參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

周美馨,李淑菊,張琪*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

周美馨1,李淑菊2,張琪2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036)

目的：觀察參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)高糖培養(yǎng)下腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA表達(dá)的影響，探討參地補(bǔ)腎膠囊抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。方法：以高糖培養(yǎng)的人腎小管上皮細(xì)胞作為研究對(duì)象，采用血清藥理學(xué)研究方法和Real-time PCR檢測(cè)技術(shù)，觀察空白對(duì)照組、高糖模型組、參地補(bǔ)腎膠囊組和貝那普利組的TGF-β1、α-SMA、E-cadherin mRNA的表達(dá)，采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果：高糖培養(yǎng)下的人腎小管上皮細(xì)胞TGF-β1、α-SMA mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組比較明顯增加(P<0.05)，E-cadherin mRNA的表達(dá)與空白對(duì)照組比較明顯降低(P<0.05)；參地補(bǔ)腎膠囊組能夠下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞對(duì)TGF-β1、α-SMA mRNA的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin mRNA的表達(dá)，與高糖模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：本研究表明參地補(bǔ)腎膠囊通過下調(diào)高糖刺激的人腎小管上皮細(xì)胞對(duì)TGF-β1、α-SMA mRNA的異常表達(dá)，上調(diào)E-cadherin mRNA的異常表達(dá)，從而發(fā)揮抗腎間質(zhì)纖維化的作用。

參地補(bǔ)腎膠囊；腎間質(zhì)纖維化；腎小管上皮細(xì)胞；TGF-β1；α-SMA；E-cadherin

腎間質(zhì)纖維化(Renal interstitial fibrosis,RIF)是由于各種原發(fā)或繼發(fā)性慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)(如原發(fā)性腎小球疾病、高血壓腎損害、糖尿病腎病、自身免疫性疾病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡腎病、急慢性間質(zhì)性腎炎等)持續(xù)發(fā)展，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎間質(zhì)處過度沉積，將腎臟正常組織結(jié)構(gòu)取代，腎小管發(fā)生變形、萎縮，以致周圍腎小管毛細(xì)血管數(shù)銳減，造成腎臟功能發(fā)生不可逆的受損。RIF是終末期腎臟疾病(End stage renal disease,ESRD)的共同病理表現(xiàn)，其主要病理特征是腎小管發(fā)生萎縮、腎間質(zhì)處成纖維細(xì)胞過度增生以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度聚集[1]。RIF和腎小球硬化均會(huì)發(fā)生腎功不全而造成CKD，但就其減退的相關(guān)性而言，RIF與腎功能減退呈顯著正相關(guān)；能夠準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)判斷腎功能惡化的程度，決定CKD的預(yù)后[2-5]。參地補(bǔ)腎膠囊臨床上應(yīng)用于治療慢性腎功能衰竭，能夠改善患者腎功能，調(diào)節(jié)脂代謝，提高腎小球?yàn)V過率，具有一定的抗腎纖維化的作用[6]。本研究采用血清藥理學(xué)研究方法，以高糖誘導(dǎo)的人近端腎小管上皮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，選取TGF-β1、α-SMA、E-cadherin為研究對(duì)象，探討參地補(bǔ)腎膠囊改善腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

HK-2正常人近端腎小管上皮細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康雄性SD大鼠40只，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體質(zhì)量(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(黑)2016005。

1.3 試劑及藥品

參地補(bǔ)腎膠囊(黑龍江省中醫(yī)研究院生產(chǎn)，產(chǎn)品批號(hào)：黑藥制字Z20100039。由人參、茯苓、白術(shù)、熟地黃、草果仁、大黃、紅花、赤芍、丹參等藥物組成)；鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：H200130513)；K-SFM、胎牛血清及二甲基亞砜(上海中科院)；D-葡萄糖(Sigma公司)；胰蛋白酶及EDTA(Haigene公司)；TRIzol試劑(博仕公司)；PCR定量試劑盒(博仕公司)；PCR引物合成(博仕公司)；TGF-β1 antibody、Anti-E Cadherin antibody和α-SMA Muscle antibody(Sigma公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(金斯瑞公司)。

