蓮子心的HPLC指紋圖譜研究*

曾建偉褚劍峰李西海蔡巧燕林珊朱曉勤陳達(dá)鑫吳錦忠#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350122）

●中西藥苑●

蓮子心的HPLC指紋圖譜研究*

曾建偉1,2褚劍峰1,2李西海1,2蔡巧燕1,2林珊1,2朱曉勤1,2陳達(dá)鑫1,2吳錦忠1,2#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350122）

目的：建立蓮子心的HPLC指紋圖譜，為蓮子心的品質(zhì)評(píng)價(jià)提供可靠的方法。方法：采用Agilent HC C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，以乙腈-0.1%三乙胺溶液（10∶90）為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm，柱溫為30℃，建立蓮子心的HPLC指紋圖譜，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果：10個(gè)產(chǎn)地的蓮子心在指紋圖譜的相似度上達(dá)0.90以上，說(shuō)明這10個(gè)產(chǎn)地的蓮子心其主要化學(xué)成分基本一致。結(jié)論：該方法能較好地反映蓮子心的化學(xué)成分信息，且操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，為科學(xué)評(píng)價(jià)蓮子心品質(zhì)提供了參考。

蓮子心；HPLC；指紋圖譜；相似度

蓮子心為睡蓮科植物蓮（Nelumbo Nucifera Gaertn）成熟種子的干燥幼葉及胚根，味苦性寒，具有清心安神，交通心腎，澀精止血之功效，用于熱入心包，神昏譫語(yǔ)，心腎不交，失眠遺精，血熱吐血等癥的治療[1]，歷版《中國(guó)藥典》均有收載。蓮子心主要含有生物堿[2]、黃酮[3]、多糖[4]等活性成分，具有降血糖[5]、抗心律失常[6]、抗腫瘤[7]和抗氧化[4，8～9]等活性。蓮子心主產(chǎn)于湖南、湖北、江西、福建、浙江等江南水鄉(xiāng)，素有湘蓮、贛蓮、建蓮等名品，除上述主產(chǎn)地外，全國(guó)多地均有分布。本文采用高效液相色譜法，建立了蓮子心的指紋圖譜，從化學(xué)層面考察了全國(guó)各產(chǎn)地蓮子心的品質(zhì)差異，為科學(xué)評(píng)價(jià)蓮子心的整體品質(zhì)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 儀器與材料

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（包括G1311A四元泵，G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測(cè)器，Chemstation工作站），MS105DU十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多公司），AR2130千分之一電子天平（奧豪斯儀器有限公司），KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Millipore超純水機(jī)（Millipore公司）。

1.2 材料蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿（對(duì)照品）均購(gòu)自北京捷成生物工程技術(shù)公司，乙腈、甲醇（色譜純），三乙胺、甲醇（分析純）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。蓮子心樣品分別采自全國(guó)各主產(chǎn)地，分別編號(hào)為S1：河南南陽(yáng)，S2：福建建寧，S3：湖北洪湖，S4：湖南湘潭，S5：江蘇洪澤湖，S6：江西廣昌，S7：山東微山湖，S8：浙江龍游，S9：重慶石祝，S10：安微蕪湖，均經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)楊成梓教授鑒定為蓮（Nelumbo nucifera Gaertn）的干燥幼葉及胚根。

2 方法

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent HC C18（4.6 mm× 250 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%三乙胺溶液（10∶90），梯度洗脫，0～20 min：乙腈10%～50%；20～25 min：乙腈50%～80%；25～35 min：乙腈80%；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：284 nm；進(jìn)樣量：10 μl；柱溫：30℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液配制取蓮心堿，異蓮心堿，甲基蓮心堿適量，精密稱定，加甲醇使溶解，制成濃度分別為20、40和60 μg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液配制取蓮子心粉末（過(guò)四號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25 ml 30%乙醇，稱定重量，浸泡30 min，加熱回流提取60 min，放冷，再次稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，過(guò)孔徑為0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.42%，相對(duì)峰面積RSD≤1.50%，相似度均大于0.98，表明該儀器的精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進(jìn)樣檢測(cè)，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD≤2.56%，相似度大于0.96，表明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批蓮子心藥材共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，各共有峰的相對(duì)峰面積RSD≤2.81%，相似度大于0.97，表明該分析方法重現(xiàn)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與共有指紋峰的確認(rèn)

2.4.1 指紋圖譜的建立取10批來(lái)自不同產(chǎn)地蓮子心藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，記錄各產(chǎn)地蓮子心的HPLC色譜圖，導(dǎo)入藥典委員會(huì)頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)A版》，經(jīng)系統(tǒng)自動(dòng)匹配后，生成蓮子心的指紋圖譜。見(jiàn)圖1。

圖1 蓮子心HPLC指紋圖譜

2.4.2 共有峰的確定從蓮子心HPLC指紋圖譜中確定出14個(gè)共有峰，選擇保留時(shí)間適中且與相鄰色譜峰分離較好的12號(hào)色譜峰作為參照峰，計(jì)算各共有峰的保留時(shí)間和峰面積與同一圖譜中參照峰的保留時(shí)間和峰面積的比值，得到相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。見(jiàn)表1～表2。

表1 蓮子心HPLC指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間

表2 蓮子心HPLC指紋圖譜中共有峰的相對(duì)峰面積

2.4.3 部分共有峰的鑒定為進(jìn)一步闡明蓮子心的化學(xué)成分組成，采用與現(xiàn)有對(duì)照品比對(duì)的方法，根據(jù)保留時(shí)間和紫外光譜，初步鑒定出指紋圖譜中的12，13，14號(hào)色譜峰分別為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿。

