表皮生長(zhǎng)因子調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞中鈉依賴Ⅱb型磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路研究

邢廷杰 湯小朋 曹滿湖 方熱軍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙410128)

表皮生長(zhǎng)因子調(diào)控豬腸上皮細(xì)胞中鈉依賴Ⅱb型磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)的細(xì)胞信號(hào)通路研究

邢廷杰 湯小朋 曹滿湖 方熱軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南畜禽安全生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，長(zhǎng)沙410128)

本研究旨在探討表皮生長(zhǎng)因子(EGF)調(diào)控豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2中鈉依賴Ⅱb型磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NaPi-Ⅱb)表達(dá)的分子機(jī)制。試驗(yàn)分別用EGF受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrphostin AG 1478)、蛋白激酶A(PKA)抑制劑(H89)、蛋白激酶C(PKC)抑制劑(k4393)、p38抑制劑(SB 203580)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)抑制劑(PD98059)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)抑制劑(anisomycin)與EGF共同處理IPEC-J2細(xì)胞，利用Western blot檢測(cè)相關(guān)通路蛋白及目的蛋白(NaPi-Ⅱb)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示:相較于對(duì)照組，EGF處理后NaPi-Ⅱb表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相較于無(wú)抑制劑組，EGF受體、PKA、PKC、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p38、MAPK/ERK1/2、MAPK/JNK的特異性抑制劑處理IPEC-J2后，NaPi-Ⅱb表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)，其中添加MAPK/ERK1/2特異性抑制劑顯著降低了MAPK/ERK1/2在Tyr204位點(diǎn)的磷酸化水平(P<0.05)，添加MAPK/JNK的特異性抑制劑顯著降低了MAPK/JNK1/2/3在Thr183和Tyr185位點(diǎn)的磷酸化水平(P<0.05)，說(shuō)明該2組抑制劑對(duì)該通路的抑制作用是通過(guò)降低上述位點(diǎn)的磷酸化水平實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果表明EGF受體、PKA、PKC、p38、ERK和JNK均介導(dǎo)了EGF調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞中NaPi-Ⅱb的表達(dá)。

表皮生長(zhǎng)因子；磷；NaPi-Ⅱb；信號(hào)通路；豬小腸上皮細(xì)胞

磷是動(dòng)物機(jī)體必需的礦物元素之一，在動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼形成、能量代謝、核酸合成、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及維持血液酸堿平衡中起著重要作用[1-2]。鈉依賴Ⅱb型磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium dependent phosphate cotransporters type Ⅱb，NaPi-Ⅱb)介導(dǎo)的跨上皮細(xì)胞磷主動(dòng)吸收是小腸磷吸收的主要方式[3]。小腸NaPi-Ⅱb的表達(dá)受許多因素調(diào)控，表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)是調(diào)節(jié)其表達(dá)的重要因素之一[4-6]。EGF是一種由泌乳乳房、下頜腺、腎臟、十二指腸Brunner腺、胰腺和胎盤等分泌的促生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、傷口愈合、骨骼愈合及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能[2,7-8]。EGF調(diào)節(jié)細(xì)胞多種生理功能依賴于與細(xì)胞表面的EGF受體結(jié)合[8]。EGF能使EGF受體酪氨酸殘基自磷酸化，磷酸化的酪氨酸殘基為多種信號(hào)分子提供了錨定位點(diǎn)，進(jìn)而可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)分子如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)/p38、MAPK/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2和MAPK/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)等介導(dǎo)相應(yīng)的目的基因的表達(dá)[9]。

