核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構體

徐靜涵，薛 蕓，王 彥，閆 超

(上海交通大學，上海 200240)

?

核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構體

徐靜涵，薛 蕓，王 彥*，閆 超*

(上海交通大學，上海 200240)

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構體，優(yōu)化了液相色譜條件，實現(xiàn)了7種非對映異構體的快速完全分離，并應用于市售水飛薊制劑的分離檢測。優(yōu)化色譜條件如下：核殼型Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)、甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)-甲醇為流動相、梯度洗脫、流速0.35 mL·min-1、進樣量2 μL。該方法在0.01～0.1 mg·mL-1濃度范圍內線性關系良好(R2>0.997)，色譜峰峰面積和保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為1.74%和0.67%(n=6)。該方法操作簡單、省時、分離度好，可用于水飛薊制劑的分析檢測，也為水飛薊素中非對映異構體的分離檢測提供新的思路。

高效液相色譜法；核殼型色譜柱；水飛薊素；非對映異構體

水飛薊[Silybum marianum(L.)Gaertn.]為菊科植物水飛薊的干燥成熟果實，具有清熱解毒、疏肝利膽的功效，常用于肝膽濕熱、脅痛、黃疸等疾病的治療[1]。水飛薊的主要有效成分是以水飛薊素(silymarin)為主的黃酮類化合物[2]，主要包括水飛薊賓A/B(silybinA/B)、異水飛薊賓A/B(isosilybinA/B)、水飛薊亭A/B(silychristinA/B)、水飛薊寧(silydianin)等7種非對映異構體化合物[3]，其結構式見圖1。

圖1 水飛薊素中7種非對映異構體的結構式

水飛薊賓A和水飛薊賓B、異水飛薊賓A和異水飛薊賓B、水飛薊亭A和水飛薊亭B以及水飛薊賓和異水飛薊賓之間均互為差向異構體。水飛薊賓是水飛薊素的主要活性成分，具有抗氧化、抗纖維化、穩(wěn)定細胞膜和調節(jié)肝再生能力等功能[4-5]；水飛薊亭與水飛薊寧的體外保肝作用均強于水飛薊賓[6-7]，其抗氧化活性更高[8]，抗細胞光老化作用也更明顯[9-10]。由于水飛薊素中7種非對映異構體化合物的結構多樣性以及生物活性的不同，對其的分離研究意義重大，但分離難度較大，難以實現(xiàn)完全分離。目前，主要的分析方法有：反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[11-12]、超高效液相色譜法(UPLC)[13-14]、氣相色譜法(GC)[15]、紫外分光光度法(UV)[16]、毛細管電泳法(CE)[17]等，其中RP-HPLC是應用最廣的分析方法，但存在分析時間較長、分離度較低、難以完全分離等問題；UPLC雖然分離效率高，但成本高。核殼型色譜柱是一種新型色譜柱，由1.7 μm的實心核和0.5 μm的多孔殼組成，球形均勻，縱向擴散項小[18]，具有滲透性好、分離快速、系統(tǒng)反壓較低、耐用性和穩(wěn)定性出眾等優(yōu)點[19-20]。作者采用核殼型色譜柱-HPLC在較短時間內同時快速分離檢測水飛薊素，實現(xiàn)了7種非對映異構體的完全分離，為水飛薊素及水飛薊制劑的分離研究提供了一種高效、準確、便捷的方法。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

水飛薊賓標準品(純度≥98%，批號G25D5L1)、水飛薊素標準品(純度≥80%，批號R26N6L6634)，上海源葉生物科技有限公司；水飛薊素膠囊(批號B1401476)，德國馬博士大藥廠；水飛薊賓膠囊(批號550609056)，天津天士力圣特制藥有限公司；水飛薊賓葡甲胺片(批號151003446)，江蘇中興藥業(yè)有限公司；保肝膠囊(批號3051012017)，美國Farlong公司；乙腈、甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，分析純，美國Aladdin公司；超純水。

Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀，配有二元泵、進樣器、柱溫箱、紫外檢測器、LC solution化學工作站，日本Shimadzu公司；LTQ XL型線性離子阱質譜儀，配有Xcalibur分析軟件，美國Thermo Scientific公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；Milli-Q Integral型超純水儀，重慶摩爾水處理設備有限公司；JD200-3型電子天平，鄭州南北儀器設備有限公司；XW-800型渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠。

1.2 溶液的制備

水飛薊賓、水飛薊素標準品溶液的制備：精密稱取標準品1.0 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成0.1 mg·mL-1的儲備液，置于4 ℃冰箱儲存，使用時用甲醇稀釋。

水飛薊賓膠囊、水飛薊素膠囊、保肝膠囊供試品溶液的制備：精密稱取膠囊內容物5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲處理30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

