腺苷A1受體對杏仁核點燃癲癇大鼠海馬神經元損傷作用機制

吳艷芝 鄧文靜 喬 芳 徐國衛(wèi) 李海靜 滕軍放(通訊作者)

1)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

腺苷A1受體對杏仁核點燃癲癇大鼠海馬神經元損傷作用機制

吳艷芝1)鄧文靜2)喬 芳1)徐國衛(wèi)1)李海靜1)滕軍放2)(通訊作者)

1)鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院 鄭州 450042 2)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052

目的 探討腺苷A1受體活性對點燃癲癇大鼠海馬神經元損傷的作用。方法 選擇84只SPF級雄性Wistar大鼠，根據(jù)隨機數(shù)字表法將動物分為正常組、致癇組、致癇+腺苷A1R拮抗劑(8-環(huán)戊-1，3-二丙基黃嘌呤，DPCPX)組、致癇+腺苷A1R激動劑(2-氯化腺苷，2-CADO)組，每組21只。致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組采用電刺激點燃癲癇模型。正常組未進行手術和電刺激致癇等處理；致癇組癲癇模型建立成功前后未注射任何藥物；致癇+DPCPX組大鼠癲癇模型建立成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.3 mg/kg DPCPX；致癇+2-CADO組大鼠癲癇模型成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.6 mg/kg 2-CADO。采用蘇木精-伊紅染色法和TUNEL神經元凋亡測定法觀察各組在癲癇模型建立成功后1 d、15 d、30 d時的海馬CA3區(qū)組織學病理變化及神經元凋亡指數(shù)(AI)變化情況。結果 致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組動物在點燃癲癇后1 d、15 d、30 d均出現(xiàn)不同程度的神經元細胞排列松散無規(guī)則，輪廓模糊，邊緣欠清晰，胞核萎縮，胞漿空泡等神經元結構損害；相同時間點，致癇+DPCPX組的神經元結構損害程度較致癇組加重，致癇+2-CADO組較致癇組減輕。正常組在不同時間點的AI變化不明顯(P>0.05)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI隨著癲癇發(fā)作時間的延長，AI逐漸增加(P<0.05)；在相同時間點，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI均明顯高于正常組(P<0.05)，致癇+DPCPX組的AI均明顯高于致癇組(P<0.05)；致癇+2-CADO組的AI明顯低于致癇組和致癇+DPCPX組(P<0.05)。結論 癲癇發(fā)作會引起神經元損傷和凋亡，其可能與腺苷A1R活性降低，興奮性氨基酸谷氨酸濃度增加有關，谷氨酸興奮性增加可誘導神經元凋亡，這可能是癲癇發(fā)作后神經元損傷的機制之一。

腺苷A1受體；癲癇；海馬神經元

細胞凋亡是指有核細胞在某些生理性或病理性因子刺激后，其表面分子結構作出應答反應，并將信號傳入胞內，激活胞內分子機制，誘發(fā)細胞死亡的過程。有研究報道，癲癇發(fā)作會影響腦內神經遞質的釋放和細胞跨膜信息的傳遞，致使神經元受損甚至凋亡，最終導致膠質細胞增生、突觸重建等腦結構和功能的可塑性改變，這種改變會使癲癇反復性發(fā)作[1]。故癲癇繼發(fā)性腦損傷的機制和保護措施是近年來難治性癲癇研究的熱點。

腺苷系統(tǒng)對中樞神經系統(tǒng)具有抑制性保護作用，其機制主要是結合腺苷A1受體(A1R)發(fā)揮作用。大量的研究表明，腺苷A1R對各種中樞性神經系統(tǒng)疾病所致的神經元損傷有保護作用[2]，但其對杏仁核點燃癲癇大鼠各個時間段海馬神經元的病理組織學和凋亡的影響鮮見報道。本實驗通過探討腺苷A1R與模型海馬神經元損傷的關系，了解其對腦神經的保護作用，從而能更深刻地理解腺苷A1R與癲癇的關系，為癲癇的治療提供參考。

1 材料與方法

1．1 實驗動物及分組 SPF級雄性Wistar大鼠(200～250 g)84只，均購自河南省實驗動物飼養(yǎng)中心，動物飼養(yǎng)條件：晝夜交替12 h光照，避噪聲，單籠飼養(yǎng)，溫度18～25 ℃，相對濕度45%～70%。根據(jù)隨機數(shù)字表法將動物分為正常組、致癇組、致癇+腺苷A1R拮抗劑(8-環(huán)戊-1，3-二丙基黃嘌呤，DPCPX)組、致癇+腺苷A1R激動劑(2-氯化腺苷，2-CADO)組，每組21只。選取點燃癲癇模型成功后的1 d、15 d、30 d作為觀察時間點，各時間點選7只大鼠。