雖然Xu等[4-5]報(bào)道了EGF可通過(guò)修飾c-Myb蛋白與NaPi-Ⅱb基因的親和力，然后通過(guò)PKC/PKA和MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)下游啟動(dòng)子功能的調(diào)節(jié)，從而抑制人小腸細(xì)胞(Caco-2細(xì)胞)NaPi-Ⅱb的轉(zhuǎn)錄活性而降低其表達(dá)水平。本課題組前期研究也表明EGF可抑制豬小腸上皮細(xì)胞NaPi-Ⅱb基因的表達(dá)，并確定EGF在NaPi-Ⅱb基因的啟動(dòng)子上的反應(yīng)原件，即c-Myb在NaPi-Ⅱb基因啟動(dòng)子上的結(jié)合位點(diǎn)為-1 092～-1 085 bp(5′-TCCAGTTG-3′)[6]。但是，目前尚不清楚EGF主要是通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)調(diào)節(jié)豬腸上皮細(xì)胞中NaPi-Ⅱb表達(dá)。因此，本研究擬采用相應(yīng)的信號(hào)分子的特異性抑制劑，包括EGF受體酪氨酸激酶抑制劑(tyrphostin AG 1478)、PKA抑制劑(H89)、PKC抑制劑(k4393)、p38抑制劑(SB 203580)、ERK抑制劑(PD98059)和JNK抑制劑(anisomycin)與EGF共同處理豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2，考察NaPi-Ⅱb在蛋白水平的表達(dá)，以期明確EGF調(diào)控豬小腸上皮細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)的確切途徑。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及抗體

豬EGF(武漢三鷹)；DMEM/F12、十二烷基硫酸鈉(SDS)(Sigma，美國(guó))；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(Invitregen，美國(guó))；30%丙烯酰胺溶液(南京建成)；胎牛血清、小牛血清、四甲基乙二胺(TEMED)、顯影粉、定影粉、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)凝膠配制試劑盒(長(zhǎng)沙艾佳生物公司)；青霉素/鏈霉素(華中農(nóng)大獸藥廠)；脫脂奶粉(伊利)；預(yù)染Marker(Fermentas，加拿大)；蛋白Marker(碧云天生物公司)；BAC蛋白濃度檢測(cè)試劑盒(碧云天生物公司)；過(guò)硫酸銨(上海生工)；硝酸纖維素(NC)膜(Millipore，美國(guó))；濾紙(Whatman，美國(guó))；膠片(Kodak，美國(guó))；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒(Pierce，美國(guó))。

EGF受體酪氨酸激酶抑制劑(T4182-5MG，Sigma，美國(guó))；PKA抑制劑(S1643，碧云天公司)；PKC抑制劑(K4393-10UG，Sigma，美國(guó))；p38抑制劑(SML0543-25MG，Sigma，美國(guó))；ERK抑制劑(SCP0214，Sigma，美國(guó))；JNK抑制劑(S5567-10MG，Sigma，美國(guó))。

NaPi-Ⅱb一抗(21295-1-AP，Proteintech，美國(guó))；PKA催化亞基β一抗(ab187515，Abcam，英國(guó))；PKA調(diào)節(jié)亞基Ⅰβ一抗(ab94613，Abcam，英國(guó))；PKAα/β/γ一抗(ab211265，Abcam，英國(guó))；PKCα一抗(ab32376，Abcam，英國(guó))；PKCβ一抗(ab4132，Abcam，英國(guó))；PKCγ一抗(ab71558，Abcam，英國(guó))；磷酸p38 MAPK(Tyr323)一抗(bs-5477R，Bioss，美國(guó))；磷酸p38 MAPK(Thr180)一抗(bs-5476R，Bioss，美國(guó))；磷酸ERK1/2(Thr202+Tyr204)一抗(bs-3016R，Bioss，美國(guó))；磷酸ERK1(Thr197+Thr202)一抗(bs-3292R，Bioss，美國(guó))；JNK1+JNK2+JNK3一抗(bs-2592R，Bioss，美國(guó))；磷酸JNK1+JNK2+JNK3(Thr183+Tyr185)一抗(bs-1640R，Bioss，美國(guó))；磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗(ab8245，Abcam，英國(guó))；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(Santa Cruz Biotechnology，美國(guó))；抗鼠免疫球蛋白G-HRP(1∶1 000)(北京索萊寶生物公司)；抗兔免疫球蛋白G-HRP(1∶500)(北京索萊寶生物公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

