王紅亮，姜申德，唐剛?cè)A，武志芳，李思進(jìn)

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，山西 太原 030001；2.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)PET-CT中心，廣東 廣州 510080

18F標(biāo)記的白藜蘆醇衍生物的合成及作為β-淀粉樣斑塊顯像劑的初步評(píng)價(jià)

王紅亮1，姜申德2，唐剛?cè)A3，武志芳1，李思進(jìn)1

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，山西 太原 030001；2.天津大學(xué) 藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，天津 300072；3.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)PET-CT中心，廣東 廣州 510080

設(shè)計(jì)并合成四種白藜蘆醇衍生物，以評(píng)價(jià)其用于Aβ-斑塊PET顯像的可能性。通過(guò)化學(xué)合成得到四種白藜蘆醇衍生物的前體化合物和參比化合物；使用參比化合物測(cè)定其與Aβ1-42蛋白聚集體的體外結(jié)合性；經(jīng)[18F] 親核取代反應(yīng)對(duì)具有較高親和力的化合物進(jìn)行放化標(biāo)記，并進(jìn)行體外穩(wěn)定性、脂水分配系數(shù)、生物分布等的測(cè)定。體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示化合物 (E)-1-(3, 5-二甲氧基苯乙烯基)-4-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯([19F]F-7)具有中度的結(jié)合性(Ki=43.76 nmol/L)；[18F]F-7的標(biāo)記時(shí)間為32 min，放化產(chǎn)率(未校正)為(23±2)%，經(jīng)SEP PAK C18柱純化后放化純度大于95%，且在生理鹽水中的穩(wěn)定性大于3 h，具有較好的脂溶性(lgP=3.08)；生物分布實(shí)驗(yàn)顯示化合物[18F]F-7具有較快的腦清除，注射后2 min和60 min的腦攝取分別為(0.55±0.05)%ID/g 和(0.06±0.01)%ID/g，清除比達(dá)到9?；衔颷18F]F-7是一種潛在的β-淀粉樣斑塊PET 顯像劑。

白藜蘆醇衍生物；淀粉樣蛋白斑塊；放化合成；生物評(píng)價(jià)

淀粉樣蛋白(Aβ)沉淀級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)認(rèn)為：阿爾茨海默病(AD)的形成和發(fā)展是Aβ產(chǎn)生、增多和沉積的結(jié)果, 通過(guò)有效測(cè)定AD患者腦內(nèi)Aβ的分布及含量對(duì)于診斷和檢測(cè)AD治療具有重要意義。白藜蘆醇((E)-3，5，4′-三羥基二苯乙烯，resveratrol)作為一種天然的多酚類化合物，具有抗癌、抗炎和抗菌等多種生理活性。白藜蘆醇及其甲基化衍生物具有抑制Aβ的形成和聚集的活性[1-3]，能夠促進(jìn)Aβ聚集體的分解，從而緩解因Aβ產(chǎn)生的細(xì)胞毒性，起到神經(jīng)保護(hù)的作用，在治療AD方面白藜蘆醇具有一定的潛力[4-5]。另外白藜蘆醇與Aβ纖維狀聚集體具有一定的結(jié)合性，通過(guò)熒光吸收的方法可以定量測(cè)定Aβ纖維狀聚集體的含量[6]。

核素標(biāo)記的白藜蘆醇衍生物用于乳腺癌和結(jié)腸癌的核素顯像已經(jīng)有相關(guān)報(bào)道[7-8]。白藜蘆醇分子中具有呈平面共軛特性的二苯乙烯骨架結(jié)構(gòu)，這是能夠與Aβ淀粉樣斑塊結(jié)合的化合物的重要分子特性[9-10]。已有多個(gè)含有二苯乙烯結(jié)構(gòu)特性的分子探針用于Aβ淀粉樣斑塊PET顯像([11C]SB-13和[18F]Florbetaben)[11-13]。本工作擬根據(jù)白藜蘆醇與Aβ的特殊作用方式和Aβ斑塊分子顯像劑的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)[14]，設(shè)計(jì)并制備一系列白藜蘆醇衍生物作為潛在的Aβ斑塊PET顯像劑，并通過(guò)體外結(jié)合試驗(yàn)和小鼠生物分布等實(shí)驗(yàn)對(duì)它們進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮雙環(huán)[8.8.8]二十六烷(K2.2.2)，法國(guó)ABX公司；乙腈和二甲基亞砜(DMSO)，美國(guó)Aldrich公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純或化學(xué)純。昆明小鼠24只，清潔級(jí)，雌雄不限，購(gòu)自廣州中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

