響應(yīng)面法優(yōu)化多汁乳菇多糖提取工藝及抗氧化活性研究

黃 娟，黃燕燕，劉冬梅，*，陳素芹，潘偉才

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.深圳市大百匯技術(shù)有限公司,廣東深圳 518081)

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響應(yīng)面法優(yōu)化多汁乳菇多糖提取工藝及抗氧化活性研究

黃 娟1，黃燕燕1，劉冬梅1，*，陳素芹2，潘偉才2

(1.華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510640;2.深圳市大百匯技術(shù)有限公司,廣東深圳 518081)

多汁乳菇,多糖,提取,響應(yīng)面,抗氧化活性

多汁乳菇(LactariusvolemusFr.),俗名牛奶菇,是可食用的野生真菌,隸屬于擔(dān)子菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬,是樹木的外生菌根菌,由于其獨特的風(fēng)味而被廣泛地應(yīng)用于煙草及食品中[1-3]。研究發(fā)現(xiàn),多汁乳菇含16種氨基酸,總量為14335.3 mg/100 g,其中8種為人體必需氨基酸,含量為5938. 2 mg/100 g,含有Si、Fe、Na、Zn、Mg、Mn、Cu、Al、Ti等多種人體必需的礦物質(zhì)元素且其水提物可以增強人體免疫力、對小白鼠肉瘤S-180、艾氏癌的抑制率分別達(dá)到了80%和90%[4-6]。

大量研究表明多糖具有廣泛的抗菌、抗氧化、抗疲勞、降血糖血脂、抗病毒、抗癌等生理活性,但多汁乳菇多糖(Lactariusvolemuspolysaccharide,LVP)作為一種新型活性物質(zhì),卻鮮少有關(guān)于其提取工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、構(gòu)效關(guān)系、生理活性等方面的報道[7-8]。多糖的提取方法較多,常見的有酶提法、水提法、酸提法、堿提法、微波輔助及超聲波輔助法[9]。酶制劑價格昂貴,不適宜工業(yè)制備應(yīng)用;酸提和堿提會對多糖的活性造成一定的破壞作用;雖然水提法費時長、耗能高,但其能最大程度地保護(hù)多糖的生物活性;微波和超聲波輔助是一種新型的輔助技術(shù)。近年,超聲波技術(shù)廣泛應(yīng)用于天然活性物質(zhì)的提取,可節(jié)省浸提溶劑,提高效率,已經(jīng)被國內(nèi)外很多提取工業(yè)應(yīng)用[10]。目前,國內(nèi)外有關(guān)應(yīng)用超聲波技術(shù)對 LVP提取及抗氧化活性的研究報道較少,目前僅張水花[8]等人通過正交設(shè)計法優(yōu)化了多汁乳菇多糖的微波輔助提取工藝并對多汁乳菇多糖的DPPH自由基清除活性進(jìn)行了測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多汁乳菇干子實體 云南市場采購;無水乙醇 廣州卯林儀器有限公司;抗壞血酸(VC)、二苯基苦味酰基苯肼(DPPH)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、H2O2、焦棓酸、三羥基甲基氨基甲烷(Tris)、HCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、FeSO4、水楊酸、過硫酸鉀 廣州藍(lán)澤生物科技有限公司(所有試劑均為分析純)。

RT-25超細(xì)粉碎機(jī) 上海比儀器制造有限公司;RE-5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器有限公司;SJIA-10N冷凍干燥機(jī) 寧波市雙嘉儀器源頭廠家;7200紫外分光光度計 尤尼克(上海)儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多汁乳菇多糖的提取與精制 多汁乳菇干子實體粉碎過200目篩→無水乙醇、石油醚90 ℃下回流脫除脂溶性成分→抽濾→濾渣烘干→100 W超聲波輔助提取10 min[10]→離心取濾液→減壓蒸發(fā)濃縮→乙醇過夜沉淀→離心得粗多糖沉淀→75%乙醇洗滌沉淀→復(fù)溶于水→(單因素實驗檢測用的多糖樣品溶液Y1)→Sevag試劑(正丁醇∶氯仿=1∶4(v/v))除蛋白→離心取上層多糖水相→二次醇沉→離心→洗滌多糖沉淀→復(fù)溶于少量水→真空冷凍干燥→復(fù)溶于水→離心除不溶物→多汁乳菇多糖精品Y2。