豬小腸上皮細(xì)胞IPEC-J2由中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所惠贈(zèng)。IPEC-J2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F12完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素雙抗)中，每24 h換1次液，當(dāng)細(xì)胞80%融合時(shí)用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代。IPEC-J2細(xì)胞置于37 ℃、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 EGF受體抑制劑處理對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后接種至6孔板中(1×105個(gè)/孔)，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞80%的融合時(shí)，換為DMEM/F12不完全培養(yǎng)基(無(wú)血清無(wú)激素，含青霉素/鏈霉素)過(guò)渡培養(yǎng)16 h，然后試驗(yàn)組加入100 ng/mL EGF[6]，并分別加入0、1、2、5、10和20 μmol/L EGF受體抑制劑，對(duì)照組加入相同體積的培養(yǎng)基，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)8 h。所有處理均為6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析。

1.2.3 PKA、PKC、p38、ERK和JNK抑制劑處理對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后接種至6孔板中(1×105個(gè)/孔)，用DMEM/F12完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞80%的融合時(shí)，換為DMEM/F12不完全培養(yǎng)基(無(wú)血清無(wú)激素，含青霉素/鏈霉素)過(guò)渡培養(yǎng)16 h，然后對(duì)照組加入100 ng/mL EGF[6]，試驗(yàn)組加入100 ng/mL EGF并分別加入PKA、PKC、p38、ERK和JNK抑制劑，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)8 h。所有處理均為6個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞進(jìn)行Western blot分析。

1.3 Western blot分析

1.3.1 細(xì)胞蛋白樣品制備

細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用37 ℃預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞2～3遍，加入適量預(yù)冷的蛋白裂解液置于冰上10～20 min。用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集在EP管后超聲(100～200 W)3 s，然后12 000×g離心5 min。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將所有蛋白樣品調(diào)至相等濃度，充分混合沉淀后加加樣緩沖液后直接上樣，剩余溶液(溶于1×加樣緩沖液)-70 ℃保存。

1.3.2 Western blot檢測(cè)

Western blot程序參照Xiong等[10]介紹的方法。根據(jù)目的蛋白分子質(zhì)量的大小，采用8%、10%、12%與15%的分離膠，5%的濃縮膠將目的蛋白分離。室溫恒流轉(zhuǎn)膜90 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，隨后用含5%脫脂牛奶的對(duì)苯二甲酸丁二醇酯(PBST)緩沖液室溫封閉1 h，然后與NaPi-Ⅱb一抗(1∶500)；PKA催化亞基β一抗(1∶500)、PKA調(diào)節(jié)亞基Ⅰβ一抗(1∶1 000)、PKAα/β/γ一抗(1∶500)、PKCα一抗(1∶1 000)、PKCβ一抗(1∶1000)、PKCγ一抗(1∶1 000)、磷酸p38 MAPK (Tyr323) 一抗(1∶500)、磷酸p38 MAPK(Thr180)一抗(1∶500)、磷酸ERK1/2(Thr202+Tyr204)一抗(1∶500)、磷酸ERK1(Thr197+Thr202)一抗(1∶500)、JNK1+JNK2+JNK3一抗(1∶500)、磷酸JNK1+JNK2+JNK3(Thr183+Tyr185)一抗(1∶500)、GAPDH一抗(1∶800)4 ℃孵育過(guò)夜。經(jīng)PBST緩沖液清洗3次，用抗鼠免疫球蛋白G-HRP(1∶8 000)或抗兔免疫球蛋白G-HRP(1∶4 000)室溫孵育1 h，孵育后棄去二抗，用PBST緩沖液清洗膜3次，使用HRP-ECL法對(duì)PVDF膜上的蛋白進(jìn)行顯影。具體的方法是將ECL試劑盒中A液和B液按比例稀釋混合，然后涂在PVDF膜上。將PVDF膜放置在Western blot成像儀上進(jìn)行掃描，然后進(jìn)行拍照保存。結(jié)果用Image J凝膠分析軟件進(jìn)行光密度分析，用GAPDH作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

