響應(yīng)面法優(yōu)化苦水玫瑰精油提取后廢棄物中總黃酮分離純化工藝及抗氧化活性研究

陸秀云,王 波,曹佳敏,李 廣,龔 祥,周 圍,,,*

(1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,甘肅蘭州 730010;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

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響應(yīng)面法優(yōu)化苦水玫瑰精油提取后廢棄物中總黃酮分離純化工藝及抗氧化活性研究

陸秀云1,王 波2,曹佳敏3,李 廣1,龔 祥3,周 圍1,2,3,*

(1.西北師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心,甘肅蘭州 730010;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

目的:探討響應(yīng)面法優(yōu)化苦水玫瑰精油提取后廢棄物中總黃酮的分離純化工藝及抗氧化活性,為回收利用苦水玫瑰精油提取后廢棄物中的總黃酮提供依據(jù)。方法:通過(guò)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)研究D101型樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取后廢棄物中黃酮類化合物的吸附和解析能力,之后在單因素動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦水玫瑰精油提取后廢棄物中總黃酮分離純化工藝參數(shù)。在此基礎(chǔ)上,以維生素C(VC)為對(duì)照,研究純化后總黃酮對(duì)ABTS+·、DPPH·、·OH的清除能力。結(jié)果:靜態(tài)實(shí)驗(yàn)吸附量1.83 mg/g,吸附率86.10%,洗脫率88.07%,說(shuō)明D101型樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取后廢棄物中黃酮類化合物有較好的吸附和解析能力;響應(yīng)面法優(yōu)化的動(dòng)態(tài)吸附工藝參數(shù)為上樣液pH2.12、上樣液質(zhì)量濃度10.4 mg/L、上樣液流速1.72 mL/min,吸附率為95.06%;用60 mL無(wú)水乙醇溶液洗脫,解析率達(dá)到98.30%;分離純化后的總黃酮純度可達(dá)5.651%;純化后的總黃酮對(duì)ABTS+·、DPPH·、·OH清除作用的IC50分別為:0.03、0.1、8 μg/mL,最大清除率分別為:98.96%、89.76%、65.45%,可以看出廢棄物中總黃酮具有較好的抗氧化活性。

苦水玫瑰精油提取后廢棄物,總黃酮,響應(yīng)面,分離純化,抗氧化活性

玫瑰(Rose)為薔薇科薔薇屬的多年生常綠或落葉灌木,又稱為刺玫花、徘徊花、穿心玫瑰等,是一種具有食用和藥用價(jià)值的天然植物?？嗨倒迨侵袊?guó)玫瑰和鈍齒薔薇的雜交種,盛產(chǎn)于甘肅永登苦水鎮(zhèn)?？嗨倒寤ㄉ珴梢蠹t,品質(zhì)可與久負(fù)盛名的大馬士革玫瑰媲美,現(xiàn)已成為集觀賞、油用、食用、藥用及香料等多種用途[1-3]于一身的特色經(jīng)濟(jì)品種。有文獻(xiàn)[4-6]報(bào)道,苦水玫瑰中含有黃酮類、多酚類等主要化學(xué)成分。其中,黃酮類化合物泛指以2-苯基色原酮為母體的一類化合物,為植物代謝過(guò)程中產(chǎn)生的一類重要天然有機(jī)化合物,具有清除自由基、抗氧化、抗衰老、抗癌、抑制酶的活性等重要作用,因而黃酮類化合物成為近幾年研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái),苦水玫瑰的主要用途是提取玫瑰精油,一般采用水蒸汽蒸餾法[7-8],待苦水玫瑰精油提取后,將會(huì)產(chǎn)生大量廢棄物[9]。其中,此類廢水有機(jī)物濃度高,色度大,處理難度大,處理費(fèi)用高。目前,部分工廠因缺乏廢棄物處理技術(shù)與資金,導(dǎo)致處理后廢水水質(zhì)無(wú)法達(dá)到《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB8978-1996),在此情況下,一些工廠將玫瑰廢水簡(jiǎn)單沉降后直接排放或不做任何處理直接排放到外界環(huán)境中,使自然水體顏色變紅,水體中COD、BOD5等污染指標(biāo)的濃度增加,水質(zhì)惡化,造成嚴(yán)重的水環(huán)境污染。因此,為解決此類環(huán)境污染問題,提取玫瑰廢水中的黃酮類化合物,不僅可以回收廢水中的有效成分,而且可以使廢水顏色變淡,有機(jī)物含量大幅降低,有利于廢水處理。本文以甘肅省永登縣苦水玫瑰精油提取后所產(chǎn)生廢水為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,對(duì)苦水玫瑰精油提取后廢水中總黃酮的分離純化及回收利用進(jìn)行了研究。