水飛薊賓葡甲胺片供試品溶液的制備：取片劑，去糖衣，研細；精密稱取細粉5.0 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，超聲處理30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，備用。

1.3 實驗條件

色譜條件：核殼型Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流動相B為甲醇；梯度洗脫：0～30 min，20%～35% B；30～35 min，35% B；35～40 min，35%～20% B；流速0.35 mL·min-1；紫外檢測波長288 nm；柱溫25 ℃；進樣量2 μL。

質譜條件：負離子掃描模式，毛細管電壓-4 kV，毛細管溫度350 ℃，掃描范圍50～1 500 Da，鞘氣流速35 arb，輔助氣流速15 arb，碰撞誘導解離(CID)碰撞能量35%。

2 結果與討論

2.1 水飛薊素中7種非對映異構體的成分鑒定

通過對不同掃描模式的考察，發(fā)現(xiàn)水飛薊素(m/z482)在負離子模式下能夠獲得更多的離子碎片信息，如圖2所示。

圖2 水飛薊素的質譜圖

水飛薊素中7種非對映異構體均易失去一個質子形成 [M-H]-準分子離子峰，因此以m/z481作為母離子，分別對母離子進行碰撞誘導解離，獲得二次碎裂產(chǎn)生的子離子(圖3)。該方法可以獲得化合物的一系列碎片信息，能夠快速區(qū)分和鑒定同分異構體。

圖3 水飛薊素中7種非對映異構體的二級碎片質譜圖

從圖3可以看出，由于7種非對映異構體的結構不同，其二級質譜的子離子碎片也有非常顯著的區(qū)別。水飛薊亭A/B的二級質譜碎片中豐度最高的為m/z463、355，而水飛薊寧的子離子碎片中則沒有m/z355；對于差向異構體水飛薊賓和異水飛薊賓，水飛薊賓A/B的二級質譜碎片中豐度最高的為m/z463、453、355、301，但異水飛薊賓A/B的子離子碎片中沒有m/z355，且m/z301的豐度也不高。結果與7種非對映異構體的子離子碎片裂解規(guī)律[13]相符。

根據(jù)主要的子離子碎片分別對水飛薊素中7種非對映異構體進行成分鑒定，結果見表1。

表1 水飛薊素中7種非對映異構體的二級質譜主要離子碎片的成分鑒定

2.2 HPLC條件考察

2.2.1 流動相中有機改性劑的選擇

考察了不同流動相體系甲醇-水和乙腈-水對分離效果的影響，結果見圖4。

由圖4可知，乙腈為有機改性劑時，洗脫能力較強，整體保留時間縮短，但分離度下降，分離效果較差；甲醇為有機改性劑時，水飛薊素中7種非對映異構體能夠得到良好的分離。因此，選擇甲醇作為流動相中的有機改性劑。

2.2.2 進樣量的選擇

考察了進樣量(20 μL、10 μL、5 μL、2 μL)對分離效果的影響，結果見圖5。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

由圖5可知，隨著進樣量的減少，色譜峰的峰型及分離度都有了顯著改善，與樣品濃度無明顯關系。因此，為保證分離效果及準確性，選擇進樣量為2 μL。

2.2.3 色譜柱的選擇

考察了普通C18色譜柱與核殼型Halo C18色譜柱對分離效果的影響，結果見圖6。

由圖6可知，使用普通C18色譜柱時，盡管增長柱長及調節(jié)流動相流速，但水飛薊素中7種非對映異構體仍然存在色譜峰分離度較低、分離效果不佳、分離時間長等問題；使用核殼型Halo C18色譜柱時，分離時間較普通C18色譜柱縮短了35.5%，分離效果良好。因此，選擇2.7 μm Halo C18色譜柱。

2.2.4 色譜柱柱長的選擇

考察了Halo C18色譜柱柱長(100 mm、150 mm)對分離效果的影響，結果見圖7。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

a.100 mm b.150 mm

由圖7可知，隨著色譜柱柱長的改變，水飛薊素中7種非對映異構體的保留時間基本不變；但當使用150 mm柱長色譜柱時，水飛薊亭B與水飛薊寧的分離度顯著提高，是使用100 mm柱長色譜柱時分離度的3倍。因此，選擇150 mm柱長的Halo C18色譜柱。

2.2.5 最優(yōu)分離條件下的色譜圖

綜上，確定最優(yōu)分離條件為：Halo C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，2.7 μm)；流動相A為甲醇-水-甲酸(30∶70∶0.1)，流動相B為甲醇；梯度洗脫；流速0.35 mL·min-1；進樣量2 μL。在此最優(yōu)條件下，水飛薊素中7種非對映異構體的色譜圖見圖8。