Bruker Avance Ⅲ 400 MHz核磁共振波譜儀，德國(guó)Bruker公司；QExactive型高分辨質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermofisher公司；硅膠板60F254，德國(guó)Merck公司；硅膠，37～56 μm，煙臺(tái)化學(xué)工業(yè)研究所；CRC-25R放射性活度計(jì)，美國(guó)Capintec公司；安捷倫1200 Series 分析型HPLC(安捷倫35900E型紫外檢測(cè)器和美國(guó)Bioscan B-FC-3200高能PMT 檢測(cè)器)，美國(guó)安捷倫公司；Sep Pak QMA、C18 plus柱，美國(guó)Waters公司。

1.2 各前體化合物及參比化合物的化學(xué)合成

各前體化合物及參比化合物的具體合成路線示于圖 1。

以白藜蘆醇(化合物1)為原料，首先使用叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)對(duì)苯環(huán)上的三個(gè)酚羥基進(jìn)行單酚羥基的保護(hù)，得到4′-位單酚羥基保護(hù)的化合物2和3(或5)-位單酚羥基保護(hù)的化合物3。使用硫酸二甲酯(Me2SO4) 對(duì)化合物2(或化合物3) 的另外兩個(gè)酚羥基進(jìn)行保護(hù)得到化合物4(或12)；然后使用四正丁基氟化銨(TBAF)脫除TBDMS對(duì)酚羥基的保護(hù)后得到化合物5(或13)；化合物5(或13)再與三乙二醇二(甲磺酸酯)(化合物20)進(jìn)行反應(yīng)得到前體化合物6(或14)。化合物4與2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯(化合物22)得到相應(yīng)的參比化合物[19F]F-7(或[19F]F-15)。

a：TBDMSCl, Et3N, DMC, DMF；b：Me2SO4，NaH，THF；c：TBAF，THF；d：化合物20，K2CO3，18-冠-6，丙酮，回流；e：化合物22，K2CO3，18-冠-6，丙酮，回流；f：DHP，PPTS，DCM；g： p-TsOH，EtOH圖1 白藜蘆醇衍生物的前體化合物和參比化合物的化學(xué)合成路線Fig.1 Preparation of the precursors and standard compounds of resveratrol derivatives

為得到保留有兩個(gè)酚羥基的白藜蘆醇類似物，在得到單TBDMS保護(hù)的化合物(化合物2和3)后，使用3,4-二氫吡喃(DHP)對(duì)化合物2(或化合物3) 的另外兩個(gè)酚羥基進(jìn)行保護(hù)得到化合物8(或16)；然后使用四正丁基氟化銨(TBAF)脫除TBDMS的保護(hù)后得到化合物9(或17)；化合物9(或17)再與三乙二醇二(甲磺酸酯)(化合物20)進(jìn)行反應(yīng)得到前體化合物10(或18)。化合物9(或17)先與2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯(化合物22)反應(yīng)，最后經(jīng)對(duì)甲苯磺酸(p-TsOH)脫除DHP對(duì)酚羥基的保護(hù)后得到參比化合物[19F]F-11(或[19F]F-19)。

其中三乙二醇二(甲磺酸酯)(化合物20)和2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲磺酸乙酯(化合物22)的化學(xué)合成參照文獻(xiàn)[15]。

