FFPE) 以及Roche- DIG Wash and Block Buffer Set試劑盒說明 進(jìn)行小鼠腎臟組織原位雜交試驗(yàn)，檢測miR-30a和miR-30d的表達(dá)及分布。

qRT-PCR檢測 磁珠分選獲取小鼠腎小球后，采用Ambion試劑盒提取總RNA，再使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa)進(jìn)行cDNA合成后，采用TaqMan 探針法進(jìn)行qPCR，檢測 miR-30s的表達(dá)水平。

電鏡檢測 取小鼠腎組織，經(jīng)3.75%戊二醛固定，2%鋨酸固定，丙酮脫水、浸透，包埋、切片，染色，Hitachi 7500透射電鏡觀察。

Western Blot印跡 將組織用蛋白裂解液裂解后，加入上樣緩沖液后煮沸變性。蛋白樣品經(jīng)電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗二抗孵育后，用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL，Millipore)顯色，在凝膠圖像分析系統(tǒng)照相掃描蛋白條帶的吸光度并分析處理。

免疫組化染色 取石蠟包埋的腎組織切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟、梯度乙醇復(fù)水，經(jīng)微波修復(fù)10 min，10%小牛血清室溫封閉10 min，一抗4℃孵育過夜，加入二抗，室溫孵育30 min，進(jìn)行DAB顯色，封片后在顯微鏡下觀察。

足細(xì)胞骨架損傷檢測 接種于chamber slides(Nune)中的各組細(xì)胞，37℃ PBS洗三次，75%冰乙醇固定10 min后，洗去固定液，加入0.5% Triton X-100透膜5 min，洗滌，室溫避光條件下鬼筆環(huán)肽孵育30 min，PBS洗三次，甘油封片，共聚焦熒光顯微鏡下(LSM510，Carl Zeiss)觀察結(jié)果，掃描采集圖像。

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，按試劑盒(Biouniquer)方法，用Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，在細(xì)胞懸浮液中加入Alexa Fluor 647 AnnexinV和PI，輕輕混勻后室溫避光條件下孵育15 min，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀(型號FACS ARIA，BD公司)檢測細(xì)胞凋亡。

Tunel檢測細(xì)胞凋亡 按照Tunel試劑盒In Situ Cell Death Detection Kit,POD (Roche)方法，選用小鼠腎組織石蠟切片，脫蠟后用0.1% Triton X-100通透細(xì)胞膜，PBS洗片后加入TUNEL混合液避光孵育1h，PBS漂洗三次，封片，熒光顯微鏡下觀察，Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

AngⅡ誘導(dǎo)小鼠腎損傷后足細(xì)胞中miR-30s的表達(dá)變化 我們將小鼠隨機(jī)分為2組，分別給予AngⅡ和生理鹽水慢性輸注， 28d后采用磁珠灌注法獲取小鼠腎小球進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)： AngⅡ能夠下調(diào)miR-30家族成員水平(圖1A)。小鼠腎組織切片原位雜交實(shí)驗(yàn)(ISH)結(jié)果提示：AngⅡ慢性處理28d后，小鼠足細(xì)胞中miR-30a和miR-30d水平均明顯下調(diào)(圖1B)。

圖1 AngⅡ處理可下調(diào)小鼠腎小球足細(xì)胞miR-30s水平miR-30：microRNA-30;Sham：生理鹽水緩釋組；AngⅡ：AngⅡ緩釋組；Scram:AngⅡ小鼠給予Scramble慢病毒注射劑；A：qPCR分析顯示AngⅡ慢性處理對小鼠腎小球中miR-30s表達(dá)水平的影響；B：原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示AngⅡ慢性輸注對小鼠足細(xì)胞中miR-30a和miR-30d的影響；*:與生理鹽水緩釋組比較，P<0.05

