進(jìn)境藍(lán)舌病抗體陽(yáng)性動(dòng)物帶毒分析及檢疫處理研究

喬彩霞，汪 琳，蒲 靜，高志強(qiáng)，劉 環(huán)，艾 軍 ，張 偉，尹 羿

(1. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京朝陽(yáng)100026 ； 2. 云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南昆明650228)

進(jìn)境藍(lán)舌病抗體陽(yáng)性動(dòng)物帶毒分析及檢疫處理研究

喬彩霞1，汪 琳1，蒲 靜1，高志強(qiáng)1，劉 環(huán)1，艾 軍2，張 偉1，尹 羿1

(1. 北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京朝陽(yáng)100026 ； 2. 云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，云南昆明650228)

為評(píng)估進(jìn)口藍(lán)舌病病毒(BTV)抗體陽(yáng)性動(dòng)物的感染狀態(tài)，分析其帶毒風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)從國(guó)外進(jìn)口的9批19714頭動(dòng)物，無(wú)菌采集全血分離血清，采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)BTV抗體。對(duì)BTV抗體檢測(cè)陽(yáng)性的動(dòng)物，采集抗凝血，采用OIE推薦的套式RT-PCR和熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將樣品送往藍(lán)舌病參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒分離鑒定，以確定動(dòng)物的藍(lán)舌病感染狀態(tài)。結(jié)果9批動(dòng)物中檢出28頭BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物，但核酸檢測(cè)和病毒分離鑒定的結(jié)果均表明這些BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物并不攜帶有非感染性和感染性病毒粒子。結(jié)合9個(gè)批次的進(jìn)口動(dòng)物并無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，且進(jìn)口動(dòng)物來(lái)源地也無(wú)藍(lán)舌病(BT)的疫情發(fā)生，據(jù)此根據(jù)OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》條款，判定這些抗體陽(yáng)性動(dòng)物為帶毒陰性。本研究通過(guò)對(duì)BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物的帶毒分析，并結(jié)合OIE確定BTV感染的要求，對(duì)BTV口岸隔離檢疫流程提出建議，以指導(dǎo)動(dòng)物檢疫工作，阻止病原經(jīng)口岸傳入。

藍(lán)舌病 ; 抗體陽(yáng)性 ; 感染狀態(tài) ; 檢疫

藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是由藍(lán)舌病病毒(BluetongueVirus，BTV)引起反芻動(dòng)物的一種非接觸性蟲(chóng)媒傳播疫病。近年來(lái)，BT在全球的流行范圍不斷擴(kuò)大，BTV的血清型增多且毒力增強(qiáng)，至今已從非洲、歐洲、亞洲、北美、南美和大洋洲的多個(gè)國(guó)家分離到BTV[1-3]。隨著我國(guó)從國(guó)外進(jìn)口種用反芻動(dòng)物的種類和數(shù)量的增加，BT經(jīng)口岸傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)加大，這就要求我們對(duì)進(jìn)境動(dòng)物進(jìn)行嚴(yán)格的檢疫監(jiān)管以防止疫病傳入我國(guó)。

目前，我國(guó)要求進(jìn)境動(dòng)物必需來(lái)自BT非疫區(qū)，并執(zhí)行嚴(yán)格的檢疫，一經(jīng)檢出陽(yáng)性帶毒動(dòng)物，全群捕殺。2010-2014年間，北京口岸從進(jìn)口的9批動(dòng)物中檢出28頭BT抗體陽(yáng)性動(dòng)物，涉及動(dòng)物包括奶牛、長(zhǎng)頸鹿和羊駝。本研究對(duì)這些BT抗體陽(yáng)性動(dòng)物的帶毒情況進(jìn)行了研究，并提出相應(yīng)的檢疫處理技術(shù)規(guī)范，以指導(dǎo)口岸BT的檢疫工作，保證了進(jìn)口動(dòng)物的健康安全和國(guó)際貿(mào)易的正常進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 進(jìn)口動(dòng)物樣品 2010-2014年，從北京口岸入境的的9個(gè)批次共19 714頭反芻動(dòng)物，動(dòng)物種類包括長(zhǎng)頸鹿、奶牛、羊駝等，來(lái)源國(guó)家包括南非、澳大利亞和荷蘭，如表1所示，采集所有入境動(dòng)物的全血和抗凝血樣品用于研究。