1.3 體外競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)測(cè)定抑制常數(shù)Ki值

[16]中的方法，使用一定濃度的Aβ蛋白(Aβ1-42蛋白聚集體，初始質(zhì)量濃度為0.5 g/L)與一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)放射配基(125I-IMPY，約1.0×105min-1/100 μL)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。在反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)加不同濃度的待測(cè)化合物(參比化合物[19F]F-7、[19F]F-11、[19F]F-15和[19F]F-19)，平衡后分離復(fù)合物測(cè)放射性。結(jié)合反應(yīng)是在12 mm×75 mm的硼酸鹽玻璃管中進(jìn)行，每一管中加有100 μL Aβ1-42蛋白聚集體溶液、100 μL的125I-IMPY溶液和100 μL不同濃度(10-10～10-4.7mol/L)的待測(cè)化合物(白藜蘆醇衍生物)溶液，最后定容到1 mL。在37 ℃下振蕩孵育2 h，使用Whatman GF/B濾紙(0.5%的聚亞胺中浸泡0.5 h)并打開(kāi)細(xì)胞收集器開(kāi)始收集。最后將濾紙剪下后測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。平衡結(jié)合數(shù)據(jù)經(jīng)非線性回歸分析后以計(jì)算抑制常數(shù)Ki值。

1.4 [18F]F-7 和[18F]F-11的放化合成

[18F]F-7的放化合成參考[18F]-Florbetaben[17]的制備方法，并有少量修改。氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向含有活化后的[18F]F-反應(yīng)瓶中加入溶于DMSO(1 mL)中的前體化合物6(1～3 mg)，120 ℃下密閉反應(yīng)10 min，反應(yīng)完成后加入水(20 mL)，溶液過(guò)Sep Pak C18柱，小柱經(jīng)氮?dú)獯蹈珊笫褂? mL乙醇將產(chǎn)物[18F]F-7從Sep Pak C18柱洗脫下來(lái)。對(duì)于[18F]F-7，蒸除乙醇后則直接加入生理鹽水稀釋、過(guò)濾膜待用。[18F]F-11的放化合成采用兩步法完成。首先前體化合物10經(jīng)18F取代后形成的中間體經(jīng)Sep Pak C18柱純化、乙醇(2 mL)洗脫液濃縮后加入7% HCl水溶液(2 mL)100 ℃下加熱10 min水解后得到[18F]F-11，然后使用6 mol/L氫氧化鈉中和，最后加入生理鹽水稀釋、過(guò)濾膜待用。合成路線示于圖2。

k：[18F]F-/K2.2.2/K2CO3，DMSO；l：2 mol/L HCl溶液圖2 [18F]F-7和[18F]F-11的放化合成Fig.2 Radiosynthesis of [18F]F-7 and [18F]F-11

1.5 脂水分配系數(shù)的測(cè)定

脂水分配系數(shù)參照文獻(xiàn)[18]中的方法來(lái)測(cè)定。

1.6 生物分布的測(cè)定

24只昆明小鼠(中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)編號(hào)后，隨機(jī)分成六組，每組3只，尾靜脈注射經(jīng)生理鹽水稀釋的18F標(biāo)記物([18F]-Florbetaben，[18F]F-7和[18F]F-11)，每只小鼠注射0.2 mL(約7.4 MBq)。注射后于2 min和60 min時(shí)，眼靜脈取血后斷頸處死，解剖取心、腦、肌肉、骨、肝臟、肺、腎等組織和臟器，分別測(cè)量組織和臟器的放射性計(jì)數(shù)和質(zhì)量，計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

2 結(jié)果與討論

2.1 各前體化合物及參比化合物的合成

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Aβ斑塊PET分子顯像劑具有二苯乙烯這種平面的分子結(jié)構(gòu)，這是與淀粉樣蛋白(Aβ)結(jié)合必需的分子結(jié)構(gòu)特征[9-10, 14]；另一方面白藜蘆醇及其衍生物本身與Aβ具有一定的作用性[1-5]。為合成各前體化合物和參比化合物，本研究以白藜蘆醇為原料，直接進(jìn)行化學(xué)修飾得到所設(shè)計(jì)的化合物，未通過(guò)先合成二苯乙烯的骨架結(jié)構(gòu)再進(jìn)行化學(xué)修飾，大大簡(jiǎn)化了各化合物的合成[13]。

