知柏地黃丸中知母對陽離子牛血清白蛋白大鼠膜性腎炎的作用研究

明繼陽，丁彥，李洋，王知斌，匡海學，王秋紅

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

知柏地黃丸中知母對陽離子牛血清白蛋白大鼠膜性腎炎的作用研究

明繼陽1，丁彥1，李洋1，王知斌1，匡海學1，王秋紅2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006)

目的：探討知柏地黃丸中知母對大鼠膜性腎炎慢性腎炎的治療作用。方法：將大鼠分成空白組、模型組、知柏地黃丸組和無知母知柏地黃丸組，采用陽離子牛血清白蛋白大鼠膜性腎炎模型，觀察大鼠尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇生化指標，及腎臟病理切片HE染色后的病理形態(tài)。結果：知柏地黃丸組在給藥4周后，大鼠尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、總膽固醇及組織形態(tài)的改善效果與模型組比有極顯著性差異，并優(yōu)于無知母知柏地黃丸組。結論：知柏地黃丸中知母有治療大鼠慢性膜性腎炎的作用，方劑中配伍知母，提高治療效果，知母發(fā)揮其滋陰補腎作用。

知母；知柏地黃丸；大鼠腎炎模型

知柏地黃丸出自《醫(yī)宗金鑒》，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮、知母和黃柏等組成。方中熟地黃為君藥，滋陰補腎，益精填髓。知母甘，寒，清虛熱、滋腎陰；黃柏苦，寒，瀉虛火、堅真陰，配合熟地黃以滋陰降火，諸藥配合，具有滋陰降火之功效，主要用于陰虛火旺、潮熱盜汗、口干咽痛、耳鳴遺精、小便短赤等證[1-3]。本文以知母為研究對象，采用陽離子牛血清白蛋白的大鼠腎炎模型[4-7]，來研究知母在知柏地黃丸中的滋陰補腎作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質量180～220 g，動物合格證號：SCXK(遼)2015-0001，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。

1.2 實驗儀器

CITOGLAS粘附載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)；722E型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；LXJ-Ⅱ離心沉淀機(上海醫(yī)用分析儀器廠)；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鄭州長城科工貿有限公司)；moticam3000美國顯微攝影成像系統(tǒng)(美國motic公司)。

1.3 實驗試劑

尿蛋白定量試劑盒、血肌酐測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、甘油三酯測定試劑盒生產于南京建成生物工程研究所，陽離子化牛血清白蛋白(C-BSA)制備，參照改良Border法[4]進行制備。

1.4 藥材及藥品制備

知母產地為河北省，黃柏產地為四川省，山茱萸產地為山西省，熟地產地為河南省，澤瀉產地為遼寧省，山藥產地為河北省，茯苓產地為云南省，牡丹皮產地為安徽省，于齊齊哈爾仙鶴中藥飲片加工廠加工。

1.4.1 知母浸膏的制備

取2.5 kg知母飲片，用10倍量的蒸餾水浸泡12 h，然后用14倍量的水提取，沸騰2 h后，再用12倍量的水提取第2次，沸騰2 h后合并提取液并濃縮干燥。

1.4.2 無知母知柏地黃浸膏的制備

按照知柏地黃丸組方配比，取黃柏、山茱萸、熟地黃、澤瀉、山藥、茯苓和牡丹皮，根據藥典按照2∶4∶8∶3∶4∶3∶3的比例制備。用10倍量的水浸泡4 h。用14倍量的水提取2 h，共提取2次，合并提取液并濃縮干燥。

1.5 實驗方法

將大鼠隨機分成4組，即空白組、模型組、知柏地黃丸組、無知母知柏地黃丸組(以下簡稱無知母組)，每組6只。

1.5.1 模型制備

預免疫：大鼠適應實驗環(huán)境1周，進行預免疫，尿蛋白呈陰性的大鼠作為實驗大鼠，預留6只作空白對照，其余大鼠進行預免疫。除空白對照組外，給予大鼠腹股溝及腋窩等處進行多點皮下注射，每只大鼠給予0.3 mL乳化物且每點注射不超過0.05 mL(將80 mgC-BSA溶于15 mLPBS中，與等量弗氏不完全佐劑混合)。正常對照組則以PBS與弗氏不完全佐劑混合進行預免疫[5-9]。