EGF受體抑制劑試驗(yàn)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件ANOVA法進(jìn)行單因子方差分析，Duncan氏法進(jìn)行多重比較，PKA、PKC、p38、ERK和JNK抑制劑處理試驗(yàn)采用SAS 9.2統(tǒng)計(jì)軟件的t檢驗(yàn)進(jìn)行分析比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGF受體酪氨酸激酶抑制劑干預(yù)后NaPi-Ⅱb表達(dá)水平

為了證實(shí)EGF受體介導(dǎo)了EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，我們?cè)谟?00 ng/mL EGF處理IPEC-J2細(xì)胞的同時(shí)添加了不同濃度的EGF受體抑制劑(0～20 μmol/L)。用Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著EGF受體抑制劑濃度不斷升高，NaPi-Ⅱb表達(dá)水平也逐漸升高(圖1)。相較于對(duì)照組，未添加EGF受體抑制劑的EGF處理中IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；相較于未添加EGF受體抑制劑的EGF處理，添加5、10或20 μmol/L的EGF受體抑制劑顯著提升了IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)水平(P<0.05)，而添加1或2 μmol/L的EGF受體抑制劑對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。這表明EGF受體介導(dǎo)了EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

2.2 PKA信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

為了證實(shí)信號(hào)分子PKA介導(dǎo)EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，我們?cè)谟?00 ng/mL EGF處理IPEC-J2細(xì)胞的同時(shí)添加了PKA的特異性抑制劑。Western blot檢測(cè)顯示PKA的特異性抑制劑沒有改變PKA催化亞基β、PKA調(diào)節(jié)亞基Ⅰβ和PKAα/β/γ的表達(dá)水平(圖2)，說(shuō)明PKA的特異性抑制劑抑制PKA活力不是通過(guò)影響PKA的表達(dá)水平，而是通過(guò)其他方式實(shí)現(xiàn)的。添加PKA的特異性抑制劑，IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb的表達(dá)顯著上升(P<0.05)，這表明信號(hào)分子PKA介導(dǎo)了EGF對(duì)IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

柱形圖標(biāo)記*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記#表示與EGF處理相比差異顯著(P<0.05)，標(biāo)記##表示與EGF處理相比差異極顯著(P<0.01)。下圖同。

Column diagram with * superscript mean significant different compared with control group (P<0.05), and with # superscript mean significant different compared with EGF treatment (P<0.05), while with ## superscript mean extremely significant different (P<0.01). The same as below.

圖1 EGF受體酪氨酸激酶抑制劑干預(yù)后NaPi-Ⅱb表達(dá)水平

Fig.1NaPi-Ⅱbexpression level after intervention with EGF receptor tyrosine kinase inhibitor

圖2 PKA信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響Fig.2 Effects of PKA signal path on EGF regulatingNaPi-Ⅱb expression

2.3 PKC信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

由圖3可知，PKC的特異性抑制劑并沒有改變PKCα、PKCβ和PKCγ的表達(dá)水平，說(shuō)明PKC的特異性抑制劑抑制PKC的活力不是通過(guò)影響PKC的表達(dá)水平，而是通過(guò)其他方式。但是，添加PKC的特異性抑制劑極顯著地抑制了EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)水平(P<0.01)。這表明PKC是EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的關(guān)鍵信號(hào)分子。

圖3 PKC信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響Fig.3 Effects of PKC signal pathway on EGF regulating NaPi-Ⅱb expression