1) 前體化合物的化學(xué)合成

前體化合物6和14均經(jīng)四步反應(yīng)完成。(1) 利用化合物1分子結(jié)構(gòu)中4′-位酚基與3,5-位兩個(gè)酚羥基微弱的反應(yīng)活性差別，化合物1與1.33倍當(dāng)量的叔丁基二甲基氯硅烷(TBDMSCl)得到了4′-位單酚基保護(hù)的化合物2(47%)和3(或5)-位單酚羥基保護(hù)的化合物3(33%)，兩個(gè)化合物的反應(yīng)收率比較接近；(2) 采用硫酸二甲酯為甲基化試劑，對(duì)化合物2(或3)另外兩個(gè)游離的酚羥基進(jìn)行甲基化得到化合物4(或12)；(3) 經(jīng)四正丁基氟化銨(TBAF)選擇性脫除4′-位酚羥基的TBDMS的保護(hù)后得到化合物5(或13)；(4) 化合物5(或13)與三乙二醇二(甲磺酸酯)(化合物20)進(jìn)行醚化反應(yīng)得到前體化合物6(或14)。

前體化合物10和18的合成策略和反應(yīng)條件與化合物6和14基本相同，主要區(qū)別是化合物2和3中另外兩個(gè)游離酚羥基則是使用3，4-二氫吡喃(DHP)進(jìn)行保護(hù)，主要為易于脫除保護(hù)基而保留化合物[18F]F-11和[18F]F-19分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基。

在前體化合物的化學(xué)合成中，本研究對(duì)合成的中間產(chǎn)物和目標(biāo)化合物均經(jīng)過(guò)了硅膠柱純化，其中化合物2、3、5、6、10、13、14和18均還經(jīng)過(guò)了核磁共振波譜分析，確定了各自化學(xué)結(jié)構(gòu)的正確性，具體的核磁結(jié)果如下。

化合物2(47%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.33(2H，d，J=8.5 Hz，2′，6′-ArH)，6.94(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.78(1H，d，J=16.1 Hz，-CH)，6.81(2H，d，J=8.4 Hz，3′，5′-ArH)，6.53(2H，d，J=1.8 Hz，2，6-ArH)，6.38(1H,s，4-ArH)，0.984(9H，s，(CH3)3CSi)，0.202(6H，s，(CH3)2Si)。

化合物3(33%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.35(2H，d，J=8.5 Hz，2′，6′-ArH)，6.92(1H，d，J=16.2 Hz,-CH)，6.80(3H，m，-CH，3′，5′-ArH)，6.572(1H，s)，6.545(1H，s)，6.266(1H,s，4-ArH)，0.983(9H，s，(CH3)3CSi)，0.208(6H，s，(CH3)2Si)。

化合物5(85%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.39(2H，d，J=8.50 Hz，2′，6′-ArH)，7.02(1H，d，J=16.30 Hz，-CH)，6.89(1H，d，J=16.30 Hz，-CH)，6.83(2H，d，J=8.6 Hz，3′，5′-ArH)，6.65(2H，d，J=2.2 Hz，2，6-ArH)，6.38(1H，t，J=2.1 Hz，4-ArH)，5.16(1H，OH)，3.83(6H，s，2-OCH3)(與文獻(xiàn)[19]報(bào)道一致)。

化合物6(52%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.41(2H，d，J=8.50 Hz；2′，6′-ArH)，7.03(1H，d，J=16.30 Hz，-CH)，6.926～6.895(3H，m，-CH，3′，5′-ArH)，6.65(2H，d，J=2.2 Hz，3，5-ArH)，6.384～6.375(1H，m，4-ArH)，4.391～4.373(2H，m)，4.154～4.116(2H，m)，3.866～3.848(2H，m)，3.786～3.768(2H，m)，3.745～3.717(2H，m)，3.712～3.696(2H，m)，3.831(6H，s，2-OCH3)，3.057(3H，s，CH3SO3)。

化合物10(54%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.418(2H，d，J=8.7 Hz，2′，6′-ArH)，7.02(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.910～6.845(5H，m，-CH，3′，5′-ArH，2，6-ArH)，6.691～6.678(1H，m)，5.466～5.439(2H，m)，4.388～4.370(2H，m)，4.147～4.128(2H，m)，3.959～3.911(2H，m)，3.841～3.860(2H，m)，3.783～3.765(2H，m)，3.741～3.722(2H，m)，3.708～3.689(2H，m)，3.646～3.615(2H，m)，3.054(3H，s，CH3SO3)，2.03～1.987(2H，m)，1.869～1.883(4H，m)，1.709～1.591(6H，m)。