表1 2010-2014年間采集的北京口岸進(jìn)口反芻動(dòng)物樣品信息

1.2 主要試劑 用于檢測(cè)BTV抗體檢測(cè)的試劑盒有3種，分別為法國(guó)IDVET公司生產(chǎn)的BTV抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒、美國(guó)VMRD公司生產(chǎn)的BTV抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒和美國(guó)IDEXX公司生產(chǎn)的BTV抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒。酶包括有GoTaqDNA Polymerase、M-MLV Reverse Transcriptase、RNase inhibitor，購(gòu)自Promega公司；RNA提取試劑盒(RNeasy? Mini Kit)，購(gòu)自QIAGEN公司；膠回收試劑盒(E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit)，購(gòu)自Progema公司；dNTP購(gòu)自北京華美生科生物技術(shù)有限公司；Trans 5K、Trans 2K DNA Marker，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 BTV核酸檢測(cè)用引物/探針 按照OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生手冊(cè)》中推薦的BTV套式RT-PCR和熒光RT-PCR技術(shù)[1]，合成引物和探針，序列見(jiàn)表2，由寶生物工程(大連)有限公司合成。1.4 樣品采集和前處理 無(wú)菌采集全血，分離血清后用于BTV抗體檢測(cè)。采集可疑動(dòng)物的抗凝血(抗凝劑為肝素或EDTA)，用PBS磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH值7.2～7.4)洗滌血樣3～4次，每次2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入等量PBS，采用TRIZol法提取RNA后用于BTV核酸檢測(cè)；或加入等量乳糖蛋白胨培養(yǎng)液(BLP，含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 μg/mL)，置冰浴中用超聲波處理(40μA、1min)，用于BTV病毒分離。

表2 檢測(cè)用引物、探針的名稱、序列及位置

1.5 ELISA檢測(cè)BTV抗體 采用法國(guó)IDVET的BTV競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒對(duì)進(jìn)口的9批動(dòng)物(未進(jìn)行BTV免疫)的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的樣品采用美國(guó)IDEXX和VMRD公司的試劑盒重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果，最終確定抗體陽(yáng)性動(dòng)物。

1.6 套式RT-PCR和熒光RT-PCR檢測(cè)BTV核酸 BT抗體檢測(cè)陽(yáng)性的動(dòng)物，采集抗凝血，經(jīng)處理后提取RNA，采用OIE推薦的套式RT-PCR和熒光RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

套式RT-PCR 分為兩步進(jìn)行，第一步RT-PCR，每個(gè)反應(yīng)的組分：Nuclease-free water 11.8 μL，5× one-step RT-PCR Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，Enzyme1.0 μL，F(xiàn)W primer (25 pmol/mL 0.6 μL，RV primer (25 pmol/μL) 0.6 μL，5 μL RNA，合計(jì)25 μL；反應(yīng)程序：50 ℃ 30 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。第二步套式PCR，每個(gè)反應(yīng)的組分：Nuclease-free water 40.75 μL，10×HotStar Buffer 5.0 μL，dNTP Mix 1.0 μL，HotStarTaq0.25 μL，nFW primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，nRV primer (25 pmol/μL) 1.0 μL，第一階段擴(kuò)增的DNA 1.0 μL，合計(jì)50 μL；反應(yīng)程序： 95 ℃ 15 min；94 ℃ 45 s ，62 ℃ 45 s ，72 ℃ 1 min，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，反應(yīng)結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.7 病毒分離鑒定 選取BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物中抗體滴度較高的10頭動(dòng)物的抗凝血，經(jīng)處理后進(jìn)行病毒分離。接種雞胚：無(wú)菌靜脈接種10～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，每份樣品接種5個(gè)雞胚，每個(gè)雞胚接種0.1 mL樣品，接種后封口，置33.5培養(yǎng)，逐日觀察并記錄，24 h內(nèi)死亡的雞胚為非特異性死亡，將48 h后死亡的雞胚置于4 ℃冰箱保存，于接種后6 d為死亡的雞胚一起收毒。收毒時(shí)每個(gè)胚體取若干組織塊(有病變時(shí)取病變組織)，置乳缽中研磨后，按1∶5加入BLP(含青霉素2 000 IU/mL、鏈霉素2 000 μg/mL)，置4℃浸提4 h后當(dāng)日使用，剩余樣品置-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