由圖8可知，在最優(yōu)分離條件下，水飛薊素中7種非對映異構體被快速完全分離。

1～7：水飛薊亭A/B、水飛薊寧、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B

2.3 分析方法的評價

2.3.1 線性實驗

取水飛薊賓標準品溶液，用甲醇分別稀釋至0.01 mg·mL-1、0.03 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.07 mg·mL-1、0.1 mg·mL-1，分別進樣，以濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到水飛薊賓的線性回歸方程為：y=28089x+116.72，R2=0.997。表明，水飛薊賓在0.01～0.1 mg·mL-1濃度范圍內線性關系良好，檢出限為20.0 ng·mL-1。

2.3.2 精密度實驗

在確定的最優(yōu)色譜條件下，將水飛薊素標準品溶液重復進樣6次，計算水飛薊賓的色譜峰峰面積及保留時間的相對標準偏差(RSD)分別為1.74%和0.67%。表明，本方法具有良好的精密度及重現(xiàn)性。

2.4 水飛薊制劑樣品分析

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法在最優(yōu)色譜條件下，對市售水飛薊制劑中常見的水飛薊賓膠囊、水飛薊賓葡甲胺片、水飛薊素膠囊、保肝膠囊分別進行分離檢測，結果見圖9。

由圖9可知，該方法能夠很好地將水飛薊制劑中的水飛薊賓及水飛薊素中7種非對映異構體分離，可用于實際制劑中水飛薊賓及水飛薊素的定性定量檢測。

采用核殼型色譜柱-高效液相色譜法檢測4種水飛薊制劑，結果發(fā)現(xiàn)，在水飛薊賓膠囊、水飛薊賓葡甲胺片中均檢測到水飛薊賓，含量分別為95.7%和96.9%；在水飛薊素膠囊、保肝膠囊中均檢測到水飛薊素中的7種非對映異構體，含量以水飛薊賓計分別為50.2%和11.1%，濃度均在線性范圍內。表明，4種水飛薊制劑均符合成分要求，其中水飛薊賓膠囊與水飛薊賓葡甲胺片中水飛薊賓含量較高可能是因為藥物為化學合成[21-22]，具有較高的純度；水飛薊素膠囊與保肝膠囊中水飛薊賓含量較低可能是因為藥物是從天然植物中提取，可能含有其它成分。

a.水飛薊賓標準品 b.水飛薊賓膠囊 c.水飛薊賓葡甲胺片 d.水飛薊素標準品 e.水飛薊素膠囊 f.保肝膠囊

3 結論

建立了核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中水飛薊亭A/B、水飛薊賓A/B、異水飛薊賓A/B、水飛薊寧等7種非對映異構體的分離分析方法，解決了非對映異構體及差向異構體之間難以分離、分析時間長的問題，實現(xiàn)了7種非對映異構體的完全分離。通過對分析條件的優(yōu)化，充分發(fā)揮了核殼型色譜柱的優(yōu)勢，明顯縮短了分離時間，取得了良好的峰型和分離度，并應用于4種市售水飛薊制劑樣品的定性定量檢測。該方法具有快速高效的優(yōu)勢，且操作簡單、結果可靠。未來針對水飛薊素中的單個或多個異構單體的研究可以利用該方法開展實驗，配合適宜的前處理方法，也可對血樣、尿樣等代謝產(chǎn)物進行檢測，為中藥有效成分的分析檢測提供了一種快速且行之有效的方法，也為非對映異構體的分離檢測提供了新的思路。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015：82.

[2] 王蕓,AZEEM I，BOIMA K J，等.水飛薊全草不同部位的組成特征[J].色譜,2010,28(12):1192-1195.

[4] OZTURK M,AKDOGAN M,KESKIN I,et al.Effect ofSilybummarianumon acute hepatic damage caused by carbon tetrachloride in rats[J].Biomedical Research,2012,23(2):268-274.

[5] CSUPOR D,CSORBA A,HOHMANN J.Recent advances in the analysis of flavonolignans ofSilybummarianum[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2016,130:301-317.

[6] 鞠雷.水飛薊對大鼠肝細胞醋氨酚損傷的保護作用[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學,2007.

[7] JOHANNES J,JAYARAMA-NAIDU R,MEYER F,et al.Silychristin,a flavonolignan derived from the milk thistle,is a potent inhibitor of the thyroid hormone transporter MCT8[J].Endocrinology,2016,157(4):1694-1701.

[8] 鄭巨約.水飛薊中有效成分的分離制備及其抗氧化活性[D].杭州:浙江工商大學,2009.

