日本七鰓鰻Lj-RGD3毒素肽的3種單RGD模體突變體的克隆表達及其抑制Lewis細(xì)胞活性研究

鄭媛媛， 肖 蓉， 王繼紅， 李慶偉

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116081)

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日本七鰓鰻Lj-RGD3毒素肽的3種單RGD模體突變體的克隆表達及其抑制Lewis細(xì)胞活性研究

鄭媛媛， 肖 蓉， 王繼紅， 李慶偉

(遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116081)

為了評價Lj-RGD3 3個不同位點RGD模體的存在是否對該蛋白功能具有必要性及影響程度,采用全序列合成的方法合成了3種基于Lj-RGD3的RGD缺失突變體基因，并成功對其進行了pET23b載體的構(gòu)建及重組蛋白的表達和純化.將這3種分別保留第1位、第2位、第3位RGD模體的重組蛋白各命名為rLj-113、rLj-114和rLj-115.比較了這3種重組蛋白對Lewis小鼠肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，并對其是否能引起Lewis肺癌細(xì)胞凋亡進行了測定.結(jié)果顯示，rLj-113、rLj-114和rLj-115對Lewis的增殖半抑制濃度IC50值分別為2.73，2.75，2.53 μmol/L，并且以劑量依賴的方式抑制Lewis小鼠肺癌細(xì)胞的增殖；突變體蛋白還能抑制以bFGF(basic fibroblast growth factor)為趨化劑的Lewis 小鼠肺癌細(xì)胞的遷移及侵襲.綜上可知，rLj-RGD3 蛋白的RGD模體的位置并不影響其在抗Lewis小鼠肺癌細(xì)胞的生物活性,而保留單RGD模體的突變體rLj-113、rLj-114、rLj-115仍然具有抑制Lewis小鼠肺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞凋亡的生物學(xué)活性.

日本七鰓鰻;RGD 毒素蛋白;突變體;細(xì)胞黏附;遷移及侵襲

整合素是一類存在于細(xì)胞表面的異二聚體跨膜蛋白，由1個α亞基和1個β亞基組成，結(jié)構(gòu)和種類的多樣性使其能夠識別多種配體，并影響相關(guān)的生物學(xué)功能.迄今已報道的整合素有24種，包括18種α亞基和8種β亞基[1].研究發(fā)現(xiàn)整合素在多種腫瘤細(xì)胞表面具有高表達的特點，整合素與ECM的結(jié)合在腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲中發(fā)揮重要的作用[2].拮抗整合素與其ECM表面配體的結(jié)合則會抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，甚至還能促進腫瘤細(xì)胞的凋亡[3].整合素配體拮抗劑類的抗腫瘤藥物也成為一個熱點的研究方向.

RGD(Arg-Gly-Asp)是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白特異性與細(xì)胞表面整合素識別并靶向結(jié)合的模體，因此RGD模體具有多方面的應(yīng)用.例如，借助RGD對腫瘤細(xì)胞表面高表達的整合素的高特異性和高親和性進行腫瘤的靶向識別，對化療藥物或是其他治療癌癥的藥物進行含RGD標(biāo)記或改造，使帶有RGD模體的藥物通過靶向識別腫瘤細(xì)胞，對腫瘤部位進行靶向藥物運輸[4],達到治療癌癥的目的.還有針對病灶部位進行影響成像[5]，達到直觀判斷病灶部位惡性程度的目的.除上述2種應(yīng)用外,還有利用外源RGD作為腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合的競爭性拮抗劑，從而對腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移具有直接的抑制作用.RGD毒素蛋白就是這樣一類外源性RGD物質(zhì).來源于蛇毒的去整合素(Disintegrin)為經(jīng)典的整合素拮抗劑類RGD毒素蛋白.此外，發(fā)現(xiàn)于水蛭的水蛭素，發(fā)現(xiàn)于蜱類、牛虻唾液腺分泌物的RGD蛋白都屬于這類RGD毒素蛋白[6-9].Lj-RGD3是本課題組于日本七鰓鰻口腔腺中發(fā)現(xiàn)的RGD類毒素蛋白，其具有3個RGD模體.前期的大量實驗數(shù)據(jù)已經(jīng)表明，Lj-RGD3在抗腫瘤細(xì)胞及抗血管新生方面具有強效功能，且呈劑量依賴方式.然而，Lj-RGD3具有3個RGD模體，這3個模體的存在對于Lj-RGD3蛋白的功能行使是否都是必不可少的引起了人們的興趣.因此，本文對Lj-RGD3進行了只保留1個不同位置RGD模體的突變體構(gòu)建及表達，并對這些突變體作用于Lewis小鼠肺癌細(xì)胞的抗腫瘤生物活性進行了比較.