接種敏感細(xì)胞：在12孔細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)蚊子細(xì)胞(C6/36)細(xì)胞單層，將收獲的雞胚上清液，接種細(xì)胞單層，每份病料接種兩孔，每孔接種0.1 mL，置25 ℃培養(yǎng)7 d后，收取細(xì)胞懸液，接種BHK21細(xì)胞單層，37 ℃吸附1 h后，加入維持液置37 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，連續(xù)觀察7 d。如盲傳2代出現(xiàn)細(xì)胞病變，采用RT-PCR試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測(cè)BTV抗體 采用法國(guó)IDVET的BTV競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒對(duì)北京口岸進(jìn)口的9批未進(jìn)行BTV免疫的動(dòng)物進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)檢測(cè)陽(yáng)性的樣品采用美國(guó)IDEXX和VMRD公司的試劑盒重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)確認(rèn)，共在9個(gè)批次的進(jìn)口反芻動(dòng)物中檢出28頭BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物，且每1批次均有抗體陽(yáng)性動(dòng)物，抗體陽(yáng)性率為0.03%～66.7%，來(lái)自于南非的長(zhǎng)頸鹿抗體陽(yáng)性率最高，平均高達(dá)42%，其次為荷蘭的羊駝，陽(yáng)性率為20%，詳細(xì)情況見(jiàn)表3。

2.2 套式RT-PCR和熒光RT-PCR檢測(cè)BTV核酸 將BTV抗體檢測(cè)陽(yáng)性的全部18頭動(dòng)物分別采集抗凝血，經(jīng)處理后提取RNA，分別采用套式RT-PCR和熒光RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果套式RT-PCR有2份在100 bp附件有擴(kuò)增條帶，經(jīng)基因克隆后測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行Blast分析，結(jié)果擴(kuò)增條帶為非特異性擴(kuò)增不是BTV的基因序列，熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果全部為陰性。結(jié)果表明，18頭抗體陽(yáng)性動(dòng)物并不攜帶有非感染性病毒粒子。

表3 ELISA檢測(cè)BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物結(jié)果

2.3 病毒分離鑒定 選取10頭BTV抗體滴度較高動(dòng)物的抗凝血，經(jīng)處理后進(jìn)行病毒分離，雞胚和細(xì)胞均未出現(xiàn)病理變化，同時(shí)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物提取核酸后，經(jīng)RT-PCR和熒光RT-PCR鑒定為陰性，表明動(dòng)物均不帶有感染性的病毒。

3 討論

藍(lán)舌病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的必須通報(bào)多種動(dòng)物共患病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也將其列為一類動(dòng)物傳染病。我國(guó)現(xiàn)行法律規(guī)定，一旦進(jìn)口動(dòng)物檢出BTV感染，全群動(dòng)物將作撲殺、銷毀或退回處理。OIE動(dòng)物衛(wèi)生法典中規(guī)定，要確定發(fā)生BTV感染，需要滿足以下條件[4]：一是從動(dòng)物或其產(chǎn)品中分離、鑒定出BTV；二是表現(xiàn)有BT臨床癥狀且排除其他疫病的動(dòng)物，或與確診或疑似病例有流行病學(xué)關(guān)聯(lián)的動(dòng)物，或是認(rèn)為與BTV接觸過(guò)的動(dòng)物，并在其體內(nèi)檢測(cè)BTV抗原或特異性核酸(RNA)；三是上述動(dòng)物非免疫情況下檢出結(jié)構(gòu)蛋白抗體，或免疫情況下檢出非結(jié)構(gòu)蛋白抗體。因此，對(duì)于檢疫中未免疫的BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物，需要經(jīng)過(guò)病毒分離鑒定、核酸檢測(cè)或者流行病學(xué)分析，才能確定其BTV感染狀態(tài)。

BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物是否帶毒，對(duì)其動(dòng)物個(gè)體和同群動(dòng)物的處置至關(guān)重要。為科學(xué)評(píng)估進(jìn)口BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物的感染狀態(tài)，分析其帶毒風(fēng)險(xiǎn)，本研究采集了BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物的抗凝血，進(jìn)行了病毒核酸檢測(cè)和病毒分離鑒定。結(jié)果，病毒分離鑒定和核酸檢測(cè)的結(jié)果均表明所有BTV抗體陽(yáng)性動(dòng)物并不攜帶有感染性和非感染性病毒粒子，結(jié)合9個(gè)批次的進(jìn)口動(dòng)物并無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，且進(jìn)口動(dòng)物來(lái)源地也無(wú)BT的疫情發(fā)生，據(jù)此根據(jù)OIE《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》條款，判定這些抗體陽(yáng)性動(dòng)物為帶毒陰性。

