藍(lán)莓VcMYB啟動(dòng)子克隆及其功能初步分析

史文君，滕 珂，陳 露，侯智霞，蘇淑釵

(1.北京林業(yè)大學(xué)，省部共建森林培育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藍(lán)莓研究與發(fā)展中心，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，草坪研究所，北京 100083)

藍(lán)莓VcMYB啟動(dòng)子克隆及其功能初步分析

史文君1，滕 珂2，陳 露1，侯智霞1，蘇淑釵1

(1.北京林業(yè)大學(xué)，省部共建森林培育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，藍(lán)莓研究與發(fā)展中心，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，草坪研究所，北京 100083)

為探究VcMYB啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中如何發(fā)揮調(diào)控作用，利用FPNI-PCR法從藍(lán)莓中克隆到調(diào)控原花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子VcMYB的768 bp啟動(dòng)子序列。用PLACE和Plant CARE在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具分析了該啟動(dòng)子，結(jié)果表明其序列中存在啟動(dòng)子的基本元件CAAT-box和TATA-box，還包含一系列的響應(yīng)元件，如光響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、防御與脅迫響應(yīng)元件和茉莉酸甲酯響應(yīng)元件等。為進(jìn)一步分析該啟動(dòng)子的功能，構(gòu)建了該基因啟動(dòng)子與GUS基因融合的植物表達(dá)載體VcMYBpro::GUS，并用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色分析，結(jié)果表明該VcMYB啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中表達(dá)，并且經(jīng)脫落酸(ABA)、4 ℃低溫、LED光照和持續(xù)光照處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥中GUS的表達(dá)活性增強(qiáng)，推測(cè)該基因受ABA、低溫和光的調(diào)控。

藍(lán)莓；VcMYB；啟動(dòng)子；GUS基因；原花青素

高等植物基因表達(dá)受到復(fù)雜的調(diào)控，根據(jù)基因調(diào)控在同一事件中發(fā)生的先后順序分為轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控和翻譯水平調(diào)控等。啟動(dòng)子(Promoter)是位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使其與模板準(zhǔn)確結(jié)合，從而起始轉(zhuǎn)錄，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心[1-2]。因此，對(duì)啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能進(jìn)行研究有著非常重要的理論意義。

MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物中，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。根據(jù)所含MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，MYB轉(zhuǎn)錄因子可以分為4個(gè)亞類：1R(R1/2，R3-MYB)、2R(R2R3-MYB)、3R(R1R2R3-MYB)和4R(4個(gè)類似R1/R2結(jié)構(gòu)的重復(fù))[3-4]。其中R2R3-MYB蛋白是植物中最大的一類，其參與初生和次生代謝反應(yīng)(類黃酮，如原花青素)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育調(diào)控，以及對(duì)生物和非生物脅迫應(yīng)答等生物學(xué)過(guò)程[5]。MYB轉(zhuǎn)錄因子作為反式作用因子調(diào)控下游基因的表達(dá)，其表達(dá)也受上游基因的調(diào)控。在擬南芥中，WD40蛋白TTG1調(diào)控各途徑中的MYB基因，形成的MBW復(fù)合體(MYB-bHLH-WD40 transcription factors，MBW complex)結(jié)合到花青素或原花青素生物合成基因的啟動(dòng)子上，從而調(diào)控MYB下游結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[6]。另外，研究發(fā)現(xiàn)有MYB蛋白直接調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥中參與細(xì)胞分化的轉(zhuǎn)錄因子CAPRICE(CPC)是R3型MYB，R2R3-MYB蛋白WEREWOLF(WER)通過(guò)結(jié)合到啟動(dòng)子區(qū)域的方式直接調(diào)控CPC轉(zhuǎn)錄因子[7]。因此，研究MYB啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于研究代謝調(diào)控有重要意義。