化合物13(94%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.43(2H，dd，J=8.50 Hz，2′，6′-ArH)，7.01(1H，d，J=16.30 Hz，-CH)，6.874(3H，m，-CH，3′，5′-ArH)，6.624～6.576(2H，m，J=24.1 Hz，3，5-ArH)，6.319～6.311(1H，m，4-ArH)，3.82(6H，d，J=7.3 Hz)。

化合物14(70%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.445(2H，d，J=8.7 Hz，2′，6′-ArH)，7.03(1H，d，J=16.30 Hz，-CH)，6.875～6.690(3H，m，-CH，3′，5′-ArH)，6.661～6.648(2H，m，3，5-ArH)，6.390～6.381(1H，m，4-ArH)，4.387～4.370(2H，m )，4.157～4.138(2H，m)，3.864～3.845(2H，m)，3.829(3H，s，-OCH3)，3.821(3H，s，-OCH3)，3.784～3.767(2H，m)，3.745～3.696(4H，m)，3.055(3H，s，-OSO2CH3)。

化合物18(76%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.427(2H，d，J=8.7 Hz，2′，6′-ArH)，7.047～7.010(3H，m，-CH，3′，5′-ArH)，6.888(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.815(1H，m，2-ArH)，6.691(1H，m，6-ArH)，6.546～6.538(1H，m，4-ArH)，5.443(2H，m)，4.387～4.369(2H，m)，4.142～4.128(2H，m)，3.926～3.885(2H，m)，3.856～3.837(2H，m)，3.784～3.766(2H，m)，3.740～3.692(4H，m)，3.640～3.603(2H，m)，3.055(3H，s，CH3SO3)，2.03～1.987(2H，m)，1.880～1.854(4H，m)，1.710～1.592(6H，m)。

2) 參比化合物的化學(xué)合成

參比化合物[19F]F-7和[19F]F-15是通過(guò)化合物5和13與化合物22直接醚化反應(yīng)得到；參比化合物[19F]F-11和[19F]F-19的化學(xué)合成則經(jīng)過(guò)了兩步反應(yīng)實(shí)現(xiàn)，先與化合物22進(jìn)行醚化反應(yīng)后，再使用對(duì)甲苯磺酸(p-TsOH)脫除THP保護(hù)基而得到。所合成的參比化合物均經(jīng)過(guò)了硅膠柱純化，并經(jīng)核磁共振波譜和高分辨質(zhì)譜分析確定了各自化學(xué)結(jié)構(gòu)的正確性，具體的結(jié)果如下。

化合物7(33%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.43(2H，d，J=8.7 Hz，2′，6′-ArH)，7.03(1H，d，J=16.3 Hz，-CH)，6.920～6.888(3H，m，-CH,3′，5′-ArH)，6.65(2H，d，J=2.2 Hz，3，5-ArH)，6.380～6.371(1H，m，4-ArH)，4.628～4.612(1H，m)，4.533～4.516(1H，m)，4.169～4.150(2H，m)，3.890～3.871(2H，m)，3.828(6H，s)，3.799～3.716(6H，m)。理論分子量為390.18，MS測(cè)定分子量為391.191 3([M+H]+)。

化合物[18F]F-11(83%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.31(2H，d，J=8.6 Hz，2′，6′-ArH)，6.88(1H，d，J=16.3 Hz，-CH)，6.820(2H，d，J=8.6 Hz，3′，5′-ArH)，6.717(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.50(2H，d，J=1.8 Hz，2，6-ArH)，6.279(1H，m，4-ArH)，4.610～4.593(1H，m)，4.514～4.498(1H，m)，4.089～4.070(2H，m)，3.855～3.837(2H，m)，3.785～3.709(6H，m)。理論分子量為362.15，MS測(cè)定分子量為363.159 8([M+H]+)。