但研究表明，BTV感染后抗體和病原可能共存在于血液循環(huán)系統(tǒng)和免疫器官中，存在帶毒風(fēng)險(xiǎn)[5]，為了進(jìn)一步降低病毒經(jīng)口岸傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)，建議延長(zhǎng)隔離檢疫時(shí)間，將BTV抗體和核酸檢測(cè)陽(yáng)性樣品送參考實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確診，以增加臨床和實(shí)驗(yàn)室檢出率，確診動(dòng)物無(wú)感染后方可放行。此外，庫(kù)蠓是BT傳播必不可少的媒介[6]，因此進(jìn)口動(dòng)物在隔離檢疫期間，除了嚴(yán)格按照流程做好實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)，還應(yīng)采用庫(kù)蠓防護(hù)措施[7]，包括噴撒滅蠓藥品或通過(guò)霧熏，控制和消滅媒介昆蟲(chóng)，防止媒介昆蟲(chóng)造成的潛在傳播風(fēng)險(xiǎn)。

[1] OIE. Terrestrial ManualChapter 2.1.3-Bluetongue [EB/OL].http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/2.01.02_Bluetongue.pdf.2014.

[2] 何宇乾，吳海燕，徐瓊.藍(lán)舌病的流行現(xiàn)狀[J]．中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2012，42(5)：537-540.

[3] 苗志強(qiáng)，鄭明學(xué)，古少鵬，等. 藍(lán)舌病的流行狀況及防控措施[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010，5：28-30.

[4] OIE.Terrestrial Code Chapter 8.3- Infection with bluetongue virus. [EB/OL].http://www.oie.int/index.php?id=169&L=0&htmfile=chapitre_bluetongue.htm.

[5] Giovannini A, MacDiarmid S, Calistri P,etal. The use of risk assessment to decide the control strategy for bluetongue in Italian ruminant populations [J]. Risk Analysis, 2004,24:1737-1753.

[6] Brugger K, Rubel F. Bluetongue disease risk assessment based on observed and projected Culicoides obsoletus spp. vector densities [J]. PLoS ONE, 2013, 8： e60330.

[7] Maclachlan N J, Mayo C E. Potential strategies for control of bluetongue, a globally emerging, Culicoides-transmitted viral disease of ruminant livestock and wildlife [J]. Antiviral Res， 2013,99(2):79-90.

Virus carrier analysis andentry-exit quarantine of bluetongue virus seropositive animals in international trade

QIAO Cai-xia1, WANG Lin1, PU Jing1, GAO Zhi-qiang1, LIU Huan1, AI Jun2, ZHANG Wei1, YIN Yi1

(1.Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau , Beijing 100026 ，China； 2.Yunnan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau , Kunming 650228,China)

The objective of the present study was to investigate the infection status and virus carrier state of bluetongue virus (BTV) seropositive animals. In this study, 19714 sera were aseptically collected from 9 batches of imported animals and tested for anti-BTV antibodies by competitive ELISA. For the seropositive animals, the presence of BTV was detected using real-time RT-PCR or RT-nPCR from anticoagulant-treated whole blood according to the recommendation of OIE. Meanwhile, to confirm the infection status, all positive samples were sent to the BT reference laboratory at Yun Nan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau and subjected to virus isolation. Among the19714 animals that were tested, 28 were positive for antibodies against BTV. However, infectious or noninfectious virus could not be detected by virus isolation (VI) technique or nucleic acid tests. Furthermore, there were no significant clinical symptoms present in the 9 batches of imported animals, and the origin place had no BT epidemic. Based on the above results and relevant items in the OIE“Terrestrial Animal Health Code”, the conclusion was drown that there was no virus presence in seropositive animals.Also, the quarantine procedure for BTV was proposed in this study according to the detection of virus from BTV seropositive animal and the requirement for definite diagnosis of BT by OIE, which will be useful for specific guidelines for trading animals quarantine and preventing potential invasion of BTV.

bluetongue； seropositive ； infection status ； quarantine

2016-01-22

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014IK249)

喬彩霞(1978-)，女，高級(jí)獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)研究 ，E-mail:qiaocx@bjciq.gov.cn

S852.65+9

A

0529-6005(2017)04-0079-03