響應(yīng)面分析[10-13]是一種利用合理的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),通過(guò)分析多元二次回歸方程來(lái)求得最佳工藝參數(shù)的統(tǒng)計(jì)方法。它具有實(shí)驗(yàn)周期短,回歸方程精確度高,能研究多因素間交互作用等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)[14-20],測(cè)定黃酮類化合物抗氧化能力的方法主要有DPPH·、ABTS+·、·OH檢測(cè)法,這種方法具有穩(wěn)定性好、簡(jiǎn)便易行、靈敏可靠等優(yōu)點(diǎn)。因此,本實(shí)驗(yàn)用響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰廢水中黃酮分離純化工藝,并采用DPPH·、ABTS+·、·OH檢測(cè)法對(duì)玫瑰廢水中黃酮抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定,以期為玫瑰廢水中有效成分的開發(fā)利用提供依據(jù),還需對(duì)其成分進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦水玫瑰精油生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢棄物,過(guò)濾離心,備用。

蘆丁對(duì)照品 上海源葉生物科技有限公司,純度>98%;D-101型大孔樹脂 西安藍(lán)曉科技有限公司;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH) 東京化成工業(yè),純度>97%;2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS) 上海源葉生物科技有限公司,純度>98%;30%雙氧水、鹽酸、無(wú)水乙醇、NaNO2、AlCl3、NaOH 等均為國(guó)產(chǎn)分析純;蒸餾水 屈臣氏。

Sartorius BL610電子分析天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;7230G型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;ZD-2型自動(dòng)電位滴定儀 上海雷磁儀器廠;SP Scientific型真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)VirtTis公司;LABORTA 4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph;玻璃層析柱。

1.2 標(biāo)曲繪制與總黃酮濃度測(cè)定

采用亞硝酸鈉-氯化鋁比色法。分光光度法以黃酮與鋁離子在堿性與亞硝酸存在條件下形成黃酮的鋁絡(luò)合物,生成穩(wěn)定的紅色。紅色的深淺與黃酮含量呈一定的比例關(guān)系,可以蘆丁(標(biāo)準(zhǔn)樣)作標(biāo)準(zhǔn),于510 nm波長(zhǎng)處比色定量測(cè)定。

參考樊琛等人[20]的方法。具體方法如下:準(zhǔn)確稱取105 ℃干燥恒重的蘆20.0 mg用80%乙醇定容至200 mL得濃度0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL比色管中,加30%乙醇至5.0 mL,加5% NaNO2溶液0.3 mL,搖勻放置6 min,加10% AlCl3溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min后加1 mol/L NaOH溶液4.0 mL,加水定容,搖勻放置10～15 min。以蒸餾水作空白參比,于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo),作總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線。取適量待測(cè)液,用上述方法測(cè)定。

1.3 大孔樹脂靜態(tài)分離純化實(shí)驗(yàn)

1.3.1 大孔樹脂的預(yù)處理 取適量新樹脂用95%乙醇浸泡24 h,然后裝柱,用5～8倍的乙醇通過(guò)樹脂層,洗至流出液與適量水(流出液∶水=1∶5)混合無(wú)白色渾濁現(xiàn)象,再用純凈水通過(guò)樹脂層,洗盡乙醇,最后轉(zhuǎn)入酸堿處理,即5% HCl溶液通過(guò)樹脂層,并浸泡3 h,而后用純凈水以同樣流速洗至出水pH為中性,再用5% NaOH溶液通過(guò)樹脂層,并浸泡3 h,而后用純凈水洗至出水pH呈中性。