原花青素(Proanthocyanidin，PA)，又稱為縮合單寧(Condense tannin)，是植物類黃酮次生代謝的末端產(chǎn)物之一，是由黃烷酮類形成的寡聚或多聚化合物。原花青素在自然界中廣泛存在，被認(rèn)為有利于抵御生物和非生物脅迫。近年來(lái)，關(guān)于植物中參與原花青素代謝調(diào)控的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究逐漸增多。首先在擬南芥中報(bào)道，AtTT2調(diào)控?cái)M南芥種子中原花青素的合成[8]。后續(xù)在葡萄(VvMYBPA1、VvMYBPA2)[9-10]、柿(DkMyb2和DkMyb4)[11-13]、油桃(PpMYBPA1)[14]、楊樹(shù)(PtMYB134)[15]等植物中得到的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子激活原花青素的合成。另外，有研究發(fā)現(xiàn)FaMYB1 和VvMYBC2-L1等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)下調(diào)原花青素合成基因，從而減少了原花青素的積累[16-17]。這些研究大多關(guān)注MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)原花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因的調(diào)控及其對(duì)原花青素積累的影響，而關(guān)于原花青素合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子的報(bào)道較少。柿果實(shí)中含有大量的PA，DkMyb4是柿中調(diào)控PA合成途徑基因的MYB轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)DkbZIP5識(shí)別DkMyb4啟動(dòng)子區(qū)的ABA響應(yīng)元件ABRE，作為ABA依賴的DkMyb4的直接調(diào)節(jié)因子。ABA信號(hào)很可能通過(guò)DkbZIP5激活DkMyb4的方式參與柿果實(shí)原花青素的合成[13]。桃中調(diào)節(jié)PA合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子PpMYB7能激活PpLAR1的轉(zhuǎn)錄，而不能激活PpANR。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，存在外源ABA時(shí)PpZIP5能激活PpMYB7的啟動(dòng)子[18]。

原花青素是積累在藍(lán)莓果實(shí)中的3種常見(jiàn)類黃酮之一[19]。目前，已有研究報(bào)道從高叢藍(lán)莓(Vacciniumcorymbosum)中分離得到了一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子VcMYBPA1，其與原花青素的合成有關(guān)[20]。白色變異越橘屬漿果(Vacciniumuliginosum)中的VuMYBPA1與VcMYBPA1同源，屬于MYBPA1型MYB家族成員，與果實(shí)中原花青素合成有關(guān)[21]。筆者已發(fā)表的VcMYB序列與VcMYBPA1和其他物種中與原花青素合成調(diào)控有關(guān)的MYB序列(DkMyb4，GenBank登錄號(hào)為AB503701)的一致性較高。然而，對(duì)參與藍(lán)莓原花青素代謝調(diào)控的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)子的報(bào)道較少。啟動(dòng)子控制基因的表達(dá)，研究藍(lán)莓原花青素代謝調(diào)控相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子對(duì)于了解藍(lán)莓原花青素合成的調(diào)控機(jī)制有重要意義。本研究利用FPNI-PCR(Fusion primer and nested integrated PCR)法從藍(lán)莓中克隆得到與原花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子VcMYB的啟動(dòng)子，使用在線工具分析其序列特征，構(gòu)建該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。初步分析轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)光、低溫、ABA等非生物脅迫和激素的響應(yīng)情況，為進(jìn)一步研究藍(lán)莓原花青素合成相關(guān)的MYB基因的表達(dá)調(diào)控及其啟動(dòng)子的應(yīng)用提供基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 供試藍(lán)莓品種為藍(lán)豐，采自北京林業(yè)大學(xué)苗圃。野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana，Columbia ecotype)種子購(gòu)自美國(guó)擬南芥生物資源中心(Arabidopsis Biological Resource Center，ABRC)。

1.1.2 生化試劑 植物表達(dá)載體pCAMBIA1391Z由北京林業(yè)大學(xué)草坪研究所惠贈(zèng)。pEASY-T1載體購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)(TransGen Biotech)有限公司。引物的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司完成。測(cè)序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌(E.coli)DH10B感受態(tài)細(xì)胞和Seamless Assembly Cloning Kit購(gòu)自中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司。農(nóng)桿菌GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 植物培養(yǎng) 將擬南芥種子經(jīng)70%的乙醇表面滅菌，吸除乙醇，加入1 mL無(wú)菌水洗1次，再加入2%次氯酸鈉溶液處理10 min，吸出次氯酸鈉溶液，用無(wú)菌水洗5次。將無(wú)菌的擬南芥種子播種在MS培養(yǎng)基上，4 ℃暗培養(yǎng)3 d，然后放在(22 ± 1)℃，16 h光照/8 h黑暗的人工氣候箱中培養(yǎng)。生長(zhǎng)14 d后，將擬南芥幼苗移栽到草炭土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1的混合基質(zhì)中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。