1.4 儀器設(shè)備

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo);離心機(jī)(上海安亭，TGL-16GB);水平電泳槽(北京六一，DYCP-31BN);凝膠成像系統(tǒng)(UVP，UVP-200);PCR儀(MJ，PTC200);熒光定量PCR儀(MJ，Mini-Opticon2);超低溫冰箱(中科美菱，DW-HL328)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備含藥血清

將40只雄性大鼠，稱體質(zhì)量編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成4組(每組10只)，即空白對(duì)照組、高糖模型組、參地補(bǔ)腎膠囊組、貝那普利組。根據(jù)“人和動(dòng)物的體表面積等效劑量比值表”分別給予參地補(bǔ)腎膠囊組按0.324 g/(kg·d)灌胃給藥，貝那普利組給予0.9 mg/(kg·d)灌胃給藥，正常組給予等體積生理鹽水，各組每日等體積灌胃2次，自由飲水，連續(xù)給藥7 d。于末次給藥2 h后，行眼頸總動(dòng)脈取血，將血液迅速加入離心管混勻，于室溫靜置1 h，再置于4℃環(huán)境中靜置1 h，置于離心機(jī)，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，分離出血清，將同組的不同大鼠血清混勻，置于56℃的水浴鍋中，行補(bǔ)體滅活30 min，在無(wú)菌超凈臺(tái)上使用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌2次，無(wú)菌過濾后進(jìn)行分裝入管，置于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

用含10%胎牛血清的K-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)HK-2細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%～80%時(shí)，以每孔板1×104mL密度轉(zhuǎn)種至細(xì)胞培養(yǎng)板上，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25%胰酶消化，培養(yǎng)7 d以1∶2比例進(jìn)行傳代。以無(wú)血清培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)細(xì)胞24 h，使細(xì)胞同步化，分成4組：(1)空白對(duì)照組：10%正常大鼠血清+K-SFM培養(yǎng)液；(2)高糖模型組：10%正常大鼠血清+25mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培養(yǎng)液；(3)參地補(bǔ)腎膠囊組：10%參地補(bǔ)腎膠囊大鼠含藥血清+25 mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培養(yǎng)液；(4)貝那普利組：10%貝那普利大鼠含藥血清+25 mmol/L D-葡萄糖+K-SFM培養(yǎng)液。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)

2.3.1 RNA的提取

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)、貼壁融合達(dá)到80%的HK-2細(xì)胞，進(jìn)行同步化24 h后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入1 mL Trizol溶液，靜置5 min，加入200 μL三氯甲烷，反復(fù)顛倒混勻15 s，再于室溫靜置5 min。4℃下，應(yīng)用13 000 rpm轉(zhuǎn)速的離心機(jī)進(jìn)行10 min的離心。輕輕吸取上清液，加入約600 μL等量的異丙醇，混勻充分后再放置-20℃冰箱靜置10 min。于4℃下，應(yīng)用13 000 rpm轉(zhuǎn)速的離心機(jī)進(jìn)行10 min的離心，棄去上清，加入已經(jīng)預(yù)冷的75%的乙醇1 mL。4℃，13 000 rpm離心5 min，棄上清；室溫干燥沉淀5～15 min，加入30 μL RNase Free H2O進(jìn)行吹打，加入2×RNA Loading Buffer，65℃變性10 min。

2.3.2 cDNA的合成

置于冰上的PCR管中加入配置好的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(RNA 1 μg，20×Oligo dT(25)&Random Primer 1 μL，5×Golden RT MasterMix 4 μL，Rnase Free H2O 14 μL，總體積達(dá)20 μL)，瞬時(shí)離心，去除基因組DNA。將反應(yīng)液放置在PCR儀器上，在30℃反應(yīng)變性5 min→55℃反應(yīng)30 min合成cDNA→85℃ 10 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，使模板cDNA變性→將所得的變性cDNA從PCR儀中取出，并按照一定的比例稀釋，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成

應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)與合成。TGF-β1引物序列為：5′-CGACTCGCCAGAGTGGTTAT-3′,5′-AGTGAACCCGTTGATGTCC-3′，長(zhǎng)度151 bp。α-SMA引物序列為：5′-GAAGAGTTACGAGTTGCCTGATG-3′,5′-ATGATGCTGTTGTAGGTGGTTTC-3′，長(zhǎng)度138 bp。E-cadherin mRNA引物序列為：5′-GCTGGACCGAGAGAGTTTCC-3′,5′-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′，長(zhǎng)度155 bp。Human actin引物序列為：5′-TCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG-3′,5′-GTTGAAGGTAGTTTCGTGGA。