1．2 點燃癲癇模型的建立

1．2．1 五芯電極的制作：材料：尖頭鉗、鑷子、剪刀、刀片、電烙鐵、捍錫、松香、打火機、直徑0.19 mm鎳鉻絲、傳感接頭、微型螺絲(均為市場購買)；登士柏牙托水、仿生型牙托粉(均購自鄭州凱斯特醫(yī)療器械有限公司)、6%水合氯醛(水合氯酸粉劑配制成溶液，并用過濾器過濾無菌)。制作方法：①取鎳鉻絲，剪取長5 cm 3根，長3.5 cm 2根；②用打火機將5根剪裁好的鎳鉻絲兩頭燒紅變黑，用刀片將外面的鍍層去掉；③拔出傳感接頭上的塑料接頭，并在凹槽處依次標記1～5；④將去掉鍍層的鎳鉻絲固定在塑料接頭上，標記1、4、5位置固定5 cm的鎳鉻絲，標記2、3位置固定3.5 cm鎳鉻絲，并用電烙鐵及焊錫加固；⑤將2根3.5 cm鎳鉻絲相互扭轉成一直線，并垂直于塑料接頭，尾端位置分叉，但間隙<1 mm；⑥將3根5 cm鎳絡絲末端擰上螺絲，避免松動；⑦調整牙托粉和牙托水比例，確保電極及塑料接頭固定良好。

1．2．2 手術及電極植入：動物麻醉：取6%水合氯醛麻醉，對致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠采用腹腔注射方式，每100 g注射量為0.5 mL。用手術鉗夾大鼠尾巴，其無反應即可判斷麻醉成功，若麻醉不成功，可增加0.3 mL，增加次數(shù)須≤2次。電極植入：①剪去大鼠顱頂部手術區(qū)被毛，并固定于離體定位儀上，保持頭正中位，其門牙置于定位儀牙槽孔內；常規(guī)消毒模型顱頂部手術區(qū)皮膚，行一1.5～2 cm的切口，充分顯露術野。②將已消毒的電極固定在夾持器上，將3、4位置兩根互相擰成直線的鎳絡絲做成的扎入電極與地面垂直；③調整三維坐標軸，調整扎入電極尖端定位于前囟點，記錄三維坐標刻度值(X/Y/Z)；④參照大鼠腦立體定位圖譜，用牙科鉆在已定位的右側杏仁外側核處(BLA)鉆孔，盡可能不傷及腦膜；⑤植入扎入電極約8.5 mm，用牙托粉和牙托水固定電極在入顱處；⑥在1、 2位置的兩個螺絲固定在前囟點左右作記錄電極，5位置螺絲固定在人字縫后方為參考電極；調整塑料電極頭使其凹槽處于前方，將電極、微型螺絲、塑料接頭均固定在顱骨表面；⑦將大鼠從立體定位儀上取下，放回籠中。術后觀察：術后7 d內，每天抓取測量其體質量，自由進食水和食物。

1．2．3 模型點燃：①術后第8天開始，所有大鼠接受電刺激，采用BL-420F生物功能實驗系統(tǒng)，通道1和通道2設置為腦電信號，采用細電流連續(xù)串刺激模式，電流強度500 mA，延時100 ms，波寬1 ms，頻率50 Hz，串長100，每天刺激1次。刺激前后記錄杏仁核后放電及大鼠行為學變化。②根據(jù)國際通用的癲癇發(fā)作Racine分級：0級：無行為學改變；1級：濕狗樣震顫；2級：點頭及阻嚼動作；3級：前肢單肢陣攣，未直立；4級：雙前肢陣攣伴身體直立；5級：強直陣攣發(fā)作伴隨直立并背部倒地。大鼠連續(xù)10 d達到5級發(fā)作視為模型成功。

1．3 各組的處理方法 正常組未進行手術和電刺激致癇等處理；致癇組大鼠癲癇模型建立成功后未注射任何藥物；致癇+DPCPX組大鼠癲癇模型建立成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.3 mg/kg DPCPX；致癇+2-CADO組大鼠癲癇模型成功前1 h和成功后1 h尾部靜脈注射0.6 mg/kg 2-CADO。其中2-CADO購自美國Sigma公司、DPCPX購自美國Sigma公司。

