紫蘇脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息學(xué)及其表達(dá)特性分析

李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

紫蘇脂肪酸硫酯酶基因PfFatA生物信息學(xué)及其表達(dá)特性分析

李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王計(jì)平

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

為研究脂肪酸硫酯酶A(FatA)在紫蘇脂肪酸合成機(jī)制中發(fā)揮的作用，對(duì)紫蘇FatA基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，PfFatA基因cDNA全長(zhǎng)1 652 bp，開放閱讀框1 119 bp，編碼372個(gè)氨基酸；紫蘇FatA基因編碼的蛋白質(zhì)為親水性不穩(wěn)定蛋白，無跨膜區(qū)域；含Acyl-ACP_TE保守結(jié)構(gòu)域，屬于Hotdog fold超蛋白家族；多序列比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，序列C端含有保守的三聯(lián)肽AKL和SKV結(jié)構(gòu)；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，紫蘇與丹參親緣關(guān)系較近。通過Real-time PCR分析得知，PfFatA在紫蘇根、莖、葉、花和種子不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)，其中，在種子發(fā)育初期表達(dá)量最高。該研究結(jié)果可為進(jìn)一步闡明PfFatA基因的功能及作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

紫蘇；脂肪酸硫酯酶基因(FatA)；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

植物脂肪酸合成過程中，脂肪酸硫酯酶(Fatty acid thioesterase)是游離脂肪酸從頭合成的關(guān)鍵酶，直接決定植物油的鏈長(zhǎng)和脂肪酸種類[1]。根據(jù)其氨基酸序列的不同將植物中硫酯酶分為2類，分別為FatA和FatB[2]。其中，F(xiàn)atA對(duì)18∶1-ACP具有高活性，在植物中普遍存在且高度保守，有關(guān)擬南芥的研究結(jié)果表明，其基因組中含有2個(gè)FatA基因和一個(gè)FatB基因[3]。FatA基因有2個(gè)拷貝，分別為FatA1和FatA2，這2個(gè)硫酯酶亞基表達(dá)作用相似且?guī)缀踉谒薪M織中都表達(dá)[4]，其中，F(xiàn)atA2在幼苗、根、葉、莖、花、果莢中都表達(dá)，尤其在果莢中表達(dá)量高；相反，F(xiàn)atA1基因在葉和嫩果莢中表達(dá)量很低，而在其他器官中很難被檢測(cè)到，表明擬南芥中FatA2基因?qū)ΨN子脂類代謝和果莢發(fā)育起重要調(diào)控作用[5]。

紫蘇(Perillafrutescens)是一種新型油料作物，種子含油量高達(dá)35%～46%，富含α-亞麻酸[6]，F(xiàn)atA基因是脂肪酸合成過程中的關(guān)鍵酶基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)量的增加可促進(jìn)不飽和脂肪酸含量的增加[7]，同時(shí)該蛋白的遺傳多樣性較低，不同植物中保守性較強(qiáng)[8]。

本試驗(yàn)為了進(jìn)一步研究FatA基因在紫蘇脂肪酸合成過程中的作用，對(duì)該基因進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，并對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行了初步功能預(yù)測(cè)；通過Real-time PCR檢測(cè)FatA基因在紫蘇根、莖、葉、花和種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量，以期為該基因在紫蘇等油料作物中的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物材料為紫蘇優(yōu)選品種晉蘇1號(hào)，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)作站試驗(yàn)田，在紫蘇生長(zhǎng)不同階段分別取根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的種子(即開花后10，20，30，40 d的種子)，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫蘇PfFatA基因鑒定 以紫蘇轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)為依據(jù)，從中挑選出功能注釋為FatA的基因，參照劉志勇等[9]的方法，根據(jù)不同物種間同源基因核酸序列相對(duì)保守的特點(diǎn)，將擬南芥FatA與紫蘇中該基因同源序列進(jìn)行比對(duì)分析，最后得到紫蘇PfFatA基因cDNA序列。