2.3.4 定量PCR測(cè)定TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的表達(dá)

以β-actin為內(nèi)參基因測(cè)定TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA表達(dá)。在PCR擴(kuò)增體系中，依次加入5×Golden HS SYBR Green qPCR Mix 4 μL、PCR Forward Primer(10 μM) 0.8 μL、PCR Reverse Primer(10 μM) 0.8 μL、cDNA 2 μL、dd H2O 12.4 μL。將上述液體混勻，加入PCR反應(yīng)管中，置于Bio-Rad Min-Opticon2定量PCR儀內(nèi)，設(shè)置好反應(yīng)條件后進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃進(jìn)行預(yù)變性15 min，95℃變性45 s→95℃退火10 s→60℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)。最后一次，72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，采集熒光信號(hào)，以β-actin基因表達(dá)量作為內(nèi)參，采用Quantity one軟件對(duì)電泳條帶進(jìn)行分析，進(jìn)行半定量矯正(各基因條帶吸光度值與β-actin的吸光度值之比)，數(shù)據(jù)分析采用CT法，計(jì)算出每份樣品中TGF-β1、α-SMA和E-cadherin mRNA的相對(duì)表達(dá)含量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理統(tǒng)計(jì)分析，所有實(shí)驗(yàn)計(jì)量資料均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，方差齊者，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)HK-2細(xì)胞TGF-β1 mRNA的影響

模型組細(xì)胞TGF-β1 mRNA的表達(dá)明顯高于正常組，與空白組比較，有顯著性差異(P<0.05)；參地補(bǔ)腎膠囊組、貝那普利組的TGF-β1 mRNA表達(dá)低于模型組，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。說明高糖模型組細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)量增加，而參地補(bǔ)腎膠囊能夠顯著下調(diào)TGF-β1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果見表1。

表1 各組培養(yǎng)基對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞TGF-β1 mRNA表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；與高糖模型組比較,△P<0.05

3.2 參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA的影響

模型組細(xì)胞α-SMA mRNA的表達(dá)明顯高于正常組，與空白組比較，有顯著性差異(P<0.05)；參地補(bǔ)腎膠囊組、貝那普利組的α-SMA mRNA表達(dá)低于模型組，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。說明高糖模型組細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)量增加，而參地補(bǔ)腎膠囊能夠顯著下調(diào)α-SMA mRNA的表達(dá)。結(jié)果見表2。

3.3 參地補(bǔ)腎膠囊對(duì)HK-2細(xì)胞E-cadherin mRNA的影響

模型組細(xì)胞E-cadherin mRNA的表達(dá)明顯低于正常組，與空白組比較，有顯著性差異(P<0.05)；參地補(bǔ)腎膠囊組、貝那普利組的E-cadherin mRNA表達(dá)高于模型組，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)。說明高糖模型組細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)量減少，而參地補(bǔ)腎膠囊能夠顯著上調(diào)E-cadherin mRNA的表達(dá)。結(jié)果見表3。

表2 各組培養(yǎng)基對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞α-SMA mRNA表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；與高糖模型組比較,△P<0.05

表3 各組培養(yǎng)基對(duì)高糖誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞E-cadherin mRNA表達(dá)的影響