高表達(dá)miR-30抑制AngⅡ所致小鼠腎臟損傷 給予AngⅡ慢性輸注第一周，小鼠即可出現(xiàn)蛋白尿，一直持續(xù)到第四周(圖2A)。在AngⅡ輸注28d后，取腎組織進(jìn)行PAS染色發(fā)現(xiàn)腎小球系膜擴(kuò)張(圖2B)，電鏡檢測提示AngⅡ可誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞足突融合(圖2C)，進(jìn)行Tunel實(shí)驗(yàn)檢測足細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示AngⅡ處理組小鼠足細(xì)胞凋亡較生理鹽水處理組明顯增加(圖2D)。在AngⅡ慢性輸注第14 天時(shí)，給予小鼠miR-30a慢病毒尾靜脈注射， 28 天后處死小鼠，取其腎組織標(biāo)本用作腎損傷評估，結(jié)果顯提示miR-30a能夠緩解AngⅡ所致的蛋白尿，腎小球系膜增生及足細(xì)胞損傷。

圖2 miR-30抑制AngⅡ所致小鼠腎臟損傷miR-30：microRNA-30；Scram：給予 Scramble 慢病毒注射；miR-30a：給予miR-30a慢病毒注射；Vehicle:生理鹽水緩釋組；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；A：AngⅡ造模小鼠蛋白尿明顯增加，miR-30a 治療后可緩解其蛋白尿水平；B：AngⅡ造模28d后，小鼠腎臟病理切片PAS 染色顯示腎小球系膜增生，而 miR-30a 治療組腎損傷明顯緩解；C:電鏡顯示AngⅡ造模小鼠出現(xiàn)足突融合， miR-30a 治療組未出現(xiàn)該變化；D:Tunel實(shí)驗(yàn)提示AngⅡ慢性處理可誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡，而 miR-30a 可阻滯該作用；*:與Scram組比較，P<0.05；#:與AngⅡ+Scram組比較，P<0.05

miR-30s抑制AngⅡ誘導(dǎo)calcium/calcineurin信號活化 我們之前的研究已證實(shí)：calcium-calcineurin信號通路中的五個(gè)關(guān)鍵基因TRPC6，PPP3CA，PPP3CB，PPP3R1和NFATC3均為miR-30s的靶基因，并且通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-30s能夠阻斷AngⅡ所致calcium/calcineurin信號通路活化[8]。本研究進(jìn)一步利用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討miR-30s對AngⅡ所致calcium/calcineurin信號活化的影響。采用AngⅡ慢性輸注28d的小鼠腎組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色及Western Blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：AngⅡ能夠上調(diào)TRPC6，PPP3CA，PPP3CB和PPP3R1，激活calcium/calcineurin通路，從而進(jìn)一步活化NFATc3，給予miR-30慢病毒注射上調(diào)miR-30s表達(dá)后，AngⅡ誘導(dǎo)的calcineurin信號激活可被部分逆轉(zhuǎn)(圖3)。以上結(jié)果提示,AngⅡ可下調(diào)miR-30水平，進(jìn)而激活calcineurin信號，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

圖3 miR-30s抑制AngⅡ誘導(dǎo)calcium-calcineurin信號活化miR-30s:microRNA-30s;TRPC6:細(xì)胞瞬時(shí)受體電位陽離子通道蛋白6；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1：鈣調(diào)磷酸酶亞基；NFATC3：活化T細(xì)胞核因子；A： miR-30s對AngⅡ所致TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1 及 NFATC 蛋白表達(dá)上調(diào)影響(Western Blot印跡)；B：免疫組化檢測上述蛋白在小鼠腎小球中的表達(dá)

miR-30s抑制AngⅡ所致體外培養(yǎng)的足細(xì)胞骨架損傷及凋亡 研究表明，AngⅡ能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞骨架損傷及凋亡[9]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)，AngⅡ能夠下調(diào)miR-30s水平，并且敲低miR-30能夠?qū)е伦慵?xì)胞骨架損傷和凋亡[7]。因此，我們推測miR-30s的下調(diào)參與了AngⅡ所致的足細(xì)胞損傷。為證明該假設(shè)，我們用10-6mol/L的AngⅡ處理體外培養(yǎng)的人永生化足細(xì)胞24h，進(jìn)行F-actin鬼筆環(huán)肽染色及Annexin V染色。結(jié)果顯示：AngⅡ刺激可導(dǎo)致足細(xì)胞F-actin壓力纖維的丟失和足細(xì)胞凋亡率增加，而高表達(dá)miR-30s則能夠部分逆轉(zhuǎn)AngⅡ?qū)е碌淖慵?xì)胞損傷(圖4)，提示miR-30s介導(dǎo)了AngⅡ?qū)е碌淖慵?xì)胞骨架損傷及凋亡過程。