1．4 石蠟切片制作、HE染色及TUNEL神經元凋亡測定

1．4．1 標本采集及石蠟切片制作：取6%水合氯醛對大鼠進行麻醉，并將其仰臥固定于解剖板上，從劍突處開胸，顯露心臟，用穿刺針摻入心尖部并固定在左心室位置，再在動物心臟右心耳剪一小口放血，進行主動脈灌流，迅速注入生理鹽水100 mL，再灌注200 mL含4%多聚甲醛的緩沖液，切斷動物頭部，取出腦組織，4%多聚甲醛固定。常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。將模具放在冰上10 min后，將蠟塊取出，置于4 ℃冰箱保存。

1．4．2 HE染色：按照蘇木精-伊紅染色法的步驟操作，其中蘇木素購自上海士鋒生物科技有限公司，無水乙醇購自石家莊瑞興化工有限公司，二甲苯購自石家莊瑞興化工有限公司，中性樹膠購自北京百奧萊博科技有限公司，依次二甲苯脫蠟、酒精浸泡、蘇木素染色、脫水、返藍、沖洗、伊紅染色、透明、封片。每個標本進行海馬組織切片，隨機取5個400倍光鏡視野，計算總細胞數(shù)和神經元凋亡細胞數(shù)，取平均值作為最后結果進行計算。

1．4．3 TUNEL神經元凋亡測定：采用TUNEL法對神經元細胞凋亡細胞數(shù)目進行測定，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自北京世聯(lián)搏研科技有限公司，首先對切片脫蠟，滴加蛋白酸K工作液，20～37 ℃作用20～30 min，滅活內源性過氧化物酶，加50 μL TdT 酶反應液，37 ℃避光培育 1 h，加50 mL Strep-tavidin-HRP工作液37 ℃避光培育30 min，以上5個程序過后均用PBS洗滌3～5次，5 min/次，然后進行顯色、返藍、脫水、透明、封片，在顯微鏡觀察獲得圖像。神經元凋亡細胞經TUNEL染色后細胞核呈棕色或棕褐色。神經元細胞凋亡指數(shù)(AI)是指每個視野神經元細胞凋亡細胞總數(shù)除以每個視野的細胞總數(shù)。

2 結果

2．1 杏仁核點燃大鼠癲癇模型的行為學及腦電特征觀察 致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠隨著電刺激次數(shù)的增加，杏仁核后放電逐漸升高，電刺激第10天時達到穩(wěn)定5級發(fā)作(圖1)。致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠腦電波在點燃前(未到達5級發(fā)作時)未見癇樣放電(圖2)，點燃后模型癲癇發(fā)作時可見大量高幅棘波發(fā)放，腦電基本頻率正常(圖3)。

圖1 刺激時間與ADD的關系

圖2 點燃前腦電圖表現(xiàn)

圖3 點燃后腦電圖表現(xiàn)

2．2 腺苷A1R對點燃癲癇大鼠海馬神經元損傷的神經保護作用 4組海馬CA3區(qū)神經元損傷病理組織學變化情況對比：(1)正常組1 d、15 d及30 d時動物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見圖4，神經元細胞排列緊密，輪廓清晰，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透明，結構完整。(2)致癇組點燃癲癇后1 d、15 d及30 d時動物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見圖5，點燃癲癇后1 d神經元細胞結構基本正常，排列欠整齊，少量神經細胞腫脹、形態(tài)不完整；15 d、30 d時神經元細胞排列松散無規(guī)則，輪廓模糊，邊緣欠清晰，胞核萎縮，胞漿空泡，出現(xiàn)明顯神經元變性，死亡等不同程度的結構損害。(3)致癇+DPCPX組點燃癲癇后1 d、15 d及30 d時動物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見圖6，與致癇組相比，相同時間點致癇+DPCPX組大鼠海馬CA3區(qū)神經元細胞排列更加紊亂，細胞水腫、胞漿空泡、神經元變性壞死等結構損害程度加重。(4)致癇+2-CADO組點燃癲癇后1 d、15 d及30 d時動物模型海馬CA3區(qū)HE染色情況見圖7，與致癇組相比，相同時間點致癇+2-CADO組大鼠海馬CA3區(qū)神經元細胞排列基本規(guī)整有序，細胞水腫、胞漿空泡、神經元變性壞死等結構損害程度減輕。

1 d 15 d 30 d圖4 正常組大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時神經元HE染色

1 d 15 d 30 d圖5 致癇組點燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時神經元HE染色

1 d 15 d 30 d圖6 致癇+DPCPX組點燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時神經元HE染色