2.5 相似度評(píng)價(jià)采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)，計(jì)算10批蓮子心藥材的HPLC指紋圖譜的相似度，以生成的共有模式為對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算相似度，結(jié)果表明各產(chǎn)地蓮子心具有良好的相似性。見(jiàn)表3。

表3 10批蓮子心的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果

3 討論

我們?cè)谠囼?yàn)過(guò)程中選擇了不同濃度的乙醇作為提取溶劑，采用索氏提取、超聲提取和回流提取作為提取方法，并選擇不同的提取時(shí)間，對(duì)蓮子心藥材進(jìn)行提取得到了不同的樣品溶液，并進(jìn)行了HPLC檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果分析了色譜峰的峰形、峰數(shù)、分離度和基線等，最終確定以30%乙醇為提取溶劑，超聲提取30 min是最佳提取條件。

將樣品溶液在全波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示，樣品3D色譜圖在284 nm處，峰數(shù)較多，峰面積較大，基線平穩(wěn)。這既是蓮子心生物堿成分的最大吸收波長(zhǎng)，也是黃酮成分的第二大吸收波長(zhǎng)，該波長(zhǎng)能最大限度地檢測(cè)出蓮子心的主要成分，故選擇284 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

此外，蓮子心的主要成分為生物堿成分呈堿性，為降低拖尾現(xiàn)象，我們?cè)谒嘀屑尤肓?.1%的三乙胺作為掃尾劑。實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，采用等度洗脫，色譜圖中間較長(zhǎng)一段時(shí)間無(wú)峰，為節(jié)約分析時(shí)間，我們采用了梯度洗脫并優(yōu)化了流動(dòng)相的變化比例，使出峰均勻，峰的分離度良好。

蓮子心含有多種化學(xué)成分，藥典標(biāo)準(zhǔn)中僅測(cè)定蓮心堿一個(gè)成分的含量，已不能全面反映蓮子心的整體質(zhì)量，因此建立能全面、系統(tǒng)地反映其化學(xué)成分的指紋圖譜，將為其品質(zhì)評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供一個(gè)有效的參考方法。本文在優(yōu)化提取方法和色譜條件的基礎(chǔ)上，建立了蓮子心的HPLC指紋圖譜，確定了蓮子心的14個(gè)共有峰，其中峰12、13、14分別鑒定為蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿。相似度計(jì)算結(jié)果表明，各批樣品指紋圖譜的色譜峰整體上基本一致，相似度均在0.90以上，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.71%，而共有峰的相對(duì)峰面積RSD卻相差很大，在63.68%～111.9%之間。由此可見(jiàn)，不同產(chǎn)地的蓮子心所含化學(xué)成分的種類雖然基本一致，但其含量差異仍然較大，提示蓮子心藥材的品質(zhì)可能與產(chǎn)地的生長(zhǎng)環(huán)境、采收加工等因素有關(guān)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015.273

[2]李萍,楊光明,張玉玲,等.蓮子心脂溶性生物堿的分離、鑒定[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,35(1):19-27

[3]邵建,劉艷麗,李笑然,等.蓮子心的化學(xué)成分研究[J].中草藥,2016,47 (10):1661-1664

[4]俞遠(yuǎn)志,吳亞林,潘遠(yuǎn)江.蓮子心多糖的提取、分離和抗氧化活性研究[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(理學(xué)版),2008,35(1):48-51

[5]李秋哲.蓮子心黃酮結(jié)構(gòu)分析及其降血糖活性研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2015.18

[6]王瑞芳,歐來(lái)良.蓮子心提取物抗心律失常作用及其急性毒性研究[J].中草藥,2008,39(3):413-415

[7]曾建偉,謝勇,林忠寧,等.蓮子心抗腫瘤活性部位的篩選研究[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床,2014,14(1):87-88

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[9]張俊生,陳莉華,楊順清,等.超聲波輔助乙醇提取蓮子心總黃酮及其抗氧化活性的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(3):220-223

Study on the HPLC Fingerprint of Nelumbinis Plumula

ZENG Jian-wei1,2,CHU Jian-feng1,2,LI Xi-hai1,2,CAI Qiao-yan1,2,LIN Shan1,2,ZHU Xiao-qin1,2,CHEN Da-xin1,2,WU Jin-zhong1,2#
(1Institute of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Key Laboratory of Integrated Traditional and Western Medicine for Senile Diseases of Fujian Province,Fuzhou350122)

Objective:To establish the HPLC fingerprint of Nelumbinis Plumula,in order to provide a reliable method for the quality evaluation of Nelumbinis Plumula.Methods:Used Agilent HC C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)column,with acetonitrile-0.1% triethylamine solution(10∶90)as mobile phase,gradient elution,flow rate was 1 ml/min,the detection wavelength was 284 nm,the column temperature is 30℃,established the HPLC fingerprint of Nelumbinis Plumula,and evaluated the similarity.Results:The similarity of 10 batches of Nelumbinis Plumula from different regions reached more than 0.90.which shows that the main chemical components of these 10 batches of Nelumbinis Plumula from different regions were basically identical.Conclusion:This method can preferably reflect the chemical composition information of Nelumbinis Plumula,and it is simple and reproducible.It provides a reference for the scientific evaluation of the quality of Nelumbinis Plumula.

Nelumbinis Plumula;HPLC;Fingerprint;Similarity

R914

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.03.100

2017-02-07）

福建中醫(yī)藥大學(xué)校管課題-科研創(chuàng)新平臺(tái)專項(xiàng)（編號(hào)：X2015022）

#通訊作者：吳錦忠，E-mail：jinzhongfj@126.com