沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的克隆與表達(dá)分析

任美艷，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

沙冬青C2H2型鋅指蛋白基因AmZFP1的克隆與表達(dá)分析

任美艷，王志林，郭慧琴,薛 敏，殷玉梅，王茅雁

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

為了研究強(qiáng)抗逆植物沙冬青寒旱誘導(dǎo)表達(dá)基因AmZFP1(Zinc finger protein 1)的生理功能，通過(guò)轉(zhuǎn)錄譜分析，從中鑒定出一個(gè)受寒旱誘導(dǎo)的ZFP全長(zhǎng)cDNA序列并命名為AmZFP1。利用半定量RT-PCR方法對(duì)AmZFP1進(jìn)行了表達(dá)分析，結(jié)果表明，在室內(nèi)正常培養(yǎng)的沙冬青幼苗中該基因有較高表達(dá)量，在低溫或干燥處理2～48 h其表達(dá)量明顯上調(diào)，尤其以干燥處理上調(diào)速度更快且上調(diào)幅度略高；在野外自然生長(zhǎng)植株的嫩葉、花蕾和幼嫩果莢中AmZFP1均有較明顯的表達(dá)，而在嫩枝和根中檢測(cè)不到其轉(zhuǎn)錄本；在野外植株的嫩葉中，AmZFP1在嚴(yán)冬季節(jié)高表達(dá)，而在春、夏、秋溫?zé)峒竟?jié)表達(dá)水平低或很微弱。利用RT-PCR方法克隆到AmZFP1編碼區(qū)cDNA(816 bp)，推測(cè)其編碼蛋白含有2個(gè)典型C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域及一個(gè)核定位信號(hào)。此外成功將該cDNA片段構(gòu)建到植物表達(dá)載體p3300-353T上，為下一步深入開(kāi)展該基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。

沙冬青；鋅指蛋白；表達(dá)分析；基因克隆

植物在自然條件下生長(zhǎng)，經(jīng)常會(huì)遭受低溫和干旱等非生物逆境的危害，從而嚴(yán)重影響其生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量。為了適應(yīng)這些逆境，植物通常會(huì)改變自身的生理生化反應(yīng)和基因表達(dá)水平甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)，以形成各種抗逆機(jī)制來(lái)減輕逆境造成的傷害[1-2]。大量研究表明，植物對(duì)各種逆境的響應(yīng)均由相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄因子是這些信號(hào)途徑中的重要成員，它們通過(guò)調(diào)節(jié)許多抗逆功能基因甚至調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而在植物抵抗逆境的分子機(jī)制中扮演重要角色[3]。因此，克隆更多具有抗逆功能的轉(zhuǎn)錄因子基因一直是植物科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

鋅指蛋白(Zinc finger proteins，ZFPs)是植物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，其典型特征是具有由Zn2+和半胱氨酸(Cys/C)和/或組氨酸(His/H)殘基形成的一種穩(wěn)定的“手指狀”結(jié)構(gòu)，即鋅指，其中Zn2+是鋅指結(jié)構(gòu)的核心。這類轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)鋅指結(jié)構(gòu)與特定的DNA或RNA序列結(jié)合，或者通過(guò)與其他蛋白質(zhì)互作來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)過(guò)程[4-5]。ZFPs構(gòu)成一個(gè)數(shù)目龐大的蛋白家族，每個(gè)成員中所含的鋅指數(shù)目及其結(jié)構(gòu)不盡相同。根據(jù)鋅指中Cys和His的數(shù)目和位置不同，可將該家族分為C2H2、C2HC、C2C2、C2HCC2C2和C8等不同類型，其中以C2H2型數(shù)目最多且與植物抗逆性關(guān)系較為密切[6-7]。擬南芥SAT10/STZ是第一個(gè)被證明與非生物脅迫相關(guān)的C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。將STZ基因在鈣調(diào)磷酸酶缺失的酵母突變體中進(jìn)行超表達(dá)可消除其鹽敏感表型，這可能與該基因能夠上調(diào)突變體中耐鹽相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)[8]。后人們陸續(xù)證明來(lái)自其他植物的多個(gè)ZFP基因也具有類似的耐逆調(diào)節(jié)功能。例如，將大豆C2H2型ZFP基因SCOF-1在擬南芥和煙草中過(guò)量表達(dá)可以提高這些植物的耐冷性[9]。也有一些ZFPs對(duì)植物耐逆性起負(fù)調(diào)節(jié)作用，在其編碼蛋白的近C端常含有一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄抑制活性的EAR(ERF-associated amphiphilic repression)結(jié)構(gòu)域，可能通過(guò)抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性而發(fā)揮功能[10]。擬南芥的AZF1(Arabidopsiszinc-finger protein 1)和AZF2即屬于這類基因，它們可能通過(guò)下調(diào)滲透脅迫和ABA(Abscisic acid)信號(hào)途徑的多個(gè)靶基因的表達(dá)水平而降低耐逆性[11]?？梢?jiàn)ZFPs與植物耐逆性的關(guān)系較為復(fù)雜，克隆和鑒定更多的ZFPs對(duì)于深入了解該基因家族在植物抗逆性中的作用具有重要意義。

沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus，又稱蒙古沙冬青)是內(nèi)蒙古和寧夏等中國(guó)西北省區(qū)特有的唯一常綠闊葉灌木，也是我國(guó)重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危植物。其分布地屬于典型的寒旱荒漠區(qū)，因此，在進(jìn)化中形成了極強(qiáng)的耐寒耐旱等耐逆特性[12-13]。近年來(lái)，從該植物克隆和鑒定耐逆基因的報(bào)道迅速增加，其中屬于ZFP家族的基因有3個(gè)：AmZFPG可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐寒、耐旱和耐鹽性[14]；AmSTZF的轉(zhuǎn)錄受低溫和干旱脅迫誘導(dǎo)[15]；Am6f3尚未進(jìn)行功能驗(yàn)證[16]。筆者在前期利用Illumina技術(shù)對(duì)蒙古沙冬青進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析[17]，獲得一個(gè)受寒旱誘導(dǎo)表達(dá)的ZFP全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)基因注釋信息將其命名為AmZFP1。本研究分析了該基因在低溫和干燥處理及野外自然條件下的轉(zhuǎn)錄變化及其在不同器官的轉(zhuǎn)錄水平，并對(duì)其編碼區(qū)cDNA進(jìn)行了克隆和植物表達(dá)載體構(gòu)建，為后續(xù)深入研究其生理功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

將蒙古沙冬青種子用次氯酸鈉進(jìn)行表面消毒，用沙培法培養(yǎng)成苗。將28 d齡幼苗在低溫光照培養(yǎng)箱(BD-PRX-1000A)中進(jìn)行低溫處理(4 ℃，21 h；-2 ℃，8 h；-6 ℃，19 h)，分別在處理前(0 h)和處理后2，6，12，24，48 h將幼苗從土盆中取出，用預(yù)冷的自來(lái)水漂洗干凈后取樣。干燥處理是將幼苗從土盆中取出，用自來(lái)水漂洗干凈后放于吸水紙上，在25 ℃進(jìn)行自然干燥處理，取樣時(shí)間點(diǎn)同低溫處理。野外取樣在2014年7月-2015年5月進(jìn)行，取樣地位于呼和浩特市蒙草抗旱公司植物園區(qū)。用于不同月份表達(dá)分析的嫩葉于每個(gè)月上旬取樣。用于組織器官表達(dá)分析的花蕾于2016年4月15日取樣，嫩葉、嫩枝、根和未成熟果莢于同年6月15日取樣。將所有樣品用錫箔紙包裹后在液氮中速凍，保存于-76 ℃。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

將凍存樣品用改進(jìn)的TRIzol法提取總RNA[17]，然后用RNase-Free DNaseⅠ(TaKaRa公司)消化以去除殘存的基因組DNA。取3.0 μg總RNA用M-MLV(Promega公司)逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈。

1.3 半定量RT-PCR分析

以蒙古沙冬青Amelf3作為內(nèi)參基因，對(duì)不同樣品的cDNA模板量進(jìn)行均一化。用均一化的cDNA模板和AmZFP1表達(dá)引物(上游引物5′-CCTGACGGAGTTCTGGGAACC-3′；下游引物5′-TTCTGAACAGAGCTACATCGTTTCA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系中含10×PCR緩沖液1.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)1.2 μL，上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)，cDNA模板X(qián) μL，EasyTaq酶(5 U/μL)0.15 μL，用ddH2O補(bǔ)足至總體積15 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3 min；然后在94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s和72 ℃ 45 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 7 min，4 ℃保存。將擴(kuò)增產(chǎn)物在1.8%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 基因克隆與蛋白預(yù)測(cè)