化合物15(85%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3):δ7.44(1H，d，J=8.7 Hz，2′，6′-ArH)，7.03(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.905～6.872(3H，m，-CH,3′，5′-ArH)，6.670～6.643(2H，m，3，5-ArH)，6.400～6.391(1H，m，4-ArH)，4.627～4.610(1H，m)，4.531～4.535(1H，m)，4.173～4.154(2H，m)，3.888～3.869(2H，m)，3.828(3H，s)，3.816(3H，s)，3.80～3.715(6H，m)。理論分子量為390.18，MS測(cè)定分子量為391.191 4([M+H]+)。

化合物19(72%)：1H NMR(500 MHz，CDCl3)：δ7.29(2H，d，J=8.5 Hz，2′，6′-ArH)，6.881(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.795(2H，d，J=8.5 Hz，3′，5′-ArH)，6.738(1H，d，J=16.2 Hz，-CH)，6.540～6.518(2H，m，2，6-ArH)，6.308(1H，m，4-ArH)，4.596(1H，m)，4.580(1H，m)，4.084～4.066(2H，m)，3.853～3.835(2H，m)，3.775～3.699(6H，m)。理論分子量為362.15，MS測(cè)定分子量為363.159 9([M+H]+)。

2.2 白藜蘆醇衍生物與淀粉樣蛋白(Aβ)的結(jié)合性測(cè)定

為確定所設(shè)計(jì)的四個(gè)白藜蘆醇衍生物與淀粉樣蛋白(Aβ)的結(jié)合性，對(duì)四個(gè)參比化合物進(jìn)行了與Aβ1-42蛋白聚集體體外結(jié)合試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果列入表1。在所設(shè)計(jì)合成的四個(gè)白藜蘆醇衍生物中，化合物[19F]F-7與Aβ1-42蛋白聚集體具有最高的親和力(Ki=43.76 nmol/L )?？梢钥闯?，分子結(jié)構(gòu)中酚羥基甲基化的化合物與Aβ1-42蛋白聚集體結(jié)合性要高于未甲基化的化合物(例如[19F]F-7>[19F]F-11，[19F]F-15>[19F]F-19)；并且PEG柔性鏈位于二苯乙烯結(jié)構(gòu)中4′-位的化合物要高于在3(或5)-位的化合物(例如[19F]F-7>[19F]F-15，[19F]F-11>[19F]F-19)，可見(jiàn)分子結(jié)構(gòu)的對(duì)稱性能夠明顯影響其與淀粉樣蛋白(Aβ)的結(jié)合性。

表1 白藜蘆醇衍生物的親和力和脂溶性的測(cè)定結(jié)果

2.3 [18F]-7和[18F]-11的放化合成

在與淀粉樣蛋白(Aβ)的體外結(jié)合性試驗(yàn)中，化合物[19F]F-7和[19F]F-11具有相對(duì)較好的結(jié)合性，因此本研究?jī)H對(duì)化合物[18F]F-7和[18F]F-11進(jìn)行了放化合成、穩(wěn)定性、脂溶性和腦攝取測(cè)定等試驗(yàn)。

化合物[18F]F-7總的標(biāo)記時(shí)間為32 min、放化產(chǎn)率(未校正)為(23±2)%?；衔颷18F]F-11標(biāo)記采用兩步法(圖2)，總的標(biāo)記時(shí)間為43 min、放化產(chǎn)率(未校正)為(24±3)%。[18F]F-7和[18F]F-11注射液的比活度分別約為333 GBq/mmol和470 GBq/mmol。[18F]F-7和[18F]F-11注射液的HPLC分析結(jié)果示于圖3(流速1 mL/min，V(乙腈)∶V(0.1 mol/L甲酸銨)=6∶4，λ=254 nm)。由圖3可知，化合物[18F]F-7和[18F]F-11在HPLC體系中的保留時(shí)間與相應(yīng)的參比化合物[19F]F-7和[19F]F-11的保留時(shí)間一致。經(jīng)SEP PAK C18柱分離純化后化合物[18F]F-7和[18F]F-11的放化純度大于95%。根據(jù)以前的研究和相關(guān)文獻(xiàn)[15，20]報(bào)道，采用SEP PAK C18柱進(jìn)行分離純化對(duì)該類化合物體內(nèi)與淀粉樣蛋白(Aβ)的結(jié)合性基本沒(méi)有影響。故本研究未對(duì)化合物[18F]F-7和[18F]F-11進(jìn)行高效液相色譜純化，縮短了放化合成時(shí)間。