2.4 MAPK/p38信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

由圖4可知，MAPK/p38的特異性抑制劑沒有改變MAPK/p38在Tyr323和Thr180位點(diǎn)的磷酸化水平，這表明MAPK/p38特異性抑制劑抑制MAPK/p38的活力不是通過(guò)影響MAPK/p38的表達(dá)水平和磷酸化水平。但是，添加MAPK/p38的特異性抑制劑顯著抑制了EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)水平(P<0.05)。這表明MAPK/p38信號(hào)通路參與了EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

2.5 MAPK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

由圖5可知，MAPK/ERK1/2的特異性抑制劑沒有改變ERK1在Thr197和Thr202位點(diǎn)的磷酸化水平，但顯著降低了MAPK/ERK1/2在Tyr204位點(diǎn)的磷酸化水平(P<0.05)，這表明MAPK/ERK1/2特異性抑制劑抑制MAPK/ERK1/2的活力主要是通過(guò)降低MAPK/ERK1/2在Tyr204位點(diǎn)的磷酸化水平。添加MAPK/ERK1/2的特異性抑制劑顯著抑制了EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)水平(P<0.05)。這表明MAPK/ERK1/2信號(hào)分子參與了EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

圖4 MAPK/p38信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響Fig.4 Effects of MAPK/p38 signal pathway on EGF regulating NaPi-Ⅱb expression

圖5 MAPK/ERK1/2信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響Fig.5 Effects of MAPK/ERK1/2 signal pathway on EGF regulating NaPi-Ⅱb expression

2.6 MAPK/JNK信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響

由圖6可知，MAPK/JNK的特異性抑制劑沒有改變MAPK/JNK1/2/3的表達(dá)水平，但是顯著降低了MAPK/JNK1/2/3在Thr183和Tyr185位點(diǎn)的磷酸化水平(P<0.05)，這表明MAPK/JNK1/2/3特異性抑制劑抑制MAPK/JNK1/2/3的活力主要不是通過(guò)下調(diào)MAPK/JNK1/2/3的表達(dá)水平，而是通過(guò)降低MAPK/JNK1/2/3在Thr183和Tyr185位點(diǎn)的磷酸化水平。添加MAPK/JNK1/2/3的特異性抑制劑顯著反轉(zhuǎn)了EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)水平(P< 0.05)。這表明MAPK/JNK1/2/3信號(hào)通路參與了EGF對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。

圖6 MAPK/JNK信號(hào)通路對(duì)EGF調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的影響Fig.6 Effects of MAPK/JNK signal pathway on EGF regulating NaPi-Ⅱb expression

3 討 論

EGF是一種分子質(zhì)量為6 ku，含有53個(gè)氨基酸殘基及3個(gè)二硫鍵的小分子肽，具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖、傷口愈合、骨骼愈合及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等生物學(xué)功能[7-8]。大量研究表明EGF通過(guò)結(jié)合并激活細(xì)胞表面的EGF受體而實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能[9,11]。EGF受體是一種分子質(zhì)量為170 ku的跨膜糖蛋白，主要由細(xì)胞外區(qū)、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)區(qū)3部分組成[7,9]。當(dāng)EGF與EGF受體結(jié)合后，EGF受體二聚化，啟動(dòng)自身的酪氨酸激酶活性，同時(shí)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)多種重要的信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，這些細(xì)胞信號(hào)可以調(diào)控多種細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)或抑制多種基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而發(fā)揮復(fù)雜的生理功能[12-14]。