1.3.2 靜態(tài)吸附-解吸性能實(shí)驗(yàn) 分別稱取預(yù)處理好的D-101型大孔吸附樹脂5.00 g(干重1.0742 g)于250 mL具塞磨口三角瓶中,精密加入20 mL質(zhì)量濃度為114.1 mg/L的樣液,避光密封,并置恒溫振蕩器中,在25 ℃條件下,120 r/min振蕩12 h,每1 h取適量上層液,按1.2節(jié)方法求出樣液中總黃酮質(zhì)量濃度,并繪制樹脂靜態(tài)吸附曲線。將吸附飽和的大孔樹脂用20 mL 80%乙醇溶液洗脫,每1 h取適量上層液,按1.2節(jié)方法求出樣液中總黃酮濃度,繪制出靜態(tài)洗脫曲線。計(jì)算各樹脂吸附量、吸附率與解析率。

式中:W為吸附量(mg/g);C0為吸附液初始質(zhì)量濃度(mg/mL);C1為吸附液平衡質(zhì)量濃度(mg/mL);V1為吸附液體積(mL);C2為洗脫液質(zhì)量濃度(mg/mL);V2為洗脫液體積(mL);m為樹脂干質(zhì)量(g);R為吸附率(%);S為洗脫率(%)。

1.4 動(dòng)態(tài)吸附-解吸性能優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

將預(yù)處理好的樹脂濕法裝入(1.5 cm×20 cm)玻璃層析柱中,然后將苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮提取液上柱,每20 mL收集一次流分,按1.2方法求出相應(yīng)流分的總黃酮質(zhì)量濃度,并繪制出動(dòng)態(tài)吸附曲線。待吸附樹脂吸附飽和后用去離子水洗至流出液無(wú)色,最后用乙醇洗脫,每5 mL收集一次洗脫流分,按1.2方法求出相應(yīng)洗脫流分的總黃酮質(zhì)量濃度,并繪制出動(dòng)態(tài)洗脫曲線。

1.4.1 上樣液pH對(duì)吸附效果的影響 在上樣液質(zhì)量濃度70 mg/L和上樣液流速2 mL/min條件下,考察不同上樣液pH(1、2、3、4、5)對(duì)樹脂吸附效果的影響,作pH-吸附率曲線圖。

1.4.2 吸附流速對(duì)吸附效果的影響 在上述確定的上樣液pH和上樣液質(zhì)量濃度70 mg/L的條件下,考察不同上樣液流速(1、2、3、4、5 mL/min)對(duì)樹脂吸附效果的影響,并作出吸附流速-吸附率曲線圖。

1.4.3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響 在上述確定的上樣液pH和吸附流速的條件下,考察不同上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響,并作出上樣液質(zhì)量濃度-吸附率曲線圖。

1.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取上樣液pH、吸附流速、上樣液濃度作為影響因素,根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)為三因素三水平共17個(gè)點(diǎn),這些實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為兩類:一類是自變量取值在各水平所構(gòu)成的三維析因點(diǎn),共12個(gè);一類是區(qū)域的中心點(diǎn),零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次,用來(lái)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.6 純度的測(cè)定

利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液和洗脫液中乙醇回收后,放入冷凍干燥機(jī)中干燥得到粉末,再分別稱取0.05 g苦水玫瑰精油提取廢棄物中總黃酮粗品和純化后所得粉末,放入25 mL容量瓶中,加無(wú)水乙醇充分溶解后搖勻、定容,按1.2中的方法測(cè)定吸光值,然后代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求出總黃酮的濃度,計(jì)算總黃酮純度。

式中:P為純度(%);C3為從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總黃酮的濃度(mg/mL);V3為25 mL;m為總黃酮粗品和純化后粉末的質(zhì)量50 mg。

1.7 總黃酮抗氧化性實(shí)驗(yàn)

抗氧化實(shí)驗(yàn)前將玫瑰廢水濃縮液用蒸餾水配成適當(dāng)濃度的玫瑰廢水待測(cè)液。

1.7.1 DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn) 分別精確移取2.0 mL總黃酮濃度為50、100、150、200、250、300 μg/L各待測(cè)液于10 mL試管中,分別加入2.0 mL配制好DPPH·乙醇溶液,搖勻,室溫下放置30 min,以無(wú)水乙醇調(diào)零,在517 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)1。同時(shí),精確移取2.0 mL黃酮溶液與2.0 mL無(wú)水乙醇混合后在517 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)2,然后精確移取2.0 mL配制好的DPPH·乙醇溶液與2.0 mL無(wú)水乙醇混合后在517 nm處測(cè)得吸光度值A(chǔ)0,算出待測(cè)液對(duì)DPPH的清除率,同時(shí)測(cè)定VC對(duì)DPPH的清除能力。清除率計(jì)算公式如下:

其中:A0-DPPH·乙醇溶液與無(wú)水乙醇混合后的吸光度;A1-待測(cè)液與DPPH·乙醇溶液混合后的吸光度;A2-待測(cè)液與無(wú)水乙醇混合后的吸光度。

1.7.2 ABTS自由基清除實(shí)驗(yàn) 精密吸取4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀5.00 mL,加入38.41 mg固體ABTS,溶解后定容于10 mL容量瓶中(其中過(guò)硫酸鉀濃度為2.45 mmol/L,ABTS+·濃度為7 mmol/L),存放12～16 h后,用pH=7.4磷酸緩沖液將其稀釋至A734=0.7±0.02(約稀釋90倍),得到ABTS工作液,工作液需在24 h內(nèi)使用。

分別精確移取1.0 mL不同濃度的黃酮溶液于10 mL試管中,加入A734=0.7±0.02的ABTS工作液3.00 mL,搖勻靜置10 min,于734 nm處測(cè)定吸光度,平行3次,采用同樣方法測(cè)定VC清除能力,計(jì)算清除率。

其中:A0-無(wú)水乙醇與ABTS+·溶液混合后的吸光度;A1-待測(cè)液與ABTS+·溶液混合后的吸光度;A2-待測(cè)液與無(wú)水乙醇混合后的吸光度。

1.7.3 羥基自由基清除實(shí)驗(yàn) 分別在具塞試管中依次加入9 mmo1/L FeSO4溶液2 mL,9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL,濃度為4、6、8、10、12、14 μg/mL的樣液2 mL和8.8 mmol/L H2O22 mL,搖勻,于37 ℃水浴中反應(yīng)30 min,以蒸餾水為參比,在510 nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)1,并按相同方法,測(cè)定不加樣液的溶液的吸光度A0,不加H2O2的溶液的吸光度A2,算出待測(cè)液對(duì)·OH的清除率,同時(shí)測(cè)定VC對(duì)·OH的清除率。清除率計(jì)算公式如下:

其中:A0-FeSO4、水楊酸、蒸餾水、H2O2溶液混合后的吸光度;A1-FeSO4、水楊酸、待測(cè)液、H2O2溶液混合后的吸光度;A2-FeSO4、水楊酸、蒸餾水、待測(cè)液混合后的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個(gè)平行,數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2007(Microsoft Office 2007,Microsoft Co.,Redmond,USA)進(jìn)行處理,Design-Expert. V 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表2 靜態(tài)吸附容量、吸附率與洗脫率Table 2 Static adsorption capacity,adsorption rate and elution rate

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示,總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程(以蘆丁計(jì)):A=11.436C+0.0008,R2=0.9999,結(jié)果表明在0.005～0.05 mg/mL之間線性良好。

圖1 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of total flavonoids

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附洗脫實(shí)驗(yàn)

2.2.1 吸附容量、吸附率及洗脫率 由表2可看出,D-101型大孔吸附樹脂不僅有較大的吸附率,還有較高的洗脫率。

2.2.2 靜態(tài)吸附曲線 由圖2可知,D-101型大孔吸附樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮的吸附為快速平衡型,起始階段大孔樹脂對(duì)廢棄物的總黃酮吸附較強(qiáng),黃酮質(zhì)量濃度增加較快,在1 h后基本達(dá)到平衡,由此可見,D-101型大孔吸附樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮具有良好的吸附動(dòng)力學(xué)特性。

圖2 大孔樹脂靜態(tài)吸附曲線Fig.2 Static adsorption curve of macroporous resin

2.2.3 靜態(tài)洗脫曲線 從圖3可以看出,D-101型大孔吸附樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮的洗脫為快速平衡型,起始階段總黃酮質(zhì)量濃度較大,在1 h后基本洗脫完全。1 h后曲線有些許波動(dòng),是由于樹脂對(duì)洗脫液中的黃酮再次吸附,再次洗脫,這樣循環(huán)往復(fù)。

圖3 大孔樹脂靜態(tài)洗脫曲線Fig.3 Static elution curve of macroporous resin

綜上分析可知,D-101型樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮具有良好的吸附洗脫特性,適合苦水玫瑰精油提取廢棄物總黃酮的分離純化。