由于未經(jīng)過(guò)HPLC純化，化合物[18F]F-7和[18F]F-11注射液的化學(xué)純度較低。注射液中的化學(xué)雜質(zhì)的成分主要是未實(shí)現(xiàn)18F核素標(biāo)記的前體化合物的分解產(chǎn)物和未完全除去的DMSO(圖3(b)和3(e))。盡管在后面動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)中未發(fā)生動(dòng)物死亡，但仍需慎重考慮注射液的化學(xué)毒性。另外，產(chǎn)物注射液中殘留的K2.2.2未進(jìn)行測(cè)定，可通過(guò)加裝一個(gè)陽(yáng)離子交換柱(SCX)將注射液中殘留的K2.2.2除去[21]。后續(xù)研究將注重提高各注射液的化學(xué)純度，以使其具有更高的安全性和有效性。

(a)——[18F]F-7注射液的放射性HPLC色譜圖，(b)——[18F]F-7注射液的紫外HPLC色譜圖，(c)——[19F]F-7的紫外HPLC色譜圖，(d)——[18F]F-11注射液的放射性HPLC色譜圖，(e)——[18F]F-11注射液的紫外HPLC色譜圖，(f)——[19F]F-11的紫外HPLC色譜圖圖3 經(jīng)SEP PAK C18小柱純化的[18F]F-7和[18F]F-11注射液的HPLC色譜圖Fig.3 HPLC results of [18F]F-7 and [18F]F-11 purified with SEP PAK C18 cartridge

2.418F標(biāo)記的白藜蘆醇衍生物的體外穩(wěn)定性、脂水分配系數(shù)的測(cè)定

白藜蘆醇衍生物的親和力和脂溶性的測(cè)定結(jié)果列入表1。由表1可知，[18F]F-7和[18F]F-11的注射液放置3 h后放化純度仍大于90%?；衔颷18F]F-7和[18F]F-11均表現(xiàn)出一定的脂溶性，能夠穿過(guò)血腦屏障。

2.5 [18F]Florbetaben和18F標(biāo)記的白藜蘆醇衍生物的生物分布

為確定所設(shè)計(jì)的18F標(biāo)記的白藜蘆醇衍生物在小鼠中的腦攝取和體內(nèi)代謝情況，本研究在正常昆明小鼠中進(jìn)行了化合物[18F]F-7、[18F]F-11和[18F]Florbetaben的生物分布實(shí)驗(yàn)，結(jié)果列入表2。由表2可知，化合物[18F]F-7和[18F]Florbetaben具有相近的組織攝取和體內(nèi)代謝特性，而化合物[18F]F-11在60 min時(shí)體內(nèi)各主要組織和臟器的放射性攝取要高于化合物[18F]F-7和[18F]Florbetaben，且在肝臟和肺具有高的放射性攝取，可見(jiàn)該化合物主要是經(jīng)過(guò)肝臟代謝。另外，三個(gè)化合物在小鼠體內(nèi)均有一定的脫氟，但腦組織不攝取氟離子，因此對(duì)體內(nèi)顯像的影響不大。

表2 [18F]Florbetaben和白藜蘆醇衍生物在正常小鼠中的生物分布結(jié)果

與化合物[18F]Florbetaben 相比，化合物[18F]F-11具有相近的初始腦攝取量，但其腦清除較差，2 min/60 min時(shí)的清除比僅為2.65。兩者在結(jié)構(gòu)上的不同之處是：在[18F]F-11的4-位無(wú)取代基，相鄰的3和5位連接有兩個(gè)游離的酚羥基，雖然在[18F]F-11分子結(jié)構(gòu)中3和5位的羥基不影響其穿過(guò)BBB的能力([18F]F-11的lgP為1.85)，但是腦清除較慢，這可能是其存在與腦組織的非特異性結(jié)合。與文獻(xiàn)[13]中18F取代的白藜蘆醇衍生物([18F]F-5)相比，化合物[18F]F-7的腦初始攝取量相對(duì)較低，一方面可能是[18F]F-7分子結(jié)構(gòu)中親水性的聚乙二醇側(cè)鏈?zhǔn)蛊渲峙湎禂?shù)低于文獻(xiàn)[13]中的化合物([18F]F-5)；另一方面可能是本研究所用的小鼠種類有關(guān)，本研究中測(cè)定的化合物[18F]Florbetaben的腦初始攝取量也低于文獻(xiàn)[17]所報(bào)道的結(jié)果。但[18F]F-7腦清除較快，2 min/60 min時(shí)的清除比達(dá)到9.00。在活體內(nèi)進(jìn)行PET顯像時(shí)，[18F]F-7快速的腦清除將有利于形成較低的非特異性結(jié)合和較低的腦本底，是作為Aβ淀粉樣斑塊PET 顯像劑必須具有的重要特性。