正式免疫：預免疫1周后，每次將C-BSA溶于1 mLPBS中進行尾靜脈注射，首次C-BSA尾靜脈注射量為3.5 mg/只，隔日1次，每周3次，6周內緩慢將注射量遞增至5 mg/只，正常對照組注射同體積的PBS[10-13]。

1.5.2 給藥與分組

根據人與大鼠給藥劑量折算比給藥，實驗于造模第4周開始灌胃給藥，每日1次。空白組與模型組為對照組，灌胃生理鹽水。無知母知柏地黃丸組灌胃無知母知柏地黃丸浸膏，知柏地黃丸組灌胃知柏地黃丸浸膏溶液。

1.5.3 指標考察

①24 h尿蛋白定量

分別于實驗前、正式免疫后第3周末、4周末、5周末、6周末、7周末及8周末將大鼠放入金屬代謝籠中，測24 h尿蛋白含量。

②血生化檢查

實驗結束后，麻醉大鼠取血，全自動生化分析儀測定總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、血清肌酐(SCR)等3項生化指標。

③HE染色

實驗結束后，采用體內灌注法取材作光鏡檢查。石蠟包埋，常規(guī)切片，將切片放入二甲苯中脫蠟，再放入乙醇中梯度水化，用蘇木素和伊紅依次染色，在光學顯微鏡下觀察。

2 實驗結果

2.1 尿蛋白定量

實驗對第0、3、4、5、6、7、8周測24 h尿蛋白定量值，結果見表1。

表1 24 h尿蛋白定量比較

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01；與無知母組比較,△P<0.05，△△P<0.01

模型組與空白組比較，有顯著性差異，造模成功。無知母知柏地黃丸與模型組比較，第6～8周有顯著性差異(P<0.05)。知柏地黃丸與模型組比較，第4～5周與其有顯著性差異(P<0.05)，在第6～8周與起比較，與其有極顯著性差異(P<0.01)。與無知母知柏地黃丸比較，第4周與其有顯著性差異(P<0.05)，第5～8周與其有極顯著性差異(P<0.01)。

2.2 大生化指標測定

表2 對大鼠血清中肌酐、甘油三酯、總膽固醇水平的影響

注：與模型組比較,*P<0.05，**P<0.01；與無知母組比較,△P<0.05，△△P<0.01

見表2。與空白組比較，模型組各項指標與其有顯著性差異(P<0.05)。知柏地黃丸組，與模型組比較，血清中肌酐、甘油三酯和總膽固醇有極顯著性差異(P<0.01)；與無知母知柏地黃丸對比，甘油三酯與其有極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 HE染色檢查結果

空白組腎小球形態(tài)正常，模型組腎小球體積增大，球囊間隙增寬，腎小球毛細血管呈開放狀態(tài)，管壁明顯增厚，染色增強(嗜酸性增強)，毛細血管球呈分葉狀。知柏地黃丸組治療后，與模型組相比，腎小球毛細血管開放明顯減少，甚至與空白組開放程度相似，腎小球囊腔減小，毛細血管球未分葉，染色程度弱，其HE染色檢查結果優(yōu)于無知母知柏地黃丸組，最接近空白組；見圖1。

圖1 光鏡下腎臟組織病理變化A.空白組;B.模型組;C.知柏地黃丸組;D.無知母知柏地黃丸組

3 討論

3.1 大鼠膜性腎炎模型的選擇與建立

本實驗采用C-BSA制備大鼠膜性腎炎模型，是基于循環(huán)抗體與外來植入性抗原結合形成原位性免疫復合物的理論建立的[6]。免疫復合物沉積于上皮使腎小球基底膜中，使濾過孔徑變大，使腎小球基底膜(GBM)陰離子屏障破壞。模型建立后尿蛋白、血肌酐及血尿素氮顯著升高，腎組織病理檢查腎小球呈典型膜性改變，毛細血管壁增厚，在上皮有嗜復紅物沉積，與膜性腎炎改變一致。

3.2 對膜性腎炎大鼠24 h尿蛋白的影響

膜性腎炎是典型的免疫復合物型慢性腎炎，大量的蛋白尿是其主要的病理特征。蛋白尿大量的原因，一方面是免疫復合物沉積改變腎小球基底膜中分子的結構，增大濾過孔徑，使較大分子的蛋白物質可以自由通過；另一方面是電荷性質的改變，破壞GBM陰離子屏障，使帶負電荷的白蛋白能夠自由通過而產生蛋白尿。