1 材料與方法

1.1 材 料

小鼠肺癌細(xì)胞Lewis、克隆菌E.coliBL21為本實驗室保存；TAKARA質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG購于大連寶生物公司；Novagen組氨酸親和層析柱(His-bind column)；Gbico胎牛血清；PEPROTECHINC堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)；Beyotime細(xì)胞裂解液；BD公司的Annexin Ⅴ/PI細(xì)胞雙染試劑盒；Costar Transwell 板.

1.2 目的基因的合成和轉(zhuǎn)化

1.2.1 目的基因的設(shè)計與合成 根據(jù)野生型RGD3基因的氨基酸序列設(shè)計了3種突變體蛋白的氨基酸序列，通過全基因序列合成方法合成了突變基因，合成后的基因以NdeⅠ和Hind Ⅲ為酶切位點構(gòu)建至pET23b載體(大連寶生物公司合成并構(gòu)建).

1.2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 提取得到突變體陽性克隆質(zhì)粒pET23b-113、pET23b-114、pET23b-115,通過瓊脂糖電泳和基因測序鑒定為目的基因，將目的質(zhì)粒通過CaCl2法轉(zhuǎn)化至表達菌大腸桿菌E.coliBL21中.

1.3 蛋白的誘導(dǎo)表達及純化鑒定

轉(zhuǎn)化后的陽性菌于對數(shù)期加入IPTG后30 ℃過夜誘導(dǎo)表達，收集菌體后超聲破碎，離心收集上清，用Novagen公司的組氨酸親和層析柱純化，Tricine-SDS-PAGE電泳進行蛋白質(zhì)純度鑒定和分子量的比較[10].

1.4 突變體蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115之間的部分生物學(xué)活性的比較

1.4.1 MTT法[11]檢測比較對細(xì)胞增殖的影響 小鼠肺癌細(xì)胞Lewis接種在96孔板中，加入終質(zhì)量濃度為3 ng/L的bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖過夜后，加入梯度濃度的突變體蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115后，培養(yǎng)24 h加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后小心吸出上清液體，加入等量DMSO，490 nm下測光吸收值.1.4.2 細(xì)胞遷移實驗 Costar的Transwell板(8.0 μm)下室中加入完全培養(yǎng)基和bFGF(作為趨化劑)，上室中加入無血清培養(yǎng)液細(xì)胞懸液，加入不同突變體蛋白6 h后取下多聚碳酸鹽膜，用棉簽擦拭掉內(nèi)側(cè)未遷移的細(xì)胞，顯微鏡下觀察，每個樣品隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，對實驗結(jié)果進行科學(xué)統(tǒng)計[12].

1.4.3 細(xì)胞侵襲實驗 將人工基質(zhì)膜Marigel鋪在Transwell板上的多聚碳酸鹽膜上，模擬體內(nèi)的細(xì)胞基質(zhì)環(huán)境，其余與遷移實驗基本相同，以bFGF做趨化劑，加入突變體蛋白16 h后取下多聚碳酸鹽膜，棉簽擦拭掉內(nèi)側(cè)的Marigel和未侵襲的細(xì)胞，顯微鏡下觀察，每個樣品隨機選取5個視野拍照并計數(shù)，對實驗結(jié)果進行科學(xué)統(tǒng)計.

1.4.4 Hoechst33258染色[13]和Annexin Ⅴ/PI雙染[14]檢測對細(xì)胞凋亡影響 Lewis細(xì)胞接種于玻片上培養(yǎng)過夜，加入PBS和突變體蛋白刺激過夜，用碧云天的Hoechst33258細(xì)胞凋亡試劑盒對突變體蛋白處理后的Lewis細(xì)胞進行固定及染色，鏡下觀察并拍照.細(xì)胞經(jīng)刺激后，用不含EDTA的胰酶消化為懸浮細(xì)胞，懸浮后按照Annexin Ⅴ/PI試劑盒實驗方法，加入FITC-Annexin Ⅴ 10 μL和PI 5 μL染色，室溫下避光靜置15 min后,1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀測定結(jié)果.