1.2.2 啟動(dòng)子序列的獲得與分析 以生長(zhǎng)健壯的藍(lán)莓植株上的嫩葉為試驗(yàn)材料，用植物基因組提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取DNA。采用改良后的FPNI-PCR法[22]擴(kuò)增藍(lán)莓MYB的啟動(dòng)子序列，以已發(fā)表的藍(lán)莓VcMYB(GenBank登錄號(hào)：KT869024)的5′端序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)3條特異引物M-265、M-110和M-48(表1)，結(jié)合9條隨機(jī)簡(jiǎn)并引物(FAD1-9)及特異引物S-1和S-2[22](表1)進(jìn)行3輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件參考Wang等[22]描述的設(shè)置。分別用引物FAD1-9、M-265和藍(lán)莓基因組DNA進(jìn)行第1輪擴(kuò)增；分別用引物S-1、M-110和上一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪擴(kuò)增；用引物S-2、M-48和第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第3輪擴(kuò)增。回收第3輪PCR擴(kuò)增所得的特異產(chǎn)物，TA克隆于pEASY-T1載體，送測(cè)序。利用DNAMAN分析所得結(jié)果。

表1 引物名稱與序列

所得序列經(jīng)分析確定為VcMYB5′端序列后，以基因組DNA為模板，引物MF-31和M-48進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃最終延伸5 min。得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收，TA克隆于pEASY-T1載體，送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確的菌液提取質(zhì)粒，-20 ℃保存。

啟動(dòng)子序列分析采用在線啟動(dòng)子預(yù)測(cè)工具PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。

1.2.3 載體構(gòu)建及擬南芥轉(zhuǎn)化 以含VcMYB啟動(dòng)子序列的pEASY-T1質(zhì)粒為模板，用引物M-1391-F和M-1391-R(表1)擴(kuò)增啟動(dòng)子。用Seamless Assembly Cloning Kit將獲得的PCR產(chǎn)物與pCAMBIA1391Z載體連接。VcMYB的啟動(dòng)子插入到pCAMBIA1391Z載體的GUS報(bào)告基因上游，與GUS融合，構(gòu)建植物表達(dá)載體VcMYBpro::GUS。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒通過(guò)液氮凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，然后用花序浸蘸法轉(zhuǎn)化擬南芥[23]。

1.2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得及其檢測(cè) 將收獲的擬南芥種子消毒后播種于含潮霉素(Hygromycin，25 mg/L)的MS固體培養(yǎng)基上，4 ℃避光培養(yǎng)3 d后，置于人工氣候箱培養(yǎng)(溫度(22±1)℃，光/暗周期為16 h/8 h，相對(duì)濕度65%)。14 d后初步認(rèn)定長(zhǎng)出真葉、生長(zhǎng)良好、根正常伸長(zhǎng)的苗為陽(yáng)性苗，并將其移栽到基質(zhì)中培養(yǎng)。生長(zhǎng)21 d后，取擬南芥植株少量葉片提取基因組DNA，以野生型擬南芥為陰性對(duì)照，以pCAMBIA1391Z-VcMYBpro質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行PCR檢測(cè)，引物為M13R和pBI-R。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2 × Master mix 5 μL，正反向引物各1 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。幼苗繼續(xù)培養(yǎng)至種子采收，再次進(jìn)行篩選，將得到的幼苗(T2)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.5 擬南芥處理和GUS組織化學(xué)染色 轉(zhuǎn)基因擬南芥萌發(fā)9 d后，分別進(jìn)行處理。試驗(yàn)以轉(zhuǎn)化pCAMBIA1391Z空載的擬南芥為陰性對(duì)照，以轉(zhuǎn)化pBI121(CaMV35S∷GUS)載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥為陽(yáng)性對(duì)照，各樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5株。轉(zhuǎn)基因苗處理過(guò)程為：第1組，未做處理的對(duì)照植株，于正常條件下培養(yǎng)3 d；第2組，將轉(zhuǎn)基因擬南芥轉(zhuǎn)移到含有10 μmol/L ABA的MS培養(yǎng)基上，于正常條件下培養(yǎng)3 d；第3組，將轉(zhuǎn)基因擬南芥苗置于4 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d；第4組，將轉(zhuǎn)基因擬南芥在LED燈光下(紅光∶藍(lán)光=3∶1，光強(qiáng)同正常條件)培養(yǎng)3 d，其他條件同對(duì)照組；第5組，將轉(zhuǎn)基因擬南芥在白光下持續(xù)光照培養(yǎng)3 d，其他條件同對(duì)照組。將不同處理的擬南芥幼苗進(jìn)行GUS染色[24]。放置在37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，染色后吸出GUS染液，加入70%乙醇脫色2～3次，使植物綠色完全褪去。用體視顯微鏡(LEICA M205FA)觀察，拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 VcMYB的啟動(dòng)子克隆

