提高拉針儀提取卵細(xì)胞成功率的方法優(yōu)化

秦超，李丹

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)裝備部，四川 瀘州 646000

提高拉針儀提取卵細(xì)胞成功率的方法優(yōu)化

秦超，李丹

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)裝備部，四川 瀘州 646000

目的 本文目的在于探討一種提高拉針儀在試管嬰兒過程中提取卵細(xì)胞的成功率的方法。方法 通過調(diào)整拉針儀的各種參數(shù)，提高拉針儀制作取卵管的質(zhì)量，并用直徑恒定的銅芯來控制取卵管的孔徑大小。結(jié)果 通過各組不同的對(duì)比試驗(yàn)，得到了拉針儀最佳參數(shù)（熱度=70℃；主磁力=60 N；副磁力=40 N），然后加入直徑大小為0.375 mm的銅芯，就可以得到末端孔徑可控的取卵管。結(jié)論 通過優(yōu)化，該研究以巴氏管為原料，利用拉絲儀與銅芯，可以提高制作巴斯管的成功率，節(jié)約大量的注射時(shí)間，值得臨床應(yīng)用和推廣。

試管嬰兒；卵細(xì)胞；取卵管；拉針儀；毛細(xì)管；銅芯

引言

試管嬰兒技術(shù)現(xiàn)在發(fā)展已經(jīng)非常成熟[1-2]，在做試管嬰兒過程中，卵細(xì)胞能否成功提取是最終做試管嬰兒能否成功的關(guān)鍵[3-5]，現(xiàn)在各醫(yī)院在提取卵細(xì)胞時(shí)都采用巴氏管在酒精燈上加熱到一定溫度，再憑個(gè)人經(jīng)驗(yàn)人工拉絲，這樣拉出來的試管管徑大小和質(zhì)量不可控，使得卵細(xì)胞的提取成功率非常低。日本成茂公司生產(chǎn)的拉針儀PN-31主要是用來拉毛細(xì)管，其工作方式是用金屬箔加熱玻璃試管，通過調(diào)整拉針儀上的主磁力和副磁力控制拉力[6-8]，這樣加熱快，使得拉玻璃試管沒有時(shí)間滯后性，但這種方式拉出來的試管容易斷裂拉不出絲，并且拉出來的毛細(xì)管直徑大小不可控，本論文對(duì)防止拉出毛細(xì)管的斷裂，以及毛細(xì)管直

徑大小的控制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

拉針儀PN-31一臺(tái)，長玻璃巴氏吸管（GP230）一盒，直徑為0.375 mm的銅絲，眼科彎鑷，酒精燈，體視顯微鏡。

1.1 拉針儀PN-31的研究

拉針儀PN-31主要是用于制作顯微注射的細(xì)長的微玻璃管，其工作的基本原理是采用電磁拉力的方法將玻璃毛細(xì)管拉細(xì)，電磁力可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。加熱器采用鉑金片，將金屬鉑片做成“Ω”型，將需要加熱部分的試管放在“Ω”型的中部加熱，這樣加熱快，所以可以立即開始拉，沒有時(shí)間滯后。電磁拉力和加熱溫度數(shù)值顯示在顯示器上，不同的拉力和溫度值可以得到不一樣的細(xì)針。

1.2 加熱熱度對(duì)拉針效果的影響

將副磁力示數(shù)固定為30 N，主磁力示數(shù)固定為50 N，調(diào)整加熱溫度示數(shù)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，見表1。

表1 熱度對(duì)拉針結(jié)果的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)加熱溫度表顯示為30℃或50℃時(shí)巴氏管均不能被拉動(dòng)，可以看出此時(shí)還未達(dá)到巴氏管的軟化溫度，所以此時(shí)巴氏管不能被拉動(dòng)；當(dāng)加熱溫度表顯示為90℃時(shí)，此時(shí)巴氏管加熱部分已全部熔化；綜合表格的信息設(shè)定加熱溫度表顯示為70℃。

1.3 磁力大小對(duì)拉針效果的影響

固定加熱溫度表的示數(shù)為70℃，調(diào)節(jié)主磁力和副磁力表盤的數(shù)，下表是記錄調(diào)整的一組數(shù)據(jù)和得到的結(jié)果，見表2。

期末考試試題包括6種題型，分別為填空題、名詞解釋、選擇題、簡答題、論述題和綜合題，每種題型的平均得分情況見圖2．由圖2可見，14-6班6種題型的平均得分均高于14-5班，但2個(gè)班6種題型平均得分的差異均未達(dá)到顯著性差異（χ2=0.267，P=0.606＞0.05；χ2=0.153，P=0.696＞0.05；χ2=0.005，P=0.943＞0.05；χ2=0.739，P=0.390＞0.05；χ2=0.000，P=1.000＞0.05；χ2=0.582，P=0.446＞0.05）．由此表明，期末考試題型設(shè)置沒有出現(xiàn)班級(jí)之間的偏好性．