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件，采用方差分析對結(jié)果進行統(tǒng)計分析.

2 結(jié) 果

2.1 對RGD3氨基酸序列的分析和突變體設(shè)計

本實驗室前期工作表明Lj-RGD3具有抗血小板、抗腫瘤功能，并包含3個RGD模體，野生型Lj-RGD3氨基酸序列如圖(圖1A)/.本次為研究3個不同位置上RGD模體的功能，將RGD3突變?yōu)?個突變體，分別是rLj-113、rLj-114和rLj-115，設(shè)計方案如圖(圖1B).

圖1 Lj-RGD3的氨基酸序列和突變體設(shè)計示意圖A.Lj-RGD3的氨基酸序列;B.原理圖設(shè)計用突變體.rLj-113保留第1個RGD模體.rLj-114保留第2個RGD模體.rLj-115保留最后1個RGD模體Fig.1 The deduced amino acid sequence of Lj-RGD3 toxin protein and mutants for schematic designA.The deduced amino acid sequences of Lj-RGD3;B.Mutants for schematic design.rLj-113 remained the first RGD motif.rLj-114 remained the second RGD motif.rLj-115 remained the last RGD motif

2.2 質(zhì)粒提取與轉(zhuǎn)化

使用TAKARA質(zhì)粒提取試劑盒從3種突變體陽性克隆菌E.coliJM109中提取出含有目的基因的質(zhì)粒pET23b-113、pET23b-114、pET-23b-115以及實驗室保存的E.coliBL21提取的質(zhì)粒pET-23b-RGD3，通過瓊脂糖凝膠電泳對提取質(zhì)粒的質(zhì)量進行鑒定(圖2).并通過測序鑒定確實為設(shè)計方案預(yù)期的氨基酸組成.

2.3 突變體蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115的表達和純化

將轉(zhuǎn)化成功的E.coliBL21培養(yǎng)至對數(shù)期后加入IPTG于30 ℃誘導(dǎo)過夜，超聲破碎菌體離心后收集上清，用組氨酸親和層析柱純化目的蛋白.結(jié)果顯示，rLj-113、rLj-114和rLj-115在此條件下成功可溶性表達，Tricine-SDS-PAGE電泳鑒定如圖(圖2B)，純度在95%以上，分子量在14 kDa左右.由于3種蛋白是堿性蛋白，其電泳位置要比實際位置偏大.

圖2 突變質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳和親和層析得到的突變體蛋白的小分子SDS電泳A.瓊脂糖凝膠電泳:1.Marker；2～4質(zhì)粒pET23b-113、pET23b-114 和 pET23b-115;B.rLj-113、rLj-114 和 rLj-115分子量相同:1.Marker；2～4是純化的rLj-113、rLj-114和 rLj-115蛋白Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the mutations and Tricine SDS-PAGE of the mutant proteins purified by affinity chromatography A．Agarose gel electrophoresis of the mutations:1 lane was the Maker;2～4 lanes were pET23b-113,pET23b-114 and pET23b-115;B.The molecular weight of rLj-113,rLj-114 and rLj-115 is same:1 lane was Marker;2～4 lanes were the purified rLj-113,rLj-114 and rLj-115 protein

2.4 突變體蛋白rLj-113、rLj-114、rLj-115對小鼠肺癌細(xì)胞Lewis生物活性影響的比較

2.4.1 突變體蛋白對bFGF誘導(dǎo)的小鼠肺癌細(xì)胞Lewis增殖的影響 MTT 法測定結(jié)果顯示，rLj-113、rLj-114和rLj-115對Lewis細(xì)胞增殖均有抑制作用(圖3).半劑量效應(yīng)量(half maximal inhibitory concentration，IC50) 分別為2.73，2.75，2.53 μmol/L．

圖3 用不同濃度突變體蛋白處理24 h對Lewis細(xì)胞生長的抑制(MTT測定)A.對rLj-113的IC50值是2.73 μmol/L;B.對rLj-114的IC50值是2.75 μmol/L；C.對rLj-115的IC50值是2.53 μmol/LFig.3 Growth inhibition in Lewis cell lines treated with mutants at the indicated concentrations for 24 h (MTT assay)A.The IC50 of rLj-113 for inhibition is 2.73 μmol/L;B.The IC50 of rLj-114 for inhibition is 2.75 μmol/L;C.The IC50 of rLj-115 for inhibition is 2.53 μmol/L