以低溫處理樣品cDNA作模板，用AmZFP1編碼區(qū)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系中含10×PCR緩沖液2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 μL，上下游引物(上游5′-TTCTAGAAATTAATGGCTTTGGAGGCT-3′，加X(jué)baⅠ酶切點(diǎn)；下游5′-AGGATCCAAATTTTCTGAACAGAGC-3′，加BamHⅠ酶切點(diǎn))各0.5 μL(10 μmol/L)，cDNA模板1.0 μL，Primer starTaq酶(5 U/μL，TaKaRa公司)0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。擴(kuò)增程序同1.3，但其循環(huán)數(shù)為32。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶(天根公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒)并與pEASY-Blunt Cloning Vector(Trans公司)連接。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證(北京華大基因公司)。用DNAMAN軟件預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)；用Clustal X和GeneDoc程序進(jìn)行蛋白多序列比對(duì)；用SoftBerry在線預(yù)測(cè)AmZFP1蛋白亞細(xì)胞定位。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建

將AmZFP1克隆載體和植物表達(dá)載體p3300-35ST(pCAMBIA3300-35ST)轉(zhuǎn)化的E.coli單克隆搖菌，用堿裂解法提取其質(zhì)粒DNA。將質(zhì)粒DNA用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ(TaKaRa公司)分別進(jìn)行雙酶切、瓊脂糖凝膠電泳和目的片段膠回收，然后用T4DNA連接酶(TaKaRa公司)將回收產(chǎn)物進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，將單菌落進(jìn)行PCR檢測(cè)和質(zhì)粒酶切鑒定，獲得重組植物表達(dá)載體。

2 結(jié)果與分析

2.1 AmZFP1的表達(dá)分析

2.1.1AmZFP1的RNA-Seq表達(dá)譜 筆者在前期利用Illumina技術(shù)對(duì)蒙古沙冬青進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和表達(dá)譜分析[17]，獲得一個(gè)受低溫和干旱脅迫誘導(dǎo)的ZFP全長(zhǎng)cDNA序列，根據(jù)基因注釋信息將其命名為AmZFP1。RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)顯示，在正常生長(zhǎng)條件下(CK)AmZFP1在沙冬青幼苗中有少量表達(dá)，其RPKM(Reads per-kilobase per million reads)值為7.2；在低溫處理2，8，24 h后其表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，RPKM值分別為對(duì)照的3.8，8.7，11.4倍；在干燥處理3個(gè)時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量上調(diào)幅度更高，RPKM值分別為對(duì)照的9.9，23.2，13.6倍，其中以處理8 h后上調(diào)幅度最高(圖1)。這些數(shù)據(jù)表明AmZFP1參與對(duì)低溫和缺水或干旱脅迫的響應(yīng)，也為我們選擇該基因進(jìn)一步開(kāi)展其功能分析提供了依據(jù)。

CK.正常生長(zhǎng)條件；C2、C8、C24和 D2、D8、D24.

2.1.2 室內(nèi)脅迫條件下AmZFP1在沙冬青幼苗中的表達(dá)變化 為了進(jìn)一步了解AmZFP1響應(yīng)低溫和干燥缺水的表達(dá)變化趨勢(shì)，筆者利用半定量RT-PCR方法對(duì)AmZFP1在冷凍和自然干燥處理2～48 h的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測(cè)。試驗(yàn)中首先利用DNase對(duì)提取的各份總RNA樣品進(jìn)行了反復(fù)純化，以充分去除其中的基因組DNA殘留。將純化的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳、分光光度法檢測(cè)以及PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明其完整性和純度均較高，可開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。將總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈作模板，用內(nèi)參基因Amelf3特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)各份樣品的模板量進(jìn)行均一化。然后用均一化的模板和AmZFP1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，在處理前正常條件下(0 h)AmZFP1有較高水平的基礎(chǔ)表達(dá)；在低溫處理2，6，12，24 h后其表達(dá)量持續(xù)上調(diào)并在24 h達(dá)最高值，之后到處理48 h仍維持高水平表達(dá)；在干燥處理不同時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)量也明顯上調(diào)，但總體變化趨勢(shì)與低溫處理有所不同，即在處理2 h后其表達(dá)量即有明顯提高，在處理6 h后略有降低，在處理12 h后又明顯上調(diào)且達(dá)最高值并維持至24 h，至處理48 h后又可見(jiàn)有所回落(圖2)。這一結(jié)果與圖1所示RNA-Seq表達(dá)譜變化趨勢(shì)基本一致，表明低溫和干燥脫水均可誘導(dǎo)AmZFP1轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，但2種脅迫誘導(dǎo)該基因表達(dá)上調(diào)的時(shí)間進(jìn)程或變化模式存在差異。