1.2.2 紫蘇PfFatA基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 借助在線分析軟件ProtParam(http://web.expasy.org /protparam/)對(duì)紫蘇FatA基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；利用TMPred(http://www.ch.embnet.org/software/ TMPRED_ form.html)軟件和 ProtScale工具(http：//web.expasy.org)分析紫蘇FatA的跨膜區(qū)域及疏水區(qū)域；通過NCBI的CDD(Conserved domain database)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析鑒定；登陸在線軟件SOPMA對(duì)紫蘇FatA二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用在線分析軟件Swiss-model(http://www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行紫蘇FatA三級(jí)結(jié)構(gòu)分析并進(jìn)行建模。運(yùn)用MEGA 6.0多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇及近緣種的FatA進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析其近緣物種間的同源性，獲得相關(guān)的進(jìn)化信息。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 利用TRIzol總RNA提取試劑盒提取紫蘇根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期種子的總RNA。選取18S rRNA作為內(nèi)參基因[10]，以獲得的cDNA為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒購(gòu)于TaKaRa有限公司，應(yīng)用CFX96 Real-Time PCR Detection System進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：SYBR Premix ExTaq Ⅱ12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，PCR Reverse Primer 1 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL共25 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇PfFatA基因全長(zhǎng)cDNA序列及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

通過對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果比對(duì)分析獲得PfFatA基因cDNA全長(zhǎng)序列1 652 bp，ORF為1 119 bp(190～1 308)，共編碼372個(gè)氨基酸(圖1)，正電荷氨基酸殘基數(shù)為49，負(fù)電荷殘基數(shù)為46，理論pI為8.35，該蛋白呈堿性，相對(duì)分子質(zhì)量為41.568 1 kDa，分子式為C1813H1899N535O556S15，共有5 815個(gè)原子，總平均親水指數(shù)為-0.440，脂質(zhì)指數(shù)為81.80，不穩(wěn)定系數(shù)為44.78。因此，該蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白。

氨基酸序列的疏水性決定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類型和穩(wěn)定性。膜蛋白穿過膜的磷脂雙分子層，這種特殊的環(huán)境決定了跨膜區(qū)必須由強(qiáng)疏水的氨基酸組成[12]。對(duì)紫蘇FatA基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)域和疏水性分析可知，紫蘇FatA基因編碼蛋白為膜內(nèi)蛋白，不存在跨膜區(qū)域(圖2)，蛋白疏水指數(shù)為-2.95～1.75，為親水性蛋白(圖3)，預(yù)測(cè)結(jié)果與譚曉風(fēng)等[13]對(duì)油茶FatA基因編碼蛋白的分析結(jié)果一致。

利用NCBI-CDD對(duì)其蛋白序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析得知，該蛋白具有Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域，屬于Hotdog fold超蛋白家族。 利用SOPMA對(duì)該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該蛋白主要含無規(guī)則卷曲(38.17%)、α螺旋(34.95%)和β折疊(19.89%)3種結(jié)構(gòu)元件，通過Swiss-model軟件用同源建模的方法對(duì)紫蘇FatA基因編碼蛋白三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖4所示。

利用MEGA 6.0多序列比對(duì)軟件對(duì)紫蘇(Perillafrutescens)及其擬南芥(Arabidopsisthaliana)、可可(Theobromacacao)、甘草(Erythrantheguttata)、芝麻(Sesamumindicum)和丹參(Salviamiltiorrhiza)等FatA基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，并構(gòu)建進(jìn)化樹，多序列比對(duì)可知，該序列C端含有保守的三聯(lián)肽AKL和SKV結(jié)構(gòu)(圖5)，屬于過氧化物酶體功能蛋白[14]；FatA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，紫蘇與丹參親緣關(guān)系最近，與油料作物蓖麻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖6)。

圖1 PfFatA基因的全長(zhǎng)序列以及翻譯出的氨基酸序列

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

熒光定量PCR結(jié)果分析表明，紫蘇PfFatA基因在根、莖、葉、花和不同發(fā)育時(shí)期的種子中均有表達(dá)(圖7)，其中，種子發(fā)育初期(開花后10 d)表達(dá)量最高，為根系中該基因表達(dá)量的6.8倍；其次是葉片，為根系表達(dá)量的5.9倍；開花后30 d的種子中FatA基因表達(dá)量最低。說明PfFatA基因在種子脂類代謝和種子發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用。

圖2 PfFatA蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)

圖3 PfFatA蛋白疏水性預(yù)測(cè)

圖4 PfFatA蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖5 FatA多序列比對(duì)

圖6 FatA蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同小寫字母表示在0.05水平上方差分析差異顯著性。Different lowercase letters in table mean significant at significant α=0.05.