磷作為一種非再生資源，在動(dòng)物體內(nèi)的生物學(xué)利用率非常低，如何充分利用磷資源、提高養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益、減少由于過(guò)量磷的排泄所造成的環(huán)境污染是畜牧業(yè)和飼料與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)有待解決的問(wèn)題。Xu等[4-5]研究表明EGF可抑制Caco-2細(xì)胞中NaPi-Ⅱb基因表達(dá)，Xing等[6]研究也表明EGF可抑制IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb基因的表達(dá)。本研究結(jié)果同樣表明EGF處理IPEC-J2細(xì)胞后NaPi-Ⅱb表達(dá)下降。這些結(jié)果表明EGF對(duì)腸道磷吸收具有重要的調(diào)節(jié)作用，探明EGF對(duì)豬小腸NaPi-Ⅱb調(diào)控的分子機(jī)制及其信號(hào)通路，對(duì)提高磷利用效率，減少磷排泄等具有重要意義。為此，本研究采用EGF受體酪氨酸激酶抑制劑、PKA抑制劑、PKC抑制劑、p38抑制劑、ERK抑制劑和JNK抑制劑等與EGF共同處理IPEC-J2細(xì)胞，考察NaPi-Ⅱb在蛋白水平的表達(dá)，以期明確EGF調(diào)控豬小腸上皮細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)的確切途徑。

通過(guò)使用EGF受體抑制劑處理IPEC-J2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)5、10或20 μmol/L的EGF受體抑制劑處理后IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)上升，這說(shuō)明添加EGF受體抑制劑后EGF不能抑制IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb的表達(dá)，表明EGF抑制IPEC-J2細(xì)胞NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的影響依賴與EGF受體的結(jié)合。

EGF與EGF受體結(jié)合后能激活細(xì)胞內(nèi)多條信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、MAPK、PKC和PKA[15-16]。在小鼠肝細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)EGF通過(guò)直接或間接的方式激活PKA促進(jìn)了EGF對(duì)ERK2的激活，PKA信號(hào)也可以反過(guò)來(lái)影響EGF/EGF受體信號(hào)[17]。EGF激活PKCα可能是通過(guò)調(diào)節(jié)磷脂酶C(PLC)γ，激活后的PKCα可磷酸化Src誘導(dǎo)PI3K磷酸化，隨后進(jìn)一步激活ERK1/2。PKC還能調(diào)節(jié)EGF前體轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)α、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1β和肝素結(jié)合性EGF的剪切和細(xì)胞中的釋放，此外激活PKC阻礙了EGF受體在Thr654位點(diǎn)的磷酸化[18-19]。這表明EGF能激活PKC，而PKC能反過(guò)來(lái)調(diào)節(jié)EGF的分泌和EGF受體的活性。EGF促進(jìn)小鼠反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞中巢蛋白(Nestin)依賴Ras-Raf-ERK信號(hào)通路。在EGF受體-ERK信號(hào)中Ras是唯一膜錨定組件，它的位置決定了細(xì)胞內(nèi)的下游信號(hào)[20-21]。EGF也能調(diào)節(jié)JNK和p38 MAPK的活性。Cdc42是Ras有關(guān)GTP結(jié)合蛋白，研究表明，Cdc42綁定衣被蛋白質(zhì)復(fù)合體的γ亞基(γCOP)對(duì)Cdc42調(diào)節(jié)細(xì)胞性狀轉(zhuǎn)換起到至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)Cdc42綁定γCOP后誘導(dǎo)EGF受體的累積，使得EGF激活ERK1/2、JNK和PI3K，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞分裂[22]。

在人腸道Caco-2細(xì)胞中，EGF主要通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK、PKC和PKA來(lái)調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb的表達(dá)[5]。為了證實(shí)MAPK、PKC和PKA是否介導(dǎo)EGF在豬小腸上皮細(xì)胞中對(duì)NaPi-Ⅱb表達(dá)的調(diào)節(jié)，我們使用了PKA抑制劑、PKC抑制劑、p38抑制劑、ERK抑制劑和JNK抑制劑。結(jié)果表明，這些抑制劑均能阻礙EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)，說(shuō)明這些信號(hào)分子均介導(dǎo)了EGF在這方面的作用，EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)是通過(guò)多條信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。需要指出的是對(duì)PKC進(jìn)行抑制后，NaPi-Ⅱb的表達(dá)水平極顯著提高，而且提高幅度也明顯高于對(duì)其他信號(hào)分子抑制產(chǎn)生的效果。這說(shuō)明PKC介導(dǎo)的信號(hào)通路在EGF下調(diào)NaPi-Ⅱb的表達(dá)過(guò)程中起主要作用。