2.4.2 突變體蛋白對bFGF 誘導(dǎo)的小鼠肺癌細(xì)胞Lewis遷移和侵襲的抑制作用 惡性腫瘤具有擴散的特點，依賴于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲.作為抑制腫瘤效果的一個指標(biāo)，本文比較了rLj-113、rLj-114和rLj-115對Lewis細(xì)胞遷移和浸潤的影響.結(jié)果顯示，rLj-113、rLj-114和rLj-115對Lewis細(xì)胞的遷移和侵襲都具有抑制作用，而且相同作用濃度時抑制效果相似(圖4).

圖4 Transwell法測定Lewis細(xì)胞的遷移和侵襲A.顯微鏡下遷移和侵襲的細(xì)胞(×200);B.rLj-113、rLj-114和rLj-115對Lewis細(xì)胞遷移和侵襲的抑制率Fig.4 Migration and invasion of Lewis cells measured by Transwell assayA.Migrated and invaded cells were imaged by microscopy(×200)； B.The inhibition rate of rLj-113, rLj-114 and rLj-115 on Lewis cells migration and invasion

2.4.3 突變體蛋白對bFGF 誘導(dǎo)的小鼠肺癌細(xì)胞Lewis凋亡的影響 正常細(xì)胞經(jīng)Hoechst33258染色液染色后，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈彌散均勻黯淡熒光，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見致密濃染的顆粒狀熒光.結(jié)果顯示，突變體rLj-113、rLj-114、rLj-115在作用濃度為2.5 μmol/L能有效誘導(dǎo)Lewis細(xì)胞發(fā)生凋亡(圖5A).細(xì)胞發(fā)生凋亡時，磷脂酰絲氨酸(PS)由正常細(xì)胞狀態(tài)下的細(xì)胞內(nèi)測翻轉(zhuǎn)到膜外側(cè). 熒光標(biāo)記的Annexin Ⅴ特異性結(jié)合PS. PI標(biāo)記凋亡晚期凋亡細(xì)胞. 實驗結(jié)果顯示，rLj-113、rLj-114、rLj-115能夠有效誘導(dǎo)Lewis發(fā)生凋亡(圖5B).

圖5 比較突變體蛋白對Lewis細(xì)胞凋亡的影響A.PBS和突變體蛋白(rLj-113、rLj-114、rLj-115)處理后的細(xì)胞用Hoechst33258染色;B.Annexin Ⅴ/PI染色凋亡分析Fig.5 Comparison on the effect of the apoptosis for the mutant proteins in LewisA.Lewis cells were treated with PBS or the mutant proteins (rLj-113、rLj-114、rLj-115) and stained with Hoechst33258;B.The Annexin Ⅴ/PI staining apoptosis assay

3 討 論

野生型Lj-RGD3是本實驗室從日本七鰓鰻口腔腺中提取RNA，經(jīng)cDNA反轉(zhuǎn)錄得到的具有3個RGD模體的毒素蛋白.競爭結(jié)合細(xì)胞表面整合素，封閉整合素相關(guān)信號通路，進而影響整合素相關(guān)的腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并且對正常的細(xì)胞影響效果不明顯.本文為了研究其3個不同位置的RGD的區(qū)別，對3種突變體的設(shè)計和一些生物學(xué)活性進行了比較.實驗表明，3種突變體對小鼠肺癌細(xì)胞Lewis增殖抑制的IC50分別為2.73，2.75,2.53 μmol/L，作用效果不相上下.而其在半抑制濃度左右時，對小鼠肺癌細(xì)胞Lewis的遷移和侵襲的抑制率均在30%～40%左右，稍有不同，但無明顯差異.通過Hoechst染色觀察和Annexin V/PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測可以證明，3種突變體rLj-113、rLj-114和rLj-115均能促進這種腫瘤細(xì)胞的凋亡.由此可見，不同位置的RGD模體的變化并不影響其抑制腫瘤細(xì)胞的作用.

[1] BEER A J,SCHWAIGER M.Imaging of integrin alphavbeta3 expression[J].Cancer Metastasis Reviews,2008,27(4):631-644.

[2] WONG R P,NG P,DEDHAR S,et al.The role of integrin-linked kinase in melanoma cell migration,invasion,and tumor growth[J].Molecular Cancer Therapeutics,2007,6(6):1692-1700.