3 結(jié)論與討論

紫蘇作為一種新型油料作物，其高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的關(guān)鍵性是含油量及α-亞麻酸含量較高，紫蘇油被醫(yī)學(xué)界認(rèn)為是深海魚油的更新?lián)Q代產(chǎn)品[15]。FatA作為脂肪酸合成的主要貢獻(xiàn)者，大部分研究集中于該酶對(duì)種子形成過程中種子油積累所起的調(diào)控作用。本研究采用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)紫蘇PfFatA基因編碼的蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，PfFatA基因編碼372個(gè)氨基酸殘基，整條多肽鏈總體上表現(xiàn)為親水性；其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、無規(guī)則卷曲和β折疊組成。對(duì)其保守結(jié)構(gòu)域分析得知，該蛋白具有Acyl-ACP_TE結(jié)構(gòu)域，屬于Hotdog fold超蛋白家族，F(xiàn)atA蛋白在紫蘇不飽和脂肪酸合成過程中對(duì)18∶1-ACP具有高活性，在將新生成的脂酰-ACP 分解為 ACP和游離脂肪酸的過程中起重要作用[16]。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，不同植物FatA基因編碼的蛋白具有較高的相似性，從進(jìn)化上來看，紫蘇與丹參的親緣關(guān)系最近，F(xiàn)atA基因所編碼蛋白質(zhì)的殘基序列相似性達(dá)到85.2%，說明紫蘇既可作為油料作物，又可作為中藥材[17]；同時(shí)也反映了同源蛋白在不同物種中功能的相似性。

關(guān)于FatA基因在不同植物不同組織中表達(dá)分析研究較多，模式植物擬南芥FatA雙缺突變體的研究結(jié)果分析顯示，F(xiàn)atA基因控制脂肪酸的合成與脂肪酸含量的高低[18]；李鐵柱等[8]對(duì)杜仲α-亞麻酸生物合成相關(guān)基因表達(dá)的研究結(jié)果表明，F(xiàn)atA在幼果和成熟果實(shí)表達(dá)量無顯著差異，說明FatA基因在其果實(shí)形成過程中雖一直表達(dá)，但保守性較強(qiáng)；對(duì)于油菜、花生的Fat蛋白結(jié)構(gòu)域分析可知，該蛋白質(zhì)主要功能是在脂肪酸合成過程中將?；鶊F(tuán)從酰基載體蛋白上解離下來，終止脂肪酸的延伸過程[19-20]。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究PfFatA基因在紫蘇不同組織和種子發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)，結(jié)果表明，該基因在不同組織器官中都有表達(dá)，但在種子發(fā)育初期表達(dá)量最高；其次是葉片，這一結(jié)果與Wang等[5]對(duì)擬南芥FatA基因的研究結(jié)果相似。

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Bioinformatics and Expression Characteristics Analysis of Fatty Acid Thioesterase Gene inPerillafrutescens

LI Lu，LIANG Qian，AN Xi，ZHOU Yali，WANG Jiping

(College of Agronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China)

In order to detect the function of fatty acid thioesterase (FatA) in fatty acid synthesis mechansim of perilla, many bioinformatics analytical methods were used to analyze the protein encoded by FatA gene.The result showed that full length of cDNA forPfFatAwas 1 652 bp，open reading frame(ORF)was 1 119 bp，coding 372 amino acids.FatA was an unstable hydrophilic protein，without transmembrane region.FatA protein contained a conserved domain of Acyl-ACP_TE，belonging to the Hotdog fold super protein family.Multiple sequence alignment indicated that FatA had highly conserved triple peptide of AKL,SKV in the C-terminal.Phylogenetic tree analysis showed thatPerillafrutescenshad the closest genetic relationship withSalviamiltiorrhiza.The result of Real-time PCR showedPfFatAwas expressed in roots，stems，leaves，flowers and seeds from different development period，especially in seeds formed in 10 days after flowering.These results of the current study provided a foundation for further illustrating the function and mechanism ofPfFatAgene.

Perillafrutescens；Fatty acid thioesterase；Bioinformatics；Expression analysis

2017-02-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201266)

李 璐(1992-)，女，山西靈石人，在讀碩士，主要從事紫蘇油脂代謝機(jī)理研究。

王計(jì)平(1974-)，女，山西陽泉人， 副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物油脂代謝機(jī)理研究。

S565.8；Q78

A

1000-7091(2017)02-0104-05

10.7668/hbnxb.2017.02.016