1.2.2 多汁乳菇多糖檢測方法

1.2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參照文獻(xiàn)采用苯酚-硫酸法[11]完成,得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=8.4986x-0.0186,y表示糖溶液在490 nm下的吸光值,x表示糖溶液的濃度,在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi),其線性相關(guān)系數(shù)為0.9902。

1.2.2.2 多汁乳菇多糖測定 移取少量的1.2.1中所述的Y2溶液,分別采用I2-KI、α-萘酚對淀粉及多糖進(jìn)行檢測驗證,并采用凱氏定氮法[12]對多糖粗品中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測,采用上述苯酚-硫酸法對Y1和Y2樣品中的多糖含量進(jìn)行檢測,分別按式(1)和式(2)計算多糖得率和多糖的純度。

多糖得率(%)=c1n1V1/m×100

式(1)

多糖純度(%)=c2V2/m1×100

式(2)

其中,c1為Y1樣品稀釋液對應(yīng)的多糖濃度(mg/mL),V1為Y1樣品稀釋液體積(mL),n1為Y1樣品稀釋倍數(shù),m為原材料菇粉的質(zhì)量(mg);c2為精制品Y2稀釋液濃度(mg/mL),V2為精制品Y2稀釋液體積(mL),m1為精制品Y2的質(zhì)量(mg)。

1.2.3 單因素實驗 精確稱取(2.0±0.01) g多汁乳菇子實體粉末于錐形瓶,按液料比為30∶1 mL/g的比例加入水浸提溶劑,分別于40、50、60、70、80、90、100 ℃的磁力攪拌水浴鍋中恒溫浸提3 h,探究浸提溫度對多汁乳菇多糖得率的影響;同樣地,按液料比為30∶1 mL/g的比例加入水浸提溶劑,在90 ℃的磁力攪拌水浴鍋中分別恒溫浸提0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、3.5、4.0、5.0 h,探究浸提時間對多汁乳菇多糖得率的影響;分別按液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1、50∶1 mL/g依次加入水浸提溶劑,在90 ℃的磁力攪拌水浴鍋中恒溫浸提3 h,探究液料比對多汁乳菇多糖得率的影響。所有實驗組別均按照1.2.1所述工藝進(jìn)行。

1.2.4 響應(yīng)面法實驗設(shè)計 依據(jù)1.2.3實驗結(jié)果,按表1進(jìn)行三因素三水平的CCD中心組合實驗,包含了20組,所得數(shù)據(jù)通過式(3)進(jìn)行曲面擬合[13-14]。

Y=k0+k1A+k2B+k3C+k4AB+k5AC+k6BC+k7A2+k8B2+k9C2

式(3)

其中,Y為響應(yīng)值,k1～k9均為多項式系數(shù),在實際響應(yīng)面和等值線圖基礎(chǔ)上回歸分析確立,A、B、C為獨立變量的水平編碼值。

表1 多汁乳菇多糖提取CCD因素水平設(shè)計Table 1 Factors and levels in response surface designfor extraction of crude polysaccharides from wild Lactarius volemus

1.2.5 多汁乳菇粗多糖的抗氧化活性研究

式(4)

其中,A2為加入了焦棓酸與樣品的實驗組所得吸光值,A0只加入焦棓酸的對照組,A1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加焦棓酸的Tris-HCl作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～5000 μg/mL的多糖溶液和0～2000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.2 ·OH清除活性的測定 在文獻(xiàn)[15]基礎(chǔ)上改進(jìn)實驗條件,移取2 mL的9 mmol/L的FeSO4與2 mL的9 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液混合,加入2 mL樣品溶液及2 mL 0.024%(w/w)H2O2溶液,室溫下放置3 min后于560 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