將3輪PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)，第1輪的PCR產(chǎn)物呈彌散形的非特異帶。將第2，3輪的PCR產(chǎn)物如圖1分別點(diǎn)入相鄰泳道。以引物FAD4和M-265擴(kuò)增得到的第1輪產(chǎn)物為模板再進(jìn)行第2輪PCR，以第2輪PCR產(chǎn)物為模板，用引物S-2、M-48進(jìn)行第3輪擴(kuò)增，其PCR擴(kuò)增效率比其他的擴(kuò)增效率高，得到如圖1泳道FAD4-3中的特異片段，約1 000 bp。回收該特異產(chǎn)物，經(jīng)序列分析確定其為VcMYB的5′端序列。用引物MF-31和M-48通過(guò)PCR擴(kuò)增得到768 bp啟動(dòng)子序列(圖2)，將其命名為VcMYBpro。

M.DNA Marker；2.第2輪擴(kuò)增條帶；3.第3輪擴(kuò)增條帶。M.DNA Marker；2.The second round FPNI-PCR products；3.The third round FPNI-PCR products.

圖2 藍(lán)莓VcMYB啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增

2.2 VcMYB啟動(dòng)子序列分析

利用預(yù)測(cè)工具對(duì)克隆得到的序列進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，該啟動(dòng)子除了含有TATA-box和CAAT-box等基本順式元件，還有低溫順式元件(LTR)、防御與脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、光響應(yīng)元件(GT1-motif)、蛋白結(jié)合位點(diǎn)(BoxⅢ)，以及茉莉酸甲酯響應(yīng)順式元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)等。

2.3 表達(dá)載體鑒定

重組載體VcMYBpro::GUS經(jīng)HindⅢ和EcoR Ⅰ 雙酶切，電泳結(jié)果如圖3所示，得到的片段大小與預(yù)期結(jié)果一致，目的片段約800 bp，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥鑒定

挑選生長(zhǎng)良好的抗性植物并對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖4，PCR擴(kuò)增出預(yù)期的特異片段，與陽(yáng)性對(duì)照大小一致，而野生型擬南芥未擴(kuò)增出任何片段，說(shuō)明獲得了轉(zhuǎn)VcMYB啟動(dòng)子的擬南芥。

表2 VcMYB啟動(dòng)子序列中的順式作用元件

M. DNA Marker; 1.VcMYBpro::GUS.

2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥脅迫處理及GUS組織化學(xué)染色

為了檢測(cè)VcMYBpro啟動(dòng)子在擬南芥植株脅迫條件下的表達(dá)特性，將脅迫處理后的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS染色觀察。轉(zhuǎn)基因擬南芥的組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果(圖5)顯示，正常條件和任何非生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)p1391Z空載體的擬南芥各組織均無(wú)著色，而轉(zhuǎn)pBI121載體的擬南芥都著色。含VcMYBpro載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片、葉柄和根均檢測(cè)到不同程度的著色，說(shuō)明其葉片、葉柄和根均有GUS活性。

1～8.轉(zhuǎn)基因擬南芥; 9.野生型擬南芥; 10.質(zhì)粒。1-8. Transgenic Arabidopsis thaliana plants;9.WT Arabidopsis thaliana plant; 10.VcMYBpro::GUS plasmid.