圖4 miR-30a 可抑制 AngⅡ所誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷miR-30a：microRNA-30a;Scram：給予足細(xì)胞轉(zhuǎn)染Scramble質(zhì)粒；AngⅡ：血管緊張素Ⅱ；miR-30a：給予足細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-30a質(zhì)粒；Vehicle:空白對照組；A：熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽顯示轉(zhuǎn)染Scram及miR-30a的足細(xì)胞給予AngⅡ處理后骨架損傷情況；B：A 圖中骨架定量分析；C：通過流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染Scram及miR-30a的足細(xì)胞經(jīng)過 AngⅡ處理 24h后 Annexin V 陽性細(xì)胞比例，從而反映足細(xì)胞凋亡情況； D：C 圖中凋亡細(xì)胞定量；*:與Vehicle+Scram組比較，P<0.05；#:與AngⅡ+Scram組比較，P<0.05

討 論

RAS異?；罨谧慵?xì)胞損傷、蛋白尿產(chǎn)生及腎小球硬化過程中發(fā)揮重要作用。AngⅡ 是 RAS中的重要活性成分，給予小鼠體內(nèi)緩慢輸注 AngⅡ 構(gòu)建慢性腎損傷模型，可觀察到小鼠出現(xiàn)蛋白尿，腎小球和腎小管損傷以及間質(zhì)纖維化等病理改變。傳統(tǒng)觀點(diǎn)將 AngⅡ所致腎臟損傷機(jī)制歸因于血流動(dòng)力學(xué)作用，AngⅡ可增加腎小球毛細(xì)血管袢壓力和濾過屏障通透性，進(jìn)而誘發(fā)蛋白尿以及腎小管間質(zhì)損傷[10]。近年研究提示 AngⅡ?qū)δI臟細(xì)胞的直接生物學(xué)效應(yīng)可能更為關(guān)鍵，而足細(xì)胞是其作用的主要靶細(xì)胞。大量研究表明，鈣調(diào)磷酸酶(calcineurin)信號通路的異?；罨茿ngⅡ所致腎臟損傷及足細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一。AngⅡ 可通過上調(diào) TRPC6 通道蛋白表達(dá)水平，增加足細(xì)胞 Ca2+內(nèi)流，活化calcineurin并刺激NFAT去磷酸化，同時(shí)上調(diào)細(xì)胞因子表達(dá)，刺激細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生，激活多種胞內(nèi)信號途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷[11-12]。 然而，AngⅡ 通過何種機(jī)制活化 calcineurin信號通路目前尚不明確。