·OH清除活性(%)=100×[1-(B2-B1)/B0]

式(5)

其中,B2為加入了H2O2與樣品的實驗組所得吸光值,B1為僅加入了樣品的對照組,B0則為僅加入了H2O2的對照組,均以不加樣品不加H2O2的組別作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～500 μg/mL的多糖溶液和0～1000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.3 DPPH自由基清除活性的測定 在文獻(xiàn)[15]基礎(chǔ)上改進(jìn)實驗條件,移取2 mL的10 μmol/L DPPH·與2 mL樣品液混合,室溫黑暗條件下放置3 min,于517 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

DPPH自由基清除活性(%)=100×[1-(C2-C1)/C0]

式(6)

其中,C2為加入了DPPH·與樣品的實驗組所得吸光值,C0只加入DPPH·的對照組,C1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加DPPH·的H2O作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～20 μg/mL的多糖溶液和0～1000 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.5.4 ABTS自由基清除活性的測定 在文獻(xiàn)[16]基礎(chǔ)上改進(jìn)實驗條件,配制7.4 mmol/L ABTS和2.6 mmol/L K2S2O8水溶液,等體積混合于黑暗條件下放置12 h,稀釋40～50倍使其在734 nm下的吸光值達(dá)0.700±0.002,即為ABTS+·液,移取此ABTS+·液2.4 mL與0.6 mL的樣品液混合,于室溫下放置1 min,于734 nm下測定各組吸光值,并計算其清除活性:

ABTS+自由基清除活性(%)=100×[1-(D2-D1)/D0]

式(7)

其中,D2為加入了ABTS+·與樣品的實驗組所得吸光值,D0只加入ABTS+·的對照組,D1僅加入了樣品的對照組,均以不加樣品不加ABTS+·的無水乙醇作空白對照,且所用樣品溶液分別為0～20 μg/mL的多糖溶液和0～800 μg/mL的VC溶液,VC作陽性對照用。

1.2.6 統(tǒng)計分析 實驗分析所用數(shù)據(jù)是三組平行實驗的均值±標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 17.0進(jìn)行平行數(shù)據(jù)及組間數(shù)據(jù)之間的顯著性分析,并利用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

如圖1A所示,在40～100 ℃ 浸提溫度范圍內(nèi),多糖得率隨著溫度的升高而升高,可能原因是在此溫度范圍內(nèi)作用多汁乳菇子實體粉末,升高溫度加快了真菌細(xì)胞質(zhì)壁分離的速度,此時,液泡中的物質(zhì)(包括多汁乳菇多糖)穿過細(xì)胞壁,擴(kuò)散到外部溶劑水中的速度也隨之加快[17-18]。在80～100 ℃ 浸提溫度范圍內(nèi),多汁乳菇多糖得率達(dá)到2.12%～2.29%相對較高水平,表明浸提溫度是影響多汁乳菇多糖得率的關(guān)鍵因素之一。

圖1 浸提溫度(A)、浸提時間(B)、液料比(C)對多糖得率的影響Fig.1 Effect of temperature(A),time(B)and ratio of water to material(C)on yield of LVP

如圖1B所示,在0.5～5 h 浸提時間范圍內(nèi),多糖得率隨著時間的推移先升高后有所降低,可能原因是作用時間越長,對多汁乳菇子實體細(xì)胞壁的破壞越充分,促使了多糖的釋放,但超出一定的作用時間,多糖結(jié)構(gòu)將受到一定程度的破壞而降低多糖得率[17-18]。在2～4 h浸提時間范圍內(nèi),多汁乳菇多糖產(chǎn)量達(dá)到2.06%～2.32%相對較高水平,表明浸提時間是影響多汁乳菇多糖得率的關(guān)鍵因素之一。