轉(zhuǎn)VcMYBpro啟動(dòng)子的擬南芥在非生物脅迫處理后，葉片和葉柄的藍(lán)色明顯加深。

3 討論與結(jié)論

近年來(lái)，在不同物種中鑒定出了調(diào)控原花青素生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，而關(guān)于PA響應(yīng)光條件的調(diào)控研究較少。葡萄果實(shí)中的VvMYBPA1和VvMYBPA2對(duì)光環(huán)境響應(yīng)[25]。從蘋果中克隆得到的PA合成調(diào)控相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子MdMYB9光條件的調(diào)控研究較少。葡萄果實(shí)中的VvMYBPA1和VvMYBPA2

A～E. 陰性對(duì)照, 轉(zhuǎn)pCAMBIA1391Z空載的擬南芥植株; F～J. 轉(zhuǎn)VcMYBpro::GUS載體的轉(zhuǎn)基因擬南芥苗; K～Q. 陽(yáng)性對(duì)照, 轉(zhuǎn)pBI121空載的轉(zhuǎn)基因擬南芥苗; 1. 對(duì)照組, A、F和K不做任何處理; 2～5分別為經(jīng)ABA、4 ℃低溫、LED光、持續(xù)光照處理3 d后的擬南芥苗。

A-E. Negative control, pCAMBIA1391Z empty vector control transgenicA.thaliana; F-J.VcMYBpro::GUS transgenicA.thaliana; K-Q. Positive control, pBI121(CaMV35S::GUS)transgenicA.thaliana;1.Control(A, F and K), without treatment; 2.ABA treatment; 3.4 ℃low-temperature treatment; 4. LED light; 5.Continuous light.

圖5 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色

Fig.5 Results of GUS histochemical staining for transgenicArabidopisisthaliana

對(duì)光環(huán)境響應(yīng)[25]。從蘋果中克隆得到的PA合成調(diào)控相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子MdMYB9和MdMYB11能被強(qiáng)光誘導(dǎo)[26]。大多數(shù)已鑒定的類黃酮生物合成的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子與bHLH和WD40重復(fù)蛋白形成MBW調(diào)控復(fù)合體，其中bHLH和WD40在光調(diào)控類黃酮生物合成過(guò)程中的作用不清楚。不僅在類黃酮結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子含有光調(diào)控單元(LRU)及其他光響應(yīng)元件，在R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子中也含有光響應(yīng)元件。比如荔枝LcMYB1的啟動(dòng)子中含有ACE、Box4、G-Box、GA-motif和GAG-motif等光響應(yīng)順式作用元件[27]。另外，葡萄R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子VvMYBF1的表達(dá)受到光的誘導(dǎo)，VvMYBF1控制黃酮醇合酶1基因(VvFLS1)的轉(zhuǎn)錄。分析VvMYBF1啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)其含有光調(diào)控單元(LRU)[28]。啟動(dòng)子中存在的LRU是基因光響應(yīng)的指示器，該單元內(nèi)含bZIP識(shí)別元件(ACE)[29]。迄今為止，從光感到通過(guò)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)果實(shí)中特定的類黃酮化合物合成的類黃酮生物合成的信號(hào)途徑尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)柿果實(shí)中的DkbZIP5識(shí)別PA合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子DkMyb4啟動(dòng)子區(qū)域的ABA響應(yīng)元件，作為ABA依賴的DkMyb4的直接調(diào)節(jié)因子。ABA信號(hào)可能通過(guò)DkZIP5激活DkMyb4的方式參與柿果實(shí)原花青素積累[13]。Eun等[30]獲得了蜜柑類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因啟動(dòng)子序列，并構(gòu)建啟動(dòng)子及其2個(gè)缺失序列與GUS報(bào)告基因的融合載體，轉(zhuǎn)化擬南芥。結(jié)果表明，含最短啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)基因擬南芥響應(yīng)低溫脅迫，GUS活性增強(qiáng)。本研究中克隆得到藍(lán)莓R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的啟動(dòng)子序列，該序列所含光響應(yīng)順式作用元件為GT1-motif(GGTTAA)、防御和脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)、低溫順式元件LTR(CCGAAA)。對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥用LED光照、持續(xù)光照、ABA、低溫處理，GUS表達(dá)活性明顯增強(qiáng)，啟動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥不同組織中的表達(dá)，說(shuō)明該啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)GUS基因，該基因受光、ABA和低溫的調(diào)控。該基因響應(yīng)光信號(hào)和外源激素ABA的方式，與其他轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，該啟動(dòng)子的功能及其在PA合成過(guò)程的調(diào)控等仍需進(jìn)一步深入地研究。