2.3 動(dòng)態(tài)吸附單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 上樣液pH對(duì)吸附效果的影響 根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)調(diào)整上樣液pH,可達(dá)到較好的吸附效果。在上樣液質(zhì)量濃度70 mg/L和上樣液流速2 mL/min條件下,考察不同上樣液pH對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖4與圖5。

圖4 大孔樹脂對(duì)不同pH上樣液的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.4 The dynamic adsorption curve of the resin on different pH samples

圖5 不同上樣液pH對(duì)樹脂吸附效果的影響Fig.5 Effect of different sample solution pH on the adsorption of resin

由圖4可以看出,pH4、pH5在上樣60 mL時(shí)已出現(xiàn)少量滲漏,而pH1、pH2、pH3在上樣量達(dá)到80 mL時(shí)才發(fā)現(xiàn)滲漏點(diǎn),pH2和pH3的動(dòng)態(tài)吸附曲線基本重疊。并且圖5顯示pH2和pH3吸附率最高。從工業(yè)生產(chǎn)角度考慮,選擇pH3進(jìn)行吸附比較合適。這是因?yàn)辄S酮類化合物含多羥基,呈弱酸性,故要達(dá)到較好的吸附效果,吸附需在pH3條件進(jìn)行。

2.3.2 上樣液流速對(duì)吸附效果的影響 在上樣液pH3和上樣液質(zhì)量濃度70 mg/L的條件下,考察不同上樣液流速對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖6、圖7。

圖6 大孔樹脂對(duì)不同流速的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.6 Dynamic adsorption curves of different flow rate of macroporous resin

圖7 不同流速對(duì)樹脂吸附效果的影響Fig.7 Effect of different flow rate on the adsorption of resin

由圖6可知,流速為1、2、3、4、5 mL/min時(shí),滲漏點(diǎn)分別出現(xiàn)在80、70、62、50、40 mL附近。圖6表明流速為1 mL/min時(shí)吸附率最高,達(dá)到79.63%。雖然流速0.5 mL/min時(shí),滲漏點(diǎn)可能出現(xiàn)的更遲,吸附率可能更高,但因?yàn)榱魉俾?導(dǎo)致循環(huán)周期延長(zhǎng),不適用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)。因此,選擇上樣液流速為1 mL/min。

2.3.3 上樣液質(zhì)量濃度對(duì)吸附效果的影響 在上樣液 pH3和上樣液流速1 mL/min條件下,考察不同上樣液質(zhì)量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響,結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 大孔樹脂對(duì)不同濃度上樣液的動(dòng)態(tài)吸附曲線Fig.8 The dynamic adsorption curve of the resin on different concentrations of sample solution of macroporous resins

圖9 不同上樣量濃度對(duì)樹脂吸附效果的影響Fig.9 Effect of different concentration sample on the adsorption of resin

由圖8可知,30、50、70、90、100 mg/L上樣液濃度的滲漏點(diǎn)分別在120、100、78、70、65 mL,且質(zhì)量濃度為30 mg/L的上樣液吸附率最高。故選擇上樣液質(zhì)量濃度為30 mg/mL。

2.4 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化動(dòng)態(tài)吸附工藝條件

2.4.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析 運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可得出三因素與吸附率之間的多元二次方程關(guān)系式吸附率(%)=86.73-0.81A+0.21B-4.83C-0.99AB-0.61AC-0.38BC+0.79A2-0.20B2+1.88C2。

表3 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Experimental results and analysis of response surface method

表4 方差分析Table 4 Variance Analysis

由表4可知,該響應(yīng)回歸模型顯著,失擬項(xiàng)不顯著;方差R2=0.9947,表明99.47%的數(shù)據(jù)可以用此方程來(lái)解釋。通過(guò)該模型的方差分析可知:上樣pH(A)、吸附流速(B)、上樣液濃度(C)對(duì)總黃酮吸附率影響差異均顯著,影響效應(yīng)的大小依次為上樣液濃度(C)>上樣pH(A)>吸附流速(B)。

2.4.2 兩因素交互影響吸附率的響應(yīng)曲面分析 吸附率對(duì)應(yīng)于上樣pH、吸附流速、上樣液濃度所形成的三維空間曲面,可直接反映上樣pH、吸附流速、上樣液濃度以及它們之間的交互作用對(duì)吸附率的影響。