表2 磁力大小對(duì)拉針效果的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)表副磁力示數(shù)為40 N，主磁力示數(shù)為60 N時(shí)巴氏管拉出的效果最好，將此條件下得到的巴氏管在體視顯微鏡下觀察，孔徑大小并不符合要求，下述實(shí)驗(yàn)用直徑恒定的銅絲來控制毛細(xì)管的孔徑大小。

1.4 毛細(xì)管孔徑大小控制的探討

由于在上述過程中拉出來的毛細(xì)管孔徑大小不可控，使得最終得到的產(chǎn)品達(dá)不到用于取卵細(xì)胞的要求，卵細(xì)胞的直徑大約為0.2 mm左右，最后得到的巴氏管末端直徑應(yīng)略大于0.2 mm但也不至于過大，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定，巴氏管末端最好直徑為0.375 mm，這樣就滿足能提取到單個(gè)卵細(xì)胞，并且不破壞卵細(xì)胞的要求。主要操作步驟如下:

（1）用鑷子將直徑為0.375 mm的銅絲放在酒精燈上面燒，將其表面防氧化的鍍層去掉，然后將得到的銅絲取一段，長度要大于巴氏管的長度。

（2）將銅絲從巴氏管的一端穿入再從另一端傳出，在巴氏管的兩端將銅絲彎折。

（3）然后將拉針儀調(diào)整到最佳參數(shù)（溫度=70℃；主磁力=60 N；副磁力=40 N）。

（4）將帶銅芯的巴氏管穿過“Ω”型加熱鉑片的中央并固定試管的兩端。

（5）按下拉針儀的啟動(dòng)鍵，一段時(shí)間后巴氏管被拉動(dòng)。（6）用鑷子迅速取下試管并將銅芯取出。

經(jīng)過上述步驟最終可以得到末端孔徑大小一致的巴氏管，再經(jīng)過打磨就可以得到最終的產(chǎn)品，這樣操作產(chǎn)品的成功率可以得到極大提升。

2 結(jié)果

試管嬰兒的制作過程包括許多關(guān)鍵步驟，每一步中又有許多因素影響試管嬰兒的成敗，卵細(xì)胞的提取又是這些核心步驟中非常關(guān)鍵的一步，除了卵細(xì)胞的數(shù)量，質(zhì)量，提取技術(shù)的好壞等影響因素外，提取卵細(xì)胞所用的巴氏管針尖內(nèi)外徑的大小、針尖的長度、彎度、錐度及光滑度等也直接影響卵細(xì)胞提取的成敗[9-10]。

取卵針在體視顯微鏡下觀察如果尖端不均一，有缺口，不整齊等可以再切斷幾微米獲得整齊端口后在酒精燈上重新拋光后再用。

我們研究應(yīng)用的PN-31水平拉針儀拉制取卵管。拉針儀的主要參數(shù)有主磁力、副磁力、熱度，這3個(gè)參數(shù)對(duì)拉針效果是相互影響的，在實(shí)驗(yàn)中我們是調(diào)節(jié)一個(gè)參數(shù)其它固定來找到一個(gè)最合適的參數(shù)并把它固定下來。經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)：

（1）主磁力是決定針尖的長度的重要參數(shù)，主磁力越高得到的針尖越短，為了實(shí)驗(yàn)中能拉出絲且最后不被拉斷，我們?cè)O(shè)定主磁力的數(shù)值為60 N。

（2）副磁力是決定針尖口徑大小的主要參數(shù)，副磁力越高針尖口徑越大，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們?cè)O(shè)定副磁力的數(shù)值為40 N。

（3）熱度是是決定針尖的錐度、長度及針尖內(nèi)徑大小的重要因素，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)我們?cè)O(shè)定為70℃。

（4）還有一個(gè)重要參數(shù)是主磁力和副磁力的轉(zhuǎn)換點(diǎn)這個(gè)參數(shù)較大巴氏管會(huì)被均勻拉伸，針尖長，經(jīng)過一系列實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)換點(diǎn)我們?cè)O(shè)定為7 mm。

（5）拉針儀加熱金屬鉑片的形狀也是影響最終結(jié)果的因素，金屬鉑片的表面要光滑且要成弧形，最好成“Ω”型，圈的下部要盡量靠攏但不能互相接觸，將巴氏管從“Ω”型的中部穿過，不能使金屬鉑片和巴氏管有任何接觸，這樣有利于均勻加熱，否則拉出的針尖容易彎翹。