不過(guò)，雖然本試驗(yàn)證明MAPK(p38、ERK和JNK)、PKC和PKA介導(dǎo)了EGF對(duì)豬腸上皮細(xì)胞中NaPi-Ⅱb表達(dá)水平的調(diào)節(jié)，但是這3個(gè)信號(hào)分子介導(dǎo)的信號(hào)通路十分復(fù)雜，并且這三者之間也存在著緊密聯(lián)系，它們下游的信號(hào)分子最終是如何調(diào)節(jié)NaPi-Ⅱb表達(dá)的還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明EGF調(diào)控IPEC-J2細(xì)胞中NaPi-Ⅱb的表達(dá)受EGF受體、PKA、PKC和MAPK(p38、ERK、JNK)等信號(hào)通路的調(diào)控。

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*Corresponding author, professor, E-mail: fangrj63@126.com

(責(zé)任編輯 田艷明)

Identifying Cell Signaling Pathway that Mediates Epidermal Growth Factor Regulating Sodium Dependent Phosphate Cotransporters Type Ⅱb Expression in Porcine Intestinal Epithelial Cells

XING Tingjie TANG Xiaopeng CAO Manhu FANG Rejun*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,HunanCo-InnovationCenterofAnimalProductionSafety,Changsha410128,China)

The aim of this study was to elucidate the molecular mechanisms of epidermal growth factor (EGF) down-regulated sodium dependent phosphate cotransporters type Ⅱb (NaPi-Ⅱb) expression in porcine intestinal epithelial cells (IPEC-J2). EGF receptor tyrosine kinase inhibitor (tyrphostin AG 1478), protein kinase A (PKA) inhibitor (H89), protein kinase C (PKC) inhibitor (k4393), p38 inhibitor (SB 203580), extracellular signal regulated kinase (ERK) inhibitor (PD98059) and c-Jun n-terminal kinase (JNK) inhibitor (anisomycin) as well as EGF were used to treat IPEC-J2 cells, respectively, and related signal pathways protein and interest protein (NaPi-Ⅱb) expression levels were determined by Western blot. The results showed as follows, compared with control group,NaPi-Ⅱbexpression level was significantly decreased after EGF treatment (P<0.05). Compared with none inhibitor treatments, inhibitors of EGF receptor, PKA, PKC, mitogen activated protein kinase (MAPK)/p38, MAPK/ERK1/2 and MAPK/JNK significantly increasedNaPi-Ⅱbexpression (P<0.05). Especially, MAPK/ERK1/2 inhibitor significantly reduced the phosphorylation level of MAPK/ERK1/2 at Tyr204 site (P<0.05), and MAPK/JNK inhibitor significantly reduced the phosphorylation level of MAPK/JNK1/2/3 at Thr183 and Tyr185 sites (P<0.05). In summary, all EGF receptor, PKA, PKC, p38, ERK and JNK participate in the inhibitory effects of EGF onNaPi-Ⅱbexpression.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(6)：1988-1995]

epidermal growth factor; phosphate;NaPi-Ⅱb; signal pathway; porcine intestinal epithelial cells

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.06.020

2016-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31572419)；長(zhǎng)沙市科技計(jì)劃項(xiàng)目(kh1601185)

邢廷杰(1981—)，男，湖北陽(yáng)新人，博士研究生，從事動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。E-mail: xingtingjie@dbn.com.cn

*通信作者:方熱軍，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: fangrj63@126.com

S811

A

1006-267X(2017)06-1988-08