注：與空白對(duì)照組比較,*P<0.05；與高糖模型組比較,△P<0.05

4 討論

中醫(yī)古籍并無(wú)“腎間質(zhì)纖維化”這一病名，根據(jù)其病因病機(jī)以及相關(guān)的臨床表現(xiàn)，將其歸屬于“關(guān)格”“腰痛”“虛勞”“腎風(fēng)”等范疇。RIF演變過程，與肺、脾、腎三臟虛損及三焦氣化失職有關(guān)，尤其脾腎虛損是貫穿整個(gè)RIF病機(jī)。脾腎二臟，一為人體先天之本，一為人體后天之本，二者相互滋生為用，筑成人體生命之基石。腎為藏精瀉濁之本體，若腎氣虛損，則其開闔失司，使?jié)嵝半y以下瀉；脾為水谷運(yùn)化之總司，若脾氣受損，則健運(yùn)失司，水濕內(nèi)停。脾腎虛衰則脾失固澀，腎失封藏，升清降濁功能紊亂，致水濕內(nèi)蘊(yùn)，日久濕濁蘊(yùn)積，血行不暢，阻遏氣機(jī)，瘀血與濕濁毒邪膠著，滯于腎臟，發(fā)為此病。參地補(bǔ)腎膠囊具有補(bǔ)益脾腎，清化濕濁，解毒活血之功，方中熟地黃、大黃、人參為君藥；桃仁、丹參、赤芍、草果仁為臣藥；淫羊藿、菟絲子、茯苓、紅花、白術(shù)為佐藥；半夏、黃連、甘草為使藥。

腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病持續(xù)進(jìn)展的共同結(jié)果，其形成機(jī)制復(fù)雜，是由多種細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等諸多因素共同參與作用的結(jié)果，與成纖維細(xì)胞的增生密切相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解減少，合成增多，使間質(zhì)成分纖維化變性[7-8]。腎間質(zhì)纖維化形成的主要機(jī)制是由于腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生的轉(zhuǎn)分化，形成肌成纖維細(xì)胞。在眾多的細(xì)胞因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)被認(rèn)為和組織纖維化發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)積聚的重要生長(zhǎng)因子。研究發(fā)現(xiàn)，在不同程度的RIF中，TGF-β1均呈現(xiàn)高度表達(dá)，在RIF的形成中全程參與、啟動(dòng)并調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，被認(rèn)為是治療RIF最為理想的作用靶點(diǎn)[9-12]。而α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)作為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，是腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)合成的主要來(lái)源[13]。腎間質(zhì)纖維化發(fā)生過程中，各類生長(zhǎng)因子、炎性因子等多種活性物質(zhì)誘導(dǎo)腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞以及腎小管上皮細(xì)胞等發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化為α-SMA陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)過度積聚，在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用[14]。各種腎臟疾病中α-SMA的高表達(dá)，是纖維細(xì)胞受損激活和表型轉(zhuǎn)化的標(biāo)志，同時(shí)作為陽(yáng)性的肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，是預(yù)測(cè)腎纖維化進(jìn)展的理想指標(biāo)[15-16]。上皮鈣黏蛋白(Epithelial-cadherin，E-cadherin)廣泛分布于上皮組織中，在正常的腎小管上皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)[17]。當(dāng)腎臟損傷時(shí)，E-cadherin的含量減少，使細(xì)胞間的黏附功能受損，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，從而啟動(dòng)EMT過程，使上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，繼而發(fā)展為腎間質(zhì)纖維化。

本研究顯示，高糖模型組的TGF-β1、α-SMA mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增加，E-cadherin mRNA的表達(dá)較空白對(duì)照組明顯減少，說明高糖成功的誘導(dǎo)了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生；而參地補(bǔ)腎膠囊能夠抑制α-SMA mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)E-cadherin mRNA的表達(dá)，說明參地補(bǔ)腎膠囊能夠拮抗高糖誘導(dǎo)的EMT，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷；參地補(bǔ)腎膠囊還能夠抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)，說明參地補(bǔ)腎膠囊通過下調(diào)TGF-β1 mRNA的表達(dá)，抑制轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，從而阻抑腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。

綜上所述，參地補(bǔ)腎膠囊通過降低TGF-β1、α-SMA mRNA的表達(dá)，增強(qiáng)E-cadherin mRNA的表達(dá)，減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷，抑制轉(zhuǎn)分化的發(fā)生，減輕腎間質(zhì)纖維化，從而起到保護(hù)腎臟的作用。

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2016-10-08

2016-12-05

周美馨(1986-)，女，博士研究生，主要研究方向：中醫(yī)藥治療腎病的研究。

*通訊作者：張琪(1922-)，男,首屆國(guó)醫(yī)大師，博士研究生導(dǎo)師，主要研究方向：中醫(yī)藥治療腎病的研究。

R285.5

A

1002-2392(2017)03-0020-04