3 討論

提取卵細(xì)胞的巴斯管的制作屬于顯微操作技術(shù)，現(xiàn)如今發(fā)展的非常迅猛，而顯微操作針又是試管嬰兒的制備[11]、動(dòng)物克隆[12]和嵌合體動(dòng)物的制備[13]等必備的工具之一。它包括有注射前后收集，轉(zhuǎn)移及輸卵管移植受精卵用的移卵針和注射時(shí)用的持卵針，注射針。每種針針尖內(nèi)外徑的大小，針尖的長度、錐度、彎度、光滑度等直接影響顯微注射的成敗。制作好的顯微操作針需要時(shí)間和一定的耐心，反復(fù)試驗(yàn)，找到最適合的方法和各種針的參數(shù)。這樣做可以提高巴斯管成功率節(jié)約大量的注射時(shí)間，值得臨床應(yīng)用和推廣。

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，我們可以得到一系列末端很長的巴氏管，但末端的孔徑大小和形狀不可控，取卵管末端的孔徑大小和形狀直接影響取卵成功的關(guān)鍵，末端孔徑太小會(huì)使卵細(xì)胞受到擠壓而損壞或者不能提取卵細(xì)胞；孔徑太大卵細(xì)胞很容易被吸入取卵管內(nèi)但很容易變形而導(dǎo)致卵細(xì)胞死亡。為了控制末端孔徑的大小，可將直徑大小為0.375 mm的銅絲作為銅芯加入巴氏管一起在拉針儀上操作，這樣就能得到一系列末端孔徑統(tǒng)一的取卵管，這樣比直接人工在酒精燈憑經(jīng)驗(yàn)制作成功率要高且質(zhì)量更好。

卵細(xì)胞的提取過程中包括許多關(guān)鍵步驟，每一步中又有許多因素會(huì)影響到巴斯管的成敗，顯微操作是這些步驟中非常核心的一部分，除了卵細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量、注射技術(shù)的好壞等因素外，顯微操作針針尖內(nèi)外徑的大小，針尖的長度、錐度、彎度、光滑度等也都直接影響顯微注射的成敗。移卵針如尖端不整齊、不均一、呈鋸齒狀、有缺口等可再切斷幾微米獲得整齊斷端并重新拋光。

拉針儀的鉑金圈非常重要，其表面要光滑呈圓弧形，形狀如“Ω”形，圈的下部要盡量的靠近但不可相互接觸，圈的上部如圓弧形，如有任何不規(guī)則都將會(huì)影響拉制的針的形狀。拉制好針取出時(shí)要特別小心，用眼科彎鑷輕輕取下，不可碰觸鉑金圈，否則很容易改變它的形狀，導(dǎo)致后續(xù)工作無法進(jìn)行。毛細(xì)管要固定在拉針儀的鉑金圈中央，不可有任何一邊靠在鉑金圈上，這樣才可以使毛細(xì)管均勻受熱，拉制出高質(zhì)量的針，否則，注射針的尖端容易彎翹、旋轉(zhuǎn)，影響使用。

4 結(jié)論

試管嬰兒是一項(xiàng)步驟多，涉及環(huán)節(jié)和技術(shù)非常復(fù)雜的高難度，要求高精度的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，使得影響其成敗的因素非常多，在臨床試驗(yàn)中稍有不慎就會(huì)導(dǎo)致失敗。如卵細(xì)胞的好壞[14-18]，培養(yǎng)液的成分[19-22]，顯微操作的速度，胚胎移植的熟練程度等都是影響最終成敗的關(guān)鍵因素，所以為了最終的成功應(yīng)該將各個(gè)方面的影響因素降為最低。在這整個(gè)過程中取卵管是最基本的操作工具，取卵管的好壞將直接影響試管嬰兒的成功率，但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)我國以及國外的臨床醫(yī)生所用的取卵管都是憑個(gè)人經(jīng)驗(yàn)制作的，這樣導(dǎo)致制取的成功率非常低，本實(shí)驗(yàn)總結(jié)了一些拉制取卵管的經(jīng)驗(yàn)，并探索了用拉針儀來改進(jìn)制作取卵管的方法，希望對(duì)同行有所幫助。

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本文編輯 袁雋玲

Optimization of Method of Using Micro-pipette Puller to Extract Egg cells

QIN Chao, LI Dan
Department of Medical Equipment, The Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou Sichuan 646000, China

Objective The purpose of this study was to improve the success rate of producing capillary tube when micropipette puller was used as production tools. Methods The quality of capillary tube was improved by adjusting the parameters of micropipette puller. And the diameter of capillary tube was controlled by the constant diameter copper core. Results Through a lot of contrast tests, optimization parameters such as heater level (70℃), magnet main (60 N) and deputy magnet (40 N) of micropipette puller were found. The copper core that was with a diameter size of 0.375 mm to produce capillary tube was suitable. Conclusion The method of this study could improve the success rate of producing capillary tube. And the injection time was saved when using this method. So it is worthy of popularizing this method in clinical application.

test-tube baby; egg cell; micropipette puller; pull needle instrument; capillary tube; copper core

R321

B

10.3969/j.issn.1674-1633.2017.06.024

1674-1633(2017)06-0093-03

2016-12-31

2017-01-08

作者郵箱：455593372@qq.com