尿蛋白的反復持續(xù)存在對腎臟組織以及全身有很大的影響。尿蛋白能直接損傷腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞；促使成纖維細胞及腎小管上皮細胞合成分泌細胞外基質(ECM)，并抑制ECM的降解，產生大量的ECM沉積，導致腎間質纖維化，引起腎小球硬化并使腎小球受損，致使腎功能低下，因此改善蛋白尿癥狀具有重要意義。

本實驗結果表明，知柏地黃丸組與模型組比從4周起效，6～8周有顯著性效果，而無知母知柏地黃丸組在6周開始起效，知柏地黃丸組在第4周開始治療效果優(yōu)于無知母知柏地黃丸組。說明知母在腎炎的治療中發(fā)揮作用，可能有減少免疫復合物沉積的作用，減輕腎小球基底膜結構損傷和電荷性質的改變，減少尿蛋白的排出，恢復腎小球濾過功能，減少其尿蛋白的排出。

3.3 對膜性腎炎大鼠血清中SCR、TG、T-CHO的影響

血清中CRE的含量是反映腎小球濾過功能的指標，其血清濃度由機體對氮的分解代謝能力和腎臟的排泄能力決定，血清肌酐不受腎臟以外因素影響，是判斷腎小球的濾過功能的關鍵指標。

在腎病綜合征病理中，嚴重的蛋白尿可導致低蛋白血癥，低蛋白血癥可降低血漿滲透壓，刺激肝細胞合成脂蛋白升高，引起脂質代謝紊亂，進而產生高脂血癥[14]。高脂血癥是腎臟病變發(fā)展過程中的重要病理變化之一。其可直接損傷腎血管，誘導多種細胞因子及組織內酶的表達異常并引起腎小球硬化及腎小管間質的纖維化[15]。

本實驗結果顯示，模型組的SCR、T-CHO、TG明顯高于正常對照組，藥物治療后，知柏地黃丸組SCR、T-CHO、TG與模型組相比有顯著差異(P<0.05)，并且優(yōu)于無知母知柏地黃丸，提示知母可能有改善腎小球濾過率、促進損傷組織的修復的作用，同時改善膜性腎炎的高血脂癥狀，可能與其降低尿蛋白排出有關。

綜上所述，通過觀察知柏地黃丸給藥前后影響大鼠膜性腎炎的生理指標和病理形態(tài)，發(fā)現(xiàn)知柏地黃丸治療效果佳，說明知母有改善腎功能和腎小球濾過率、促進損傷組織的修復的作用，治療大鼠膜性腎炎的作用，進一步證實中醫(yī)理論中知柏地黃丸取知母滋陰補腎之作用，為中醫(yī)辨病論治合理用藥提供科學依據。

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The effect ofRhizomaAnemarrhenaein Zhibai Dihuang Pill on Membranous Nephritis Rats Caused by cBSA

MING Ji-yang1, DING Yan1, LI Yang1, WANG Zhi-bin1, KUANG Hai-xue1, WANG Qiu-hong2

(1.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China;2.GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Objective:To study the treatment effect ofRhizomaAnemarrhenae(Zhi Mu) in Zhibai Dihuang pill on membranous nephritis. Methods:The rats were divided into the blank group, the model group, the observation group(Zhibai Dihuang pill) and the control group(Zhibai Dihuang pill without Zhi Mu). The membranous nephritis model was established with cationic bovine serum album(cBSA). The biomedical indicators, such as urinary protein, serum creatinine, total cholesterol(TC), and triglyceride(TG) were tested, and histomorphology of the kidney was observed in rats. Results: The observation group could significantly improve the levels of biomedical indicators and glomerular vessel status compared to the model group after four-week treatment, which was better than the control group. Conclusion: Zhi Mu has good effects on membranous nephritis rats in Zhibai Dihuang pill, with its action of nourishing yin and tonifying the kidney.

RhizomaAnemarrhenae; Zhibai Dihuang pill; Nephritis rat model

2016-09-04

2016-12-28

國家自然科學基金面上項目(81274103)

明繼陽(1982-)，女，博士研究生,主要從事中藥化學專業(yè)復方研究工作。

*通訊作者：王秋紅(1969-)，女，教授，博士生導師，主要從事中藥炮制研究，中藥藥效物質基礎研究和新藥開發(fā)工作。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0048-04