如圖1C所示,在10～50 mL/g液料比范圍內(nèi),隨著液料比的增大,多糖得率先升高至2.29%,后降低至1.68%,可能原因是,液料比增大促使多汁乳菇子實體粉末與提取溶劑的接觸面積增加,從而使得多糖在水中的溶解量增加,但當(dāng)液料比超出一定范圍時,多汁乳菇多糖在水中的溶解量達(dá)到飽和狀態(tài)[17-18],從而導(dǎo)致多糖得率有所降低。在20～40 mL/g液料比范圍內(nèi),多汁乳菇多糖得率達(dá)到1.55%～2.29%相對較高水平,表明液料比是影響多汁乳菇多糖得率的關(guān)鍵因素之一。

2.2 響應(yīng)面法設(shè)計對多汁乳菇多糖得率的影響

依據(jù)CCD模型,評判浸提溫度、浸提時間及料液比三因素對多糖得率的影響程度,結(jié)果如表2所示。多重回歸分析揭示了多糖得率響應(yīng)值與實驗變量之間的關(guān)系,可通過如下的表達(dá)式進(jìn)行描述:

Y(%)=2.24+0.043A+0.095B+0.098C-0.14AB+0.17AC+0.087BC-0.33A2-0.049B2-0.26C2

式(8)

其中,A、B、C分別取浸提溫度、浸提時間及液料比的編碼值。

表2 CCD實驗真實值與擬合方程預(yù)測值Table 2 Forecast values by fitting equation and real values of CCD experiments

式(8)中的三個變量參數(shù)對多糖得率影響的顯著性可通過表3中的F值和p進(jìn)行表征,當(dāng)F值絕對值越大時,p越小,兩組數(shù)據(jù)之間具有明顯的一致性。按p<0.05進(jìn)行篩選,易知,對于多糖得率影響較大的有B、C、AB、AC、A2、C2。模型對應(yīng)的顯著性水平遠(yuǎn)小于0.01,說明此模型用于擬合分析A、B、C三因素對多糖得率的影響是具有顯著性的,即該模型是適宜的。該模型缺少的擬合值的顯著性為0.3307,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于0.05,這說明缺乏的擬合值并不重要。該模型對應(yīng)的R2為0.9344,接近于1,表明此模型與真實數(shù)據(jù)之間具有良好的適用性。綜上可知,該回歸模型較好地定義了該系統(tǒng)中各因素與多糖得率之間的關(guān)系及任意兩個變量之間的相互聯(lián)系。圖2為三維響應(yīng)曲面和等高線圖，如圖2a所示,當(dāng)液料比處于0這個中間層次時,觀察浸提溫度和浸提時間之間形成的等高線圖,呈明顯的橢圓形狀,表明二者的交互作用對多糖得率有顯著性的影響(p<0.05),同樣的現(xiàn)象可在圖2b中觀察到，這表明浸提溫度和液料比的交互作用對多糖得率也有顯著的影響,與表2中的實驗結(jié)果一致。

通過建立這個CCD模型進(jìn)行多糖得率的預(yù)測分析,得出多汁乳菇多糖最高得率預(yù)測值為2.32%,對應(yīng)于如下條件:89.69 ℃的浸提溫度,4 h的浸提時間,33.42 mL/g 的液料比,根據(jù)實驗的可操作性,實際采用參數(shù)為:浸提溫度90 ℃,浸提時間4 h,液料比33∶1 mL/g,對應(yīng)實際多糖得率為2.18%,與預(yù)測值無顯著性差異(p>0.05)。并采用I2-KI溶液、α-萘酚對所得多汁乳菇多糖提取物進(jìn)行了淀粉及多糖驗證分析,結(jié)果顯示,多汁乳菇多糖提取物中不含有淀粉,確實含有多糖;分別采用凱氏定氮法、苯酚-硫酸法檢測所得提取物,顯示蛋白含量為11.37%,多糖純度為55.40%。

表3 CCD實驗結(jié)果的方差分析Table 3 Variance analysis of CCD experimental results

圖2 多糖提取因素實驗的CCD擬合響應(yīng)曲面分析圖及等高線圖Fig.2 CCD fitting response surface and contour plots analysis for polysaccharide extraction factor experiments