圖2 沙冬青幼苗中AmZFP1在低溫和干燥處理不同時(shí)間點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄水平

2.1.3 野外自然條件下AmZFP1在不同器官和不同季節(jié)的表達(dá)模式 基因在野外自然條件下的表達(dá)變化更能反映其響應(yīng)內(nèi)外環(huán)境刺激的真實(shí)情況，為此首先利用半定量RT-PCR方法對(duì)AmZFP1在野外自然生長(zhǎng)沙冬青成株不同器官中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)。為了降低環(huán)境影響，除花蕾外(取樣稍早)其余樣品均于同一時(shí)間取樣。結(jié)果表明，AmZFP1在幼嫩果莢中表達(dá)量較高，在嫩葉中次之，在花蕾中也有少量表達(dá)，而在嫩枝和根中檢測(cè)不到其轉(zhuǎn)錄本(圖3)。由此推測(cè)AmZFP1可能與果莢的形成和葉片生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

R.根；T.嫩枝；L.嫩葉；F.花蕾；P.幼嫩果莢。R.Roots；T.Twigs；L.Young leaves；F.Flower buds；P.Young pods.

以野外生長(zhǎng)的沙冬青成株幼葉為材料，對(duì)不同季節(jié)AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了半定量RT-PCR分析，為了解該基因受溫度調(diào)節(jié)的表達(dá)變化模式。從圖4可見(jiàn)，在7，9，10月上旬，AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平持續(xù)較低且在不同月份之間無(wú)明顯差別，此期天氣由炎熱逐漸變得涼爽；在11，12和翌年1月上旬，AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平明顯提高且達(dá)到最高水平，此期沙冬青取樣地已進(jìn)入深秋隆冬季節(jié)，夜間溫度降至零下幾度甚至零下二十幾度；進(jìn)入3，5月份后，隨著溫度回升其轉(zhuǎn)錄水平又明顯降低甚至檢測(cè)不到其轉(zhuǎn)錄本。這一結(jié)果表明，AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平與環(huán)境溫度的變化密切相關(guān)，在深秋和隆冬時(shí)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平遠(yuǎn)高于其他季節(jié)，暗示其可能在沙冬青適應(yīng)秋冬季嚴(yán)寒中發(fā)揮重要功能。

圖4 AmZFP1在野外自然條件和不同月份的轉(zhuǎn)錄水平

2.2 AmZFP1編碼蛋白基本結(jié)構(gòu)特征分析

AmZFP1的完整編碼區(qū)含816 bp，5′UTR和3′UTR分別為494，311 bp。推測(cè)其編碼蛋白含271個(gè)氨基酸殘基，分子質(zhì)量為29.54 kDa，等電點(diǎn)為7.93。將AmZFP1蛋白與擬南芥(Arabidopsisthaliana)、鷹嘴豆(Cicerarietinum)、甜椒(Capsicumannuum)和大豆(Glycinemax)中已報(bào)道的6個(gè)C2H2型ZFPs進(jìn)行多序列比對(duì)(圖5)，其中ZFPs在NCBI中的接收號(hào)分別為：AtAZF2，GeneID:821495 ; AtZAT10,Gene ID: 839666; AtZAT6, GeneID:830313;CaZF, GeneID:101492310;CAZFP1,Gene ID:107867225;GmSCOF-1,GenBank:AAB39638.1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與鷹嘴豆CaZF氨基酸序列的一致性最高(Identities=158/287=55%)，而與擬南芥AtAZF2一致性最低(Identities=111/298=37%)；在AmZFP1的中間區(qū)段含有2個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)(CX2-4CX3PX5LX2HX3H)，其中有一段序列即QALGGH在這2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)中完全一致；在其第34-42位還有一個(gè)核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)KXKRSKR。此外，在其第53-62位有一個(gè)可能與蛋白質(zhì)互作相關(guān)的保守富含亮氨酸(L)的L-box；在其靠近C端區(qū)域有一個(gè)與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)的保守區(qū)域即DLN-box(又稱EAR-box)。這些結(jié)構(gòu)特征為C2H2型鋅指蛋白所共有，表明AmZFP1屬于該類型轉(zhuǎn)錄因子。利用SoftBerry軟件對(duì)該蛋白的亞細(xì)胞分布進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明其定位于細(xì)胞核的可能性最大(分值為8.8)，進(jìn)一步說(shuō)明其可能作為轉(zhuǎn)錄因子而起作用。