1 d 15 d 30 d圖7 致癇+2-CADO組點燃癲癇后大鼠海馬CA3區(qū)1 d、15 d及30 d時神經元HE染色

2．3 4組點燃癲癇后1 d、15 d、30 d海馬CA3區(qū)神經元凋亡指數(shù)(AI)比較情況 正常組在不同時間點的AI變化不明顯(P>0.05)，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI隨著癲癇發(fā)作時間的延長，凋亡指數(shù)逐漸增加(P<0.05)；在相同時間點，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組的AI均明顯高于正常組(P<0.05)，致癇+DPCPX組的AI均明顯高于致癇組(P<0.05)；致癇+2-CADO組的AI明顯低于致癇組和致癇+DPCPX組(P<0.05)。見表1。

表1 4組點燃癲癇后1 d、15 d、30 d海馬CA3區(qū)神經元 凋亡指數(shù)(AI)比較情況

注：與正常組比較，aP<0.05；與致癇組比較，bP<0.05；與致癇+DPCPX組比較，cP<0.05

3 討論

癲癇的發(fā)生與多種因素相關，為了闡明其發(fā)病機制，癲癇模型的建立起著重要作用。目前，癲癇模型有化學試劑誘導癲癇模型和電剌激癲癇模型等[3]。電刺激癲癇模型最早由Goddard于1967年提出，這種模型具有以下優(yōu)勢[4]：(1)動物癲癇發(fā)作與腦電圖癇樣放電同步；(2)每天采用低強度電刺激對腦組織的損傷作用較弱；(3)模型點燃成功后，其自發(fā)性癲癇發(fā)作持續(xù)時間可達12個月以上。研究表明，電刺激癲癇模型，在點燃癲癇過程中并未出現(xiàn)神經元缺失和腦組織結構損害[5]。Pak等[6]采用定量體視學技術對電刺激癲癇模型進行神經元損傷進行觀察，發(fā)現(xiàn)當大鼠出現(xiàn)5級發(fā)作3次后其海馬神經元出現(xiàn)部分缺失，隨著5級發(fā)作次數(shù)的增多，神經元缺失逐漸加重。

研究報道，點燃癲癇發(fā)作可損害海馬，引起海馬神經元損傷和凋亡[7-8]。本實驗中，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠經過10次5級發(fā)作后HE染色可見，與正常組相比，其海馬CA3區(qū)均出現(xiàn)明顯的神經元缺失；正常組動物海馬神經元細胞排列緊密，輪廓清晰，胞核呈圓形或橢圓形，胞漿透明，結構完整；致癇組動物在癲癇發(fā)作第1天時海馬神經元細胞結構基本正常，排列欠規(guī)則，部分細胞腫脹，癲癇發(fā)作15 d、30 d時神經元細胞松散無序，邊緣模糊，胞核萎縮，胞漿空泡，細胞間距增大，出現(xiàn)明顯神經元變性、壞死，這一結果提示癲癇發(fā)作會引起海馬神經元損傷；在同一時間點，致癇+DPCPX組海馬神經元細胞排列更加松散無序，細胞水腫、胞漿空泡更加嚴重，神經元變性壞死等結構損害程度較致癇組加重；而與致癇組相比，致癇+2-CADO組海馬神經元細胞排列較規(guī)整，細胞水腫、胞漿空泡、神經元變性壞死等結構損害均減輕；這提示腺苷A1R活性增強會減輕海馬神經損傷，故提高腺苷A1R活性對癲癇發(fā)作引起的海馬損傷具有保護作用。

本實驗采用TUNEL神經元凋亡測定不同腺苷A1R活性狀態(tài)下癲癇大鼠模型的海馬神經元凋亡指數(shù)，發(fā)現(xiàn)在相同時間點，致癇組、致癇+DPCPX組、致癇+2-CADO組大鼠海馬神經元凋亡指數(shù)均明顯高于正常組，說明癲癇發(fā)作可誘發(fā)神經元死亡；致癇+DPCPX組動物的神經元凋亡指數(shù)較致癇組顯著增高，提示腺苷A1R活性的降低會加劇海馬神經元的凋亡；致癇+2-CADO組的神經元凋亡指數(shù)較致癇組降低，提示腺苷A1R活性的增加會阻止海馬神經元的凋亡，這與上述HE染色發(fā)現(xiàn)的海馬組織學病理變化相一致，從而證實了腺苷A1R參與了癲癇發(fā)作后海馬神經元損傷過程中對神經的保護作用，且可抵抗神經元調亡。

綜上所述，癲癇發(fā)作會引起神經元損傷和凋亡，其可能與腺苷A1R活性降低、興奮性氨基酸谷氨酸濃度增加有關，谷氨酸興奮性增加可誘導神經元凋亡，這可能是癲癇發(fā)作后神經元損傷的機制之一。因此，通過增加腺苷A1R活性可保護神經元，降低其損傷，可能是終止癲癇發(fā)作的一個治療方向。

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(收稿2016-11-10)

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1673-5110(2017)05-0040-05