2.3 多汁乳菇粗多糖的抗氧化活性

2.3.2 多汁乳菇多糖對·OH的清除活性 ·OH很容易穿過細(xì)胞膜,導(dǎo)致組織病理特征的出現(xiàn)和細(xì)胞死亡,因此清除·OH尤為重要。VC和多汁乳菇多糖清除·OH的活性在圖3B中給出,結(jié)果表明,·OH清除活性隨著多糖濃度的增加而增加,當(dāng)多糖濃度為1000 μg/mL時,其清除活性高達(dá)95.56%,多汁乳菇多糖及VC對·OH清除活性的IC50值分別為:280.00、178.10 μg/mL,低于文獻(xiàn)[20]報道的新型冬蟲夏草多糖的IC50值0.76 mg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的·OH清除活性。

2.3.3 多汁乳菇多糖對DPPH自由基的清除活性 DPPH自由基很容易接受抗氧化劑而被清除,是一種在517 nm下有最大吸收的穩(wěn)定自由基,其被廣泛地應(yīng)用于天然分子自由基清除活性的測定反應(yīng)中。多汁乳菇多糖和VC分子清除DPPH自由基的活性見圖3C,結(jié)果表明,其清除活性也與樣品的濃度有關(guān),且樣品的清除活性低于VC,當(dāng)多糖濃度為1000 μg/mL時,其清除活性高達(dá)95.62%,多汁乳菇多糖及VC對DPPH清除活性的IC50值分別為:342.06、5.90 μg/mL,二者分別低于文獻(xiàn)[7]中的報道值665、18 μg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的DPPH自由基清除活性。

2.3.4 多汁乳菇多糖對ABTS自由基的清除活性 VC和多汁乳菇多糖清除ABTS自由基活性如圖3D所示,在多糖濃度為100～800 μg/mL的范圍內(nèi),其清除活性與多糖的濃度呈正相關(guān)作用,且清除活性最高為98.89%,多汁乳菇多糖及VC對ABTS清除活性的IC50值分別為:167.65、10.57 μg/mL,稍低于文獻(xiàn)[20]報道的新型冬蟲夏草多糖的IC50值0.22 mg/mL,表明多汁乳菇多糖具有良好的ABTS自由基清除活性。

圖3 樣品對各種自由基的清除活性分析Fig.3 The scavenging activity of samples on four radicals

3 結(jié)論

本文對多汁乳菇多糖的提取條件進(jìn)行了CCD優(yōu)化處理,最終確立了其最優(yōu)提取條件為:浸提溫度90 ℃,浸提時間4 h,液料比33∶1 mL/g。在最優(yōu)提取條件下,多汁乳菇多糖得率達(dá)2.18%,與預(yù)測值一致,且稍高于文獻(xiàn)[7]報道值2.09%±0.03%,證明本文對多汁乳菇多糖的提取工藝采取的優(yōu)化處理是有效的。

通過對多汁乳菇多糖粗品檢測驗證分析,證實此粗品確實含有多糖,且多糖純度為55.40%。

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Optimization of extraction process of polysaccharides from wildLactariusvolemusby response surface method and investigation of antioxidant activity

HUANG Juan1，HUANG Yan-yan1，LIU Dong-mei1，CHEN Su-qin2，PAN Wei-cai2

(1.Institute of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China；2.DaBaihui Company of Technology,Shenzhen 518081,China)

LactariusVolemus;polysaccharides;extraction;response surface design;antioxidant activity

2016-12-29

黃娟 (1991-)，女，碩士，研究方向：食品微生物利用與控制，E-mail:juanhuangscut@126.com。

*通訊作者:劉冬梅 (1972-)，女，博士，副教授，主要從事食品微生物利用與控制研究，E-mail:liudm@scut.edu.cn。

深圳市未來產(chǎn)業(yè)專項資金項目(CXZZ20140902155219302)；國家自然科學(xué)基金項目 (31101254)；廣東省科技計劃項目(2014A020208019)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)11-0055-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.11.002