[9] 石玉生,張艷,馬金龍,等.水飛薊素對UVB致人角質形成細胞光老化保護作用的研究[J].中醫(yī)藥信息,2013,30(6):36-39.

[10] 石玉生,張艷,馬金龍,等.水飛薊亭對 UVB 致 EsF-1 細胞光老化保護作用的實驗研究[J].中國中醫(yī)藥科技,2013,20(6):643.

[11] 蔣婭蘭,黃芳,毋福海,等.高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時測定銀杏保健茶中的16種黃酮類功效成分[J].色譜,2015,33(10):1032-1039.

[13] 王奎武,胡新玲,張虹,等.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質譜法快速鑒定水飛薊中的活性成分[J].中國中藥雜志,2011,36(17):2361-2366.

[14] GRAF T N,CECH N B,POLYAK S J,et al.A validated UHPLC-tandem mass spectrometry method for quantitative analysis of flavonolignans in milk thistle(Silybummarianum) extracts[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2016,126:26-33.

[15] 王海娜,李新華,錢丹丹,等.水飛薊油脂理化性質及氧化穩(wěn)定性研究[J].食品科技,2015(2):212-218.

[16] 魯燕濱,王玉鳳,陳林,等.兩種測定水飛薊膠囊中總黃酮含量方法的比較分析[J].海南師范大學學報(自然科學版),2015,28(2):163-166.

[17] 朱淑云,董英,肖香,等.水飛薊蛋白組分的理化特性研究[J].中國糧油學報,2013,28(10):15-20.

[18] 陳吉之,閆超.飼料中 9 種磺胺類藥物的 HPLC 法快速分離與檢測[J].中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,2015,46(8):892-894.

[19] ALI I,SALEEM K,HAQUE A,et al.New generation Halo column for fast analyses of aspirin and atorvastatin in pharmaceutical preparation[J].Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies,2013,36(3):261-273.

[20] 楊小玉,王玉紅,王彥,等.核殼型色譜柱-反相高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法同時測定飲料中5種人工合成甜味劑[J].食品工業(yè)科技,2016,37(3):312-322.

[21] 李紹順,計志忠.天然抗肝細胞毒活性化合物2R3R(+)水飛薊賓的全合成[J].中國藥物化學雜志,1997,7(2):107-111.

[22] 張晶,王巍,耿新輝.水飛薊賓葡甲胺的制備與精制[J].藥學實踐雜志,2008,26(4):274-277.

Rapid Separation and Determination of Seven Diastereoisomers in Silymarin by Core-Shell Column-High Performance Liquid Chromatography

XU Jing-han,XUE Yun,WANG Yan*,YAN Chao*

(ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240,China)

Inthisstudy,sevendiastereoisomersinsilymarinwereseparatedanddeterminedrapidlybycore-shellcolumn-highperformanceliquidchromatography(HPLC).Thechromatographicconditionswereoptimized,rapidseparationofsevendiastereoisomerswereachieved,andtheseparationanddeterminationofthecommoncommercialSilybum marianumpreparationswerealsocarriedoutwiththismethod.Theoptimumchromatographicconditionswereasfollows:HaloC18column(150mm×4.6mm,2.7μm),gradientelutionwithmethanol-water-formicacid(30∶70∶0.1)-methanolasamobilephase,flowrateof0.35mL·min-1,injectionvolumeof2μL.Thelinearrelationshipwasgoodintherangeof0.01～0.1mg·mL-1(R2>0.997).Therelativestandarddeviation(RSD)ofthechromatographicpeakareaandtheretentiontimewere1.74%and0.67%(n=6),respectively.Theadvantagesofthismethodaresimpleoperation,shorttimeandhighseparationdegree.ItcanbeusedtoanalyzeSilybum marianumpreparations,andalsoprovidesanewideafortheseparationanddeterminationofdiastereoisomersinsilymarin.

highperformanceliquidchromatography(HPLC);core-shellcolumn;silymarin;diastereoisomer

上海市科委科研計劃項目(15142200200，16142200300)，上海市博士后基金項目(14R21422700)，上海市引進技術的吸收與創(chuàng)新專項(XC-ZXSJ-02-2016-11)

2017-02-14

徐靜涵(1991-)，女，福建福州人，碩士研究生，研究方向：藥物分析，E-mail：xujinghan118@163.com；通訊作者：王彥，副教授，E-mail：wangyan11@sjtu.edu.cn；閆超，教授，E-mail：chaoyan@sjtu.edu.cn。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.014

O658 O657.72

A

1672-5425(2017)06-0065-06

徐靜涵，薛蕓，王彥，等.核殼型色譜柱-高效液相色譜法快速分離檢測水飛薊素中7種非對映異構體[J].化學與生物工程，2017，34(6)：65-70.