3 結(jié) 論

以白藜蘆醇為原料，通過(guò)引入帶有18F標(biāo)記的柔性PEG側(cè)鏈后得到四個(gè)Aβ PET顯像劑。經(jīng)體外與Aβ結(jié)合性測(cè)定確定化合物(E)-1-(3，5-二甲氧基苯乙烯基)-4-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙氧基)苯(化合物[19F]F-7)具有最好的親和力，使用帶有甲磺酸酯的前體化合物進(jìn)行核素18F標(biāo)記，經(jīng)SEP PAK C18小柱純化后得到放化純度大于95%的注射液。該化合物具有較好的脂溶性和穩(wěn)定性，且具有較適宜的腦初始攝取量和較快的腦清除。因此，化合物[18F]F-7是一種潛在的Aβ淀粉樣斑塊PET 顯像劑，后續(xù)研究將著重提高其注射液的純度，并進(jìn)行小鼠AD模型的活體PET顯像研究。

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18F-Radiolabeled Resveratrol Derivatives: Synthesis, Radiolabeling,and Preliminary Evaluation as β-Amyloid Plaque PET Agents

WANG Hong-liang1, JIANG Shen-de2, TANG Gang-hua3, WU Zhi-fang1, LI Si-jin1

1.Department of Nuclear Medicine, The First Hospital of Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China；2.School of Pharmaceutical Science and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China；3.PET-CT Center, Department of Nuclear Medicine, The First Affiliated Hospital,Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510080, China

In this study, four fluorine-substituted resveratrol derivatives were designed and synthesized as candidates for β-amyloid(Aβ) plaque imaging. Theinvitrobinding studies using Aβ1-42peptide aggregates were carried out with the four resveratrol derivatives. The F-18 labeled derivatives with the highest binding affinities to Aβ1-42aggregates were prepared using the appropriate mesylate precursors in DMSO, and the stability and partition coefficient were also evaluated. And the biodistribution studies were performed using the normal Kunming mice. Among all derivatives examined, (E)-1-(3, 5-dimethoxystyryl)-4-(2-(2-(2-fluoroethoxy)ethoxy)ethoxy) benzene (Compound 7) shows highest binding affinity to Aβ1-42-peptide aggregates (Ki=43.76 nmol/L, with [125I]IMPY as radioligand). No-carrier-added [18F]F-7 was successfully prepared within 32 min (uncorrected yield (23±2)%) and purified using a Sep Pak C18 cartridge with a high radiochemical purity (>95%). [18F] F-7 shows a good stability in saline and an adequate lipophilicity (lgP=3.08). For biodistribution, [18F]F-7 displays moderate initial brain uptake ((0.55±0.05)%ID/g at 2 min) with rapid wash-out from brains ((0.06±0.01)%ID/g at 60 min); 2-to-60 min uptake ratio is 9. Of these compounds, [19F] F-7 shows the highest binding affinity, and [18F] F-7 exhibits suitable lipophilicity and reasonable initial brain uptake and fast washout. All these results indicate that [18F] F-7 is a suitable radioligand for Aβ plaque imaging.

resveratrol derivatives; β-amyloid(Aβ) plaque; radiosynthesis; biological evaluation

2016-06-29；

2016-10-08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81471695)

王紅亮(1981—)，男，河南濮陽(yáng)人，講師，從事放射性藥物的應(yīng)用研究，E-mail: hongliang0812@163.com

R817.4；TL923

A

0253-9950(2017)03-0243-09

10.7538/hhx.2017.39.03.0243