多個(gè)團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)，足細(xì)胞特異性 Dicer 酶敲除小鼠(該類小鼠足細(xì)胞成熟 miRNA 缺失)可出現(xiàn)顯著的蛋白尿及腎小球硬化[13-14]，提示miRNA 在維持足細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮不可或缺的作用。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)：miR-30 家族在腎小球內(nèi)特異性的表達(dá)于足細(xì)胞。且FSGS的患者及PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷大鼠模型中，均可觀察到miR-30家族成員的表達(dá)顯著下降，給予PAN大鼠尾靜脈 miR-30a 質(zhì)粒注射后，足細(xì)胞及腎小球損傷可被逆轉(zhuǎn)，并且蛋白尿水平明顯緩解。體外實(shí)驗(yàn)中，我們給予人足細(xì)胞多種損傷因素刺激，如 TGF-β、脂多糖(LPS)及PAN后，miR-30s 的表達(dá)明顯下調(diào)，而高表達(dá) miR-30a 的人足細(xì)胞系可抵抗刺激因素所致?lián)p傷[7]。以上結(jié)果提示 miR-30s具有特異性的足細(xì)胞保護(hù)作用，進(jìn)一步研究證實(shí)：miR-30s 的足細(xì)胞保護(hù)機(jī)制主要為靶向調(diào)控TRPC6、calcineurin(PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1)以及 NFATC3[8]。從阻斷鈣內(nèi)流，抑制 calcineurin 表達(dá)及 NFATC3 核轉(zhuǎn)移三個(gè)層次緊密調(diào)控足細(xì)胞 calcineurin 信號通路。之前的研究中，我們已經(jīng)通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AngⅡ處理可顯著下調(diào)足細(xì)胞miR-30s表達(dá)水平，上調(diào)calcium/calcineurin通路重要蛋白(TRPC6、PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1以及NFATc3)表達(dá)。該結(jié)果提示，miR-30s在AngⅡ所致calcium/calcineurin信號通路異常激活中發(fā)揮重要作用。由于AngⅡ可作為循環(huán)激素在體內(nèi)發(fā)揮重要調(diào)控作用，我們試圖通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)闡明miR-30s/calcineurin信號在RAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)腎臟生理病理過程中的重要作用。我們給予小鼠皮下埋置膠囊緩釋泵，利用AngⅡ慢性輸注構(gòu)建腎損傷模型，觀察miR-30/calcineurin信號在AngⅡ所致足細(xì)胞損傷中的作用。AngⅡ慢性輸注28d后即可觀察到小鼠出現(xiàn)蛋白尿，系膜增生，足細(xì)胞骨架損傷等表型，提示AngⅡ所致慢性腎損傷模型構(gòu)建成功。在此模型基礎(chǔ)上，我們觀察到TRPC6、calcineurin(PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1)及 NFATC3表達(dá)上調(diào)而miR-30s表達(dá)被阻滯，提示AngⅡ處理可活化足細(xì)胞內(nèi)calcineurin信號并下調(diào)miR-30家族表達(dá)。進(jìn)一步給予小鼠尾靜脈注射miR-30s慢病毒進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)miR-30s能夠顯著緩解AngⅡ慢性輸注所致蛋白尿及腎小球損傷表型。此外，miR-30s能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ所致TRPC6、calcineurin(PPP3CA、PPP3CB、PPP3R1)以及 NFATC3的表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果表明：miR-30s能夠逆轉(zhuǎn)AngⅡ處理所致calcium/calcineurin信號通路的異?；罨?/p>

小結(jié)：本研究證實(shí)了AngⅡ通過下調(diào)miR-30s，進(jìn)而活化calcium/calcineurin信號通路，最終導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。我們的研究結(jié)果表明miR-30s下調(diào)不僅解釋了AngⅡ活化calcium/calcineurin信號通路的分子機(jī)制，并且解讀了AngⅡ?qū)е伦慵?xì)胞損傷，包括足細(xì)胞骨架損傷和凋亡的原因。

1 Menon MC,Chuang PY,He CJ.The glomerular filtration barrier:components and crosstalk.Int J Nephrol,2012,2012:749010.

2 Kobori H,Nangaku M,Navar LG,et al.The intrarenal renin-angiotensin system:from physiology to the pathobiology of hypertension and kidney disease.Pharmacol Rev,2007,59(3):251-287.

3 Hoffmann S,Podlich D,H?hnel B,et al.Angiotensin II type 1 receptor overexpression in podocytes induces glomerulosclerosis in transgenic rats.J Am Soc Nephrol,2004,15(6):1475-1487.

4 Ding G,Reddy K,Kapasi AA,et al.Angiotensin II induces apoptosis in rat glomerular epithelial cells.Am J Physiol Renal Physiol,2002,283(1):F173-180.

5 Nijenhuis T,Sloan AJ,Hoenderop JG,et al.Angiotensin II contributes to podocyte injury by increasing TRPC6 expression via an NFAT-mediated positive feedback signaling pathway.Am J Pathol,2011,179(4):1719-1732.