運(yùn)用Design Expert 8.0.6軟件分析得到的響應(yīng)曲面如圖10所示。在上樣pH、吸附流速、上樣液濃度所形成的三維空間曲面上，任意兩者的交互作用對(duì)吸附率影響的曲線越斜，說(shuō)明二者的交互作用對(duì)吸附率的影響越大。由圖10a和圖10b可以看出上樣pH與吸附流速的交互作用、上樣pH與上樣液濃度的交互作用對(duì)吸附率的影響呈現(xiàn)的是一個(gè)斜面說(shuō)明兩者的交互作用對(duì)吸附率影響較大。由圖10c得出，吸附流速與上樣液濃度的交互作用對(duì)吸附率的影響不明顯。所以，上樣pH與吸附流速的交互作用、上樣pH與上樣液濃度的交互作用對(duì)吸附率的影響較大，與表4結(jié)果相同。

圖10 響應(yīng)曲面圖Fig.10 Response surface plot

2.4.3 回歸方程及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 借助Design Expert 8.0.6軟件中多元二次回歸模型對(duì)總黃酮吸附率進(jìn)行估算,對(duì)二次函數(shù)模型進(jìn)行極值分析,預(yù)測(cè)三因素的最佳組合為:pH2.12,吸附流速1.72 mL/min,上樣液濃度10.4 mg/L,此時(shí)模型預(yù)測(cè)極大值為95.0635%。在最優(yōu)吸附條件的基礎(chǔ)上進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表5。

2.5 動(dòng)態(tài)洗脫實(shí)驗(yàn)

由圖11可知,無(wú)水乙醇溶液通過(guò)約15 mL時(shí)總黃酮開始被洗脫下來(lái),之后在25 mL附近時(shí)迅速達(dá)到高峰,通過(guò)60 mL后,吸附在樹脂上的總黃酮基本被洗脫下來(lái)，解析率達(dá)98.30%，洗脫曲線出峰快,且無(wú)明顯的拖尾現(xiàn)象。

2.6 產(chǎn)品純度測(cè)定

由表6可知,經(jīng)純化后,純度由原來(lái)的1.220%提高到了5.651%,提高至4.63倍。

2.7 玫瑰廢水總黃酮的抗氧化性

自由基清除能力是物質(zhì)抗氧化活性主要表現(xiàn)之一。由于自由基含有未配對(duì)電子,極不穩(wěn)定,所以化學(xué)性質(zhì)十分活躍,能迅速而強(qiáng)烈的損傷生物機(jī)體,導(dǎo)致機(jī)體功能障礙和疾病的發(fā)生,自由基的清除作用實(shí)驗(yàn),可研究玫瑰廢水總黃酮提取物的抗氧化性,尋找黃酮的藥效機(jī)理。目前,有關(guān)玫瑰廢水黃酮的抗氧化活性的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸為參照,研究了黃酮樣品對(duì)DPPH·、ABTS+·和·OH 清除活性。

表5 響應(yīng)面驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 5 Response surface verification experiment

表6 玫瑰精油提取后廢水中總黃酮純度Table 6 The purity of the total flavonoids after the extract of rose essential oil

圖11 動(dòng)態(tài)洗脫曲線Fig.11 Dynamic elution

2.7.1 對(duì)DPPH自由基的清除作用 如圖12所示,玫瑰廢水中黃酮、VC對(duì)DPPH·的清除活性均隨濃度的增大而逐漸增大,量效關(guān)系顯著。在濃度為0～300 μg/L范圍內(nèi),玫瑰廢水中黃酮對(duì)DPPH·的最大清除率為89.76%;在濃度為0～50 μg/mL范圍內(nèi),VC對(duì)DPPH·的最大清除率為82.72%;玫瑰廢水中黃酮、VC清除DPPH·的IC50值分別為0.1、7 μg/mL,玫瑰水中黃酮的清除DPPH·能力是VC的70倍，說(shuō)明玫瑰廢水中黃酮有很強(qiáng)的抗氧化功效。

圖12 DPPH自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rate

2.7.2 對(duì)ABTS自由基的清除作用 如圖13所示,玫瑰廢水中黃酮、VC對(duì)ABTS+·的清除活性均隨濃度的增大而逐漸增大,量效關(guān)系顯著。在濃度為0～120 μg/L范圍內(nèi),玫瑰廢水中黃酮對(duì)ABTS+·的最大清除率為98.96%,在濃度為0～16 μg/mL范圍內(nèi),VC對(duì)ABTS+·的最大清除率為89.14%;玫瑰廢水中黃酮、VC清除ABTS+·的IC50值為0.03、6.5 μg/mL,玫瑰廢水中黃酮比VC的抗氧化強(qiáng),是VC的216倍。