[3] 孫錄，戴維群，王華,等.含RGD的細(xì)胞黏附肽抑制人胃癌細(xì)胞BGC823增殖及誘導(dǎo)其凋亡作用[J].中國實驗診斷學(xué),2011,15(3):392-396.

[4] JIANG J,YANG S J,WANG J C，et al.Sequential treatment of drug-resistant tumors with RGD-modified liposomes containing siRNA or doxorubicin[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics,2010,76(2):170-178.

[5] 朱小妹，王曉梅，馮剛，等.量子點耦聯(lián)RGD 用于喉癌血管的靶向活體成像[J].中國激光,2014,41(5):97-102.

[6] KINI R M,CHOW G.Exogenous inhibitors of platelet aggregation from animal sources[J].Thromb Haemost,2001,85(1):179-181.

[7] KREZEL A M,ULMER J S,WAGNER G,et al.Recombinant decorin:dynamics of the RGD recognition site[J].Protein Sci,2000,9(8):1428-1438.

[8] MAZUR P,HENZEL W J,SEYMOUR J L,et al.Ornatins:potent glycoprotein IIb-IIIa antagonists and platelet aggregation inhibitors from the leech Placobdella ornata[J].Eur J Biochem,1991,202(3):1079-1082.

[9] MANS B J,LOUW A I,NEITZ A W,et al.A platelet aggregation inhibitor from the soft tick ornithodoros savignyi,presents the RGD integrin recognition motif on the Kunitz-BPTI fold[J].J Biol Chem,2002,277(24):21371-21378.

[10] HAIDER S R,REID H J,SHARP B L.Tricine-SDS-PAGE[J].Methods in Molecular Biology,2012,869:81-91.

[11] WANG Y J,ZHOU S M,XU G,et al.Interference of phenylethanoid glycosides from cistanche tubulosa with the MTT assay[J].Molecules,2015,20(5):8060-8071.

[12] ZHAO S,YUAN L,WANG J,et al.A novel and facile approach to imaging nanoparticles transport across Transwell filter grown cell monolayer in real-time and in situ under confocal laser scanning microscopy[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin,2012,35(3):335-345.

[13] FU H,WANG Q S,LUO Q,et al.Simvastatin inhibits apoptosis of endothelial cells induced by sepsis through upregulating the expression of Bcl-2 and downregulating Bax[J].World Journal of Emergency Medicine,2014,5(4):291-297.

[14] LIU Y,WANG W,FANG B,et al.Anti-tumor effect of germacrone on human hepatoma cell lines through inducing G2M cell cycle arrest and promoting apoptosis[J].European Journal of Pharmacology,2013,698(1/2/3):95-102.

Molecular cloning and activity of recombinant proteins,rLj-113,rLj-114 and rLj-115,mutants contain only one RGD motif respectively transformed from Lj-RGD3 protein

ZHENGYuanyuan,XIAORong,WangJihong,LIQingwei

(School of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China)

To explore whether the three RGD motifs on different positions have different effects on these functions,we got three mutant genes named rLj-113,rLj-114,rLj-115 through the method of full sequence synthesis based on the RGD3 genes.We successfully expressed and purified the mutant proteins.We comparied biological activity about integrins associated proliferation,migration,invasion of these three recombinant proteins on Lewis lung cancer cells.The results showed that the three mutants inhibited the proliferation of the Lewis cells in a dose-dependent manner,the IC50are 2.73，2.75，2.53 μmol/L.They can also inhibit integrin associated proliferation,migration and invasion on Lewis cells in a dose-dependent manner.In conclusion,the position of the RGD motif on Lj-RGD3 did not affect the biological activity on anti-tumor cells.rLj-113,rLj-114,rLj-115 mutants remained only one RGD motif had the activity on inhibiting Lewis cells.

Lamprey Janpanica;RGD toxin protein;mutant;cell adhesion;migration and invasion

2016-07-14

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2014AA093502);國家自然科學(xué)基金資助項目(30471975);全國海洋公益資助項目(201305016-5)

鄭媛媛(1990-),女，遼寧盤錦人，遼寧師范大學(xué)博士研究生; 李慶偉(1955-),男，遼寧大連人，遼寧師范大學(xué)教授，博士,博士生導(dǎo)師.

1000-1735(2017)02-0239-06

10.11679/lsxblk2017020239

Q789

A