2.3 AmZFP1編碼區(qū)cDNA的克隆及其植物表達(dá)載體構(gòu)建

為了通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)鑒定AmZFP1的功能，以來(lái)源于沙冬青冬季嫩葉的cDNA作模板，對(duì)其編碼區(qū)cDNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到一條與預(yù)期大小相近的片段(圖6)。將該片段與克隆載體連接后轉(zhuǎn)化E.coli，然后進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)獲得了陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證后進(jìn)行植物表達(dá)載體構(gòu)建等后續(xù)試驗(yàn)。

植物表達(dá)載體的構(gòu)建用定向連接法。首先用限制酶XbaⅠ和BamHⅠ將測(cè)序驗(yàn)證的AmZFP1克隆載體和植物表達(dá)載體p3300-35ST空載體分別進(jìn)行雙酶切、電泳分離和目的片段的回收，然后通過(guò)連接反應(yīng)使AmZFP1編碼區(qū)cDNA片段定向插入到p3300載體的35S啟動(dòng)子之后并轉(zhuǎn)化E.coli。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)和質(zhì)粒酶切鑒定，均獲得預(yù)期大小的目的片段(圖7)，表明載體構(gòu)建成功，將其命名為p3300-35S-AmZFP1。接下來(lái)可開(kāi)展轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建及其表型鑒定等后續(xù)工作。

▲.植物鋅指結(jié)構(gòu)中所特有的序列?！?The special sequence of zinc finger motif in plant.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR產(chǎn)物。M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product.

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR產(chǎn)物；2.質(zhì)粒酶切；A.AmZFP1植物表達(dá)載體菌落PCR鑒定圖；B.重組表達(dá)載體p3300-35S-AmZFP1酶切鑒定圖。

M.Trans2K Plus DNA Marker；1.PCR product；2.Restriction of the plasmid DNA；A.Confirmation ofAmZFP1 plant expression vector by colony PCR；B.Identification of recombinant expression vector p3300-35S-AmZFP1 by restriction endonucleases.

圖7 AmZFP1植物表達(dá)載體菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定圖譜

Fig.7 Confirmation of AmZFP1 plant expression vector by colony PCR and restriction analysis

3 討論

據(jù)報(bào)道，目前與植物抗逆性關(guān)系較為密切的轉(zhuǎn)錄因子包括DREB(Dehydration-responsive element binding protein)、bZIP(basic domain leucine-zipper protein)、NAC(NAM、ATAF和CUC)、MYB(Myeloblastosis oncogene)、bHLH(basic helix-loop-helix)和ZFP等家族[18-19]。相對(duì)于DREB、bZIP和NAC等轉(zhuǎn)錄因子家族，迄今為止從ZFP家族中克隆的抗逆基因較少。植物中的ZFPs屬于一個(gè)大家族，又可以分成多種類型，其中以C2H2型數(shù)目最多(擬南芥基因組中其編碼基因有176個(gè))、功能也較復(fù)雜[5]。綜合已有資料，可知具有單鋅指結(jié)構(gòu)的C2H2型ZFPs可能與植物的生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系較為密切，如擬南芥的SUPERMAN和AtZFP1分別參與花和葉的發(fā)育[4]；而與環(huán)境脅迫相關(guān)的ZFPs通常均含有2個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，如矮牽牛ZPT2-3的編碼蛋白中含有2個(gè)典型的C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)，其表達(dá)受低溫、干旱和重金屬等逆境脅迫的誘導(dǎo)，將該基因在矮牽牛中超表達(dá)可提高對(duì)水分脅迫的耐性[20]。水稻OsZFP182和番茄SiCZFP1的編碼蛋白中也含有2個(gè)典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，二者的轉(zhuǎn)錄水平在低溫和干旱等非生物脅迫下均明顯上調(diào)，將這2個(gè)基因在擬南芥、煙草或水稻中超表達(dá)能夠增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株對(duì)高鹽或低溫的抵抗能力[21-22]。不同植物種類相比，目前已鑒定的抗逆相關(guān)ZFP基因多數(shù)克隆自擬南芥等草本植物，而從木本植物中克隆得到的很少。