圖13 ABTS自由基清除率Fig.13 ABTS free radical scavenging rate

2.7.3 對(duì)羥基自由基的清除作用 如圖14所示,玫瑰廢水中黃酮、VC對(duì)·OH的清除活性均隨濃度的增大而逐漸增大,量效關(guān)系顯著。在濃度為0～14 μg/mL范圍內(nèi),玫瑰廢水中黃酮對(duì)·OH的最大清除率為65.45%,在濃度0～700 μg/mL范圍內(nèi),VC對(duì)·OH的最大清除率為99.77%;其IC50值分別為8、200 μg/mL,玫瑰廢水中黃酮的抗氧化活性強(qiáng)于VC的抗氧化活性,大約是VC的25倍。

圖14 ·OH自由基清除率Fig.14 OH free radical scavenging rate

3 結(jié)論

本研究通過(guò)靜態(tài)吸附-解析實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)D101型樹脂對(duì)苦水玫瑰精油提取后廢棄物中黃酮類化合物有較好的吸附和解析能力,之后在單因素動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦水玫瑰精油提取后廢棄物中總黃酮分離純化工藝,最終確定最優(yōu)的純化條件為上樣液pH2.12、上樣液質(zhì)量濃度10.4 mg/L、上樣液流速1.72 mL/min,優(yōu)化后吸附率達(dá)到95.06%,解析率達(dá)到98.30%。

苦水玫瑰精油提取后廢棄物中黃酮對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基具有較強(qiáng)的清除能力,表明苦水玫瑰精油提取后廢棄物中黃酮有很強(qiáng)的抗氧化性,為玫瑰廢水中有效成分的開發(fā)利用提供依據(jù)。

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Response surface optimization and purification technology and antioxidant activity of total flavonoids from Kushui rose oil distillation waste

LU Xiu-yun1,WANG Bo2,CAO Jia-min3,LI Guang1,GONG Xiang3,ZHOU Wei1,2,3,*

(1.College of Geography and Environmental Science,Northwest Normal University,Lanzhou 730070,China;2.Central Laboratory of Technical Center of Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Lanzhou 730020,China;3.College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

Objective:To investigate response surface optimization and purification technology and antioxidant activity of total flavonoids from Kushui rose oil distillation waste,and provide the basis for the recovery of total flavonoids from Kushui rose oil distillation waste. Methods:Studying on D101 resin adsorption and desorption ability for flavonoids compounds by static experiment,then based on dynamic experiment of single factors,the optimum purification process parameters of Kushui rose oil distillation waste by response surface method. On this basis,with vitamin C(VC)as the control,study the scavenging ability of total flavonoids purified on ABTS,DPPH,and OH free radical. Results:The static adsorption capacity was 1.83 mg/g,the adsorption rate was 86.10%,the elution rate of 88.07%,which indicated that D101 resin had better adsorption and desorption ability for flavonoids compounds of Kushui rose oil distillation waste. And the optimum dynamic adsorption process parameter were the sample solution pH2.12,sample concentration 10.4 mg/L,sample flow rate 1.72 mL/min,the adsorption rate was 95.06%,elution with 60 mL absolute alcohol solution,the desorption rate reached 98.30%,the purity of total flavonoids was up to 5.651%. The IC50value of total flavonoids purified on ABTS,DPPH,OH free radical were 0.03,0.1,8 μg/mL,the maximum scavenging rate were 98.96%,89.76%,65.45%,we can see that the total flavonoids from waste has better antioxidant activity.

Kushui rose oil distillation waste;total flavonoids;response surface;separation and purification;antioxidant activity

2016-12-06

陸秀云(1991-)，女，碩士，研究方向：液相色譜質(zhì)譜分析食品、環(huán)境中的有機(jī)物質(zhì)以及廢棄物循環(huán)利用研究，E-mail:lu1058258184@163.com。

*通訊作者:周圍(1957-)，男，博士，教授，研究方向：從事食品營(yíng)養(yǎng)及食品安全分析研究，E-mail:zhouwei845@163.com。

甘肅省科技與支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè)類)(1604NKCA079)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)11-0258-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.041