本試驗(yàn)在之前克隆藍(lán)莓原花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的基礎(chǔ)上，利用FPNI-PCR法分離得到了VcMYB上游768 bp的啟動(dòng)子序列，通過(guò)在線分析軟件分析，發(fā)現(xiàn)其除了存在基本元件CAAT-box和TATA-box等常見(jiàn)作用元件外，還有光響應(yīng)、低溫響應(yīng)、防御與脅迫響應(yīng)和MeJA響應(yīng)的作用元件。構(gòu)建了VcMYB啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的表達(dá)載體VcMYBpro::GUS，并轉(zhuǎn)化擬南芥。轉(zhuǎn)基因擬南芥組化染色結(jié)果顯示，VcMYBpro能驅(qū)動(dòng)GUS基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中表達(dá)，并且在低溫、ABA、LED光和持續(xù)光處理3 d后，轉(zhuǎn)基因植株葉片和葉柄的藍(lán)色明顯加深，說(shuō)明GUS表達(dá)活性增強(qiáng)，很可能是啟動(dòng)子上的作用元件對(duì)光、低溫和激素等非生物脅迫條件的響應(yīng)。后續(xù)研究中將進(jìn)行啟動(dòng)子系列缺失試驗(yàn)，通過(guò)不同的缺失啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化植物確定特定序列的功能，從而為深入研究藍(lán)莓原花青素代謝調(diào)控的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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Cloning and Functional Analysis ofVcMYBPromoter fromVacciniumcorymbosum

SHI Wenjun1，TENG Ke2，CHEN Lu1，HOU Zhixia1，SU Shuchai1

(1.Beijing Forestry University，Key Laboratory for Silviculture and Conservation of Ministry of Education，Research & Development Center of Blueberry，Beijing 100083，China；2.Turfgrass Research Institute，College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China)

In order to study the regulatory role ofVcMYBpromoter during the transcription,the promoter sequence of theVcMYBgene，regulated the proanthocyanidin synthesis genes from highbush blueberry，was cloned by the methods of FPNI-PCR.The 768 bp promoter sequence was analyzed by PLACE and Plant CARE.The analysis revealed that the promoter sequence contained CAAT-box，TATA-box and some cis-acting element such as light responsive element，cis-acting element involved in low-temperature，MeJA，defense and stress responsiveness.In order to study the function ofVcMYBpromoter，a promoter-reporter vector VcMYBpro::GUS was constructed，and introduced intoArabidopisisthalianabyAgrobacterium-mediated method.The result of GUS histochemical staining showed thatGUSreporter gene expression was driven byVcMYBpromoter in transgenic plants，and GUS enzyme activity of transgenic plants has increased after different treatments，including ABA(Abscisic acid)，4 ℃ low temperature，LED light and continuous light.These results indicated thatVcMYBpromoter was regulated by ABA，low temperature and light.

Vacciniumcorymbosum；VcMYB；Promoter；GUSgene；Proanthocyanidin

2017-02-02

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(YX2013-12)

史文君(1985-)，女，青海民和人，在讀博士，主要從事植物組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究。

侯智霞(1973-)，女，河北石家莊人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)花果發(fā)育及品質(zhì)調(diào)控研究。

Q78；S668.03

A

1000-7091(2017)02-0014-07

10.7668/hbnxb.2017.02.003