蒙古沙冬青屬于豆科灌木類強(qiáng)抗逆植物，目前已克隆的ZFP基因有AmZFPG、AmSTZF和Am6f3，它們分別屬于GATA和AN1型[14-16]。其中AmZFPG與轉(zhuǎn)基因植物的耐寒、耐旱和耐鹽性密切相關(guān)[14]，AmSTZF受低溫和干旱脅迫的誘導(dǎo)[15]，而Am6f3與抗逆性的關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)蒙古沙冬青轉(zhuǎn)錄組中至少有156個(gè)C2H2型ZFP Unigene序列，其中多個(gè)序列根據(jù)RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)受低溫和干旱脅迫的顯著誘導(dǎo)。本研究從中選擇一個(gè)典型的C2H2型ZFP，即AmZFP1進(jìn)行了表達(dá)分析并克隆到其編碼區(qū)cDNA。序列分析表明在AmZFP1蛋白分子中除含有2個(gè)典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)外還含有一個(gè)核定位信號(hào)和其他保守序列。RNA-Seq表達(dá)譜數(shù)據(jù)和半定量RT-PCR分析結(jié)果均證明在沙冬青幼苗中AmZFP1的表達(dá)受低溫和干旱脅迫的誘導(dǎo)。而當(dāng)進(jìn)入春季氣溫回升后其轉(zhuǎn)錄水平又明顯下降甚至檢測(cè)不到其轉(zhuǎn)錄本。盡管光周期和土壤及大氣濕度等因素可能會(huì)影響野外條件下AmZFP1的轉(zhuǎn)錄水平，但在本研究檢測(cè)的8個(gè)月份中溫度應(yīng)該是變化最大的環(huán)境因素(采樣時(shí)當(dāng)?shù)貢円箿囟仍?月上旬至10月上旬為17/25 ℃～17/9 ℃，11月上旬至1月上旬為4/-2 ℃～-1/-10 ℃，3月上旬至5月上旬為9/3 ℃～23/19 ℃)。故此，綜合室內(nèi)外表達(dá)分析結(jié)果，筆者認(rèn)為AmZFP1參與對(duì)低溫和干旱脅迫的響應(yīng)，并可能在沙冬青抵抗逆境脅迫中起重要調(diào)節(jié)作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)該基因在沙冬青的花蕾(4月份采樣)和嫩葉及幼嫩果莢(6月份采樣)中均有表達(dá)，而在嫩根和嫩枝(6月份采樣)中幾乎檢測(cè)不到其轉(zhuǎn)錄本，暗示其也可能參與葉片、花和果莢的發(fā)育過(guò)程。本研究已克隆該基因并成功構(gòu)建其植物表達(dá)載體，為進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)基因等技術(shù)驗(yàn)證與鑒定其生理功能奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and Expression Analysis ofAmZFP1，A C2H2-type ZFP Gene fromAmmopiptanthusmongolicus

REN Meiyan，WANG Zhilin，GUO Huiqin,XUE Min，YIN Yumei，WANG Maoyan

(College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China)

To investigate the physiological function of a cold-and drought-inducible geneAmZFP1 (Zinc finger protein 1) fromAmmopiptanthusmongolicuswith strong stress tolerance,the expression analysis ofAmZFP1 was performed by using the semi-quantitative RT-PCR method.The results showed that in the seedlings cultivated in normal growth conditions，a relatively high expression level ofAmZFP1 was detected.After exposing the seedlings to low temperature or dehydration treatment between 2 to 48 hours，the expression level ofAmZFP1 increased markedly，and this up-regulation was more rapid and slightly higher during the dehydration treatment.In the young leaves，flower buds and immature pods of theA.mongolicusplants grown in the wild，the expression levels ofAmZFP1 were quite high，whereas in the twigs and roots，the transcripts ofAmZFP1 were not detected.In young leaves of the wild grownA.mongolicusplants，the expression level ofAmZFP1 was obviously high in the cold winter but was low or quite weak in the warm or hot seasons，including spring，summer and autumn.Moreover，the coding region cDNA ofAmZFP1 was cloned by RT-PCR，whose predicted polypeptide contains two typical C2H2 type zinc finger domains and one nuclear localization signal.The cDNA fragment was also successfully inserted into the plant expression vector p3300-35ST.This work laid a foundation for further functional analysis ofAmZFP1.

Ammopiptanthusmongloicus；ZFPs；Expression analysis；Gene cloning

2016-11-12

內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(2012ZD02)；內(nèi)蒙古自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2014MS0326)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960158)

任美艷(1990-)，女，山西朔州人，在讀博士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。

王茅雁(1961-),女，內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)研究。

Q78

A

1000-7091(2017)02-0008-06

10.7668/hbnxb.2017.02.002