6 Ambros V.The functions of animal microRNAs.Nature,2004,431(7006):350-355.

7 Wu J,Zheng C,Fan Y,et al.Downregulation of microRNA-30 facilitates podocyte injury and is prevented by glucocorticoids.J Am Soc Nephrol,2014,25(1):92-104.

8 Wu J,Zheng C,Wang X,et al.MicroRNA-30 family members regulate calcium/calcineurin signaling in podocytes.J Clin Invest,2015,125(11):4091-4106.

9 Jia J,Ding G,Zhu J,et al.Angiotensin II infusion induces nephrin expression changes and podocyte apoptosis.Am J Nephrol,2008,28(3):500-507.

10 Eckel J,Lavin PJ,Finch EA,et al.TRPC6 enhances angiotensin II-induced albuminuria.J Am Soc Nephrol,2011,22(3):526-535.

11 Wennmann DO,Hsu HH,Pavenst?dt H.The renin-angiotensin-aldosterone system in podocytes.Semin Nephrol,2012,32(4):377-384.

12 Sonneveld R,van der Vlag J,Baltissen MP,et al.Glucose specifically regulates TRPC6 expression in the podocyte in an AngⅡ-dependent manner.Am J Pathol,2014,184(6):1715-1726.

13 Shi S,Yu L,Chiu C,et al.Podocyte-selective deletion of dicer induces proteinuria and glomerulosclerosis.J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2159-2169.

14 Ho J,Ng KH,Rosen S,et al.Podocyte-specific loss of functional microRNAs leads to rapid glomerular and tubular injury.J Am Soc Nephrol,2008,19(11):2069-2075.

(本文編輯 青 松 加 則)

microRNA-30s reverse AngⅡ-induced podocyte injury

ZHAOYue,ZHANGMingchao,ZHUXiaodong,XUXiaodong,YANGFan,LANGYue,SHIShaolin,LIUZhihong

NationalClinicalReaearchCenterofKidneyDiseases，JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicine，Nanjing210016，China

LIUZhihong(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)；SHIShaolin(E-mail：shaolinshil001@yahoo.com)

Objective：To illuminate the protective role of microRNA-30s in AngⅡ-induced podocyte injury. Methodology：(1) Mice were infused with AngⅡ at a dose of 1 000 ng/kg/min for 28 days with the osmotic mini-pumps implanted subcutaneously. The expression of miR-30s in mice glomeruli was examined by qRT-PCR and in situ hybrization. The expressions of TRPC6, PPP3CA、 PPP3CB、 PPP3R1 and NFATC3 were tested by western blotting and immunohistochemical. (2) To examine the protective effects of miR-30s in AngⅡ-treated mice, miR-30a-expressing lentivirus or control lentivirus was injected via the tail vein on day 14 during the AngⅡ infusion. The glomerular podocyte damage was evaluated with proteinuria，PAS staining and podocyte apoptosis and foot process effacement were used to measure podocye injury.(3) treated miR-30-overexpressed podocyte with 10-6mol/L AngⅡ, and cytoskeletal injury and cell apoptosis were examined by F-actin staing and Annexin V-flow cytometry. Results：(1) Ang II infusion induced the downregulation of miR-30 family and the activation of calcium/calcineurin signaling；(2)miR-30a could inhibit AngⅡ-induced activation of calcium/calcineurin signaling and then relieve AngⅡ-induced podocyte injury；(3) Exogenous miR-30a protected podocytes from AngⅡ-induced cytoskeletal damage and apoptosis in vitro. Conclusion：miR-30s could protect podocyte from AngⅡ-induced damage likely through calcium/calcineurin signaling inhibition.

microRNA-30s Angiotensin Ⅱ calcium/calcineurin signaling podocytes

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2017.01.003

國際(地區(qū))合作與交流項(xiàng)目(81320108007)，國家自然科學(xué)基金青年基金(81600559)，南京軍區(qū)總院院管課題(2016035)

南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腎臟科 國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

劉志紅(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)；施少林(E-mail：shaolinshil001@yahoo.com)

2016-11-25

? 2017年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有