松楊柵銹菌無(wú)毒基因型性狀分離及AvrL567同源序列分析

余仲東 陳祖靜 曹支敏 任爭(zhēng)爭(zhēng) 馮世強(qiáng) 張瑤琦

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣州 510642； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院 楊凌 712100； 4.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫局 沈陽(yáng) 110804； 5.沈陽(yáng)市渾南區(qū)林業(yè)局 沈陽(yáng) 110163)

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松楊柵銹菌無(wú)毒基因型性狀分離及AvrL567同源序列分析

余仲東1陳祖靜2曹支敏1任爭(zhēng)爭(zhēng)3馮世強(qiáng)4張瑤琦5

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院 楊凌 712100； 2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院 廣州 510642； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院 楊凌 712100； 4.遼寧省林業(yè)有害生物防治檢疫局 沈陽(yáng) 110804； 5.沈陽(yáng)市渾南區(qū)林業(yè)局 沈陽(yáng) 110163)

【目的】 分析松楊柵銹菌小種無(wú)毒基因型性狀分離規(guī)律和其無(wú)毒基因序列與歐美小種無(wú)毒基因序列的差異和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系?！痉椒ā?以秦嶺厚畛子落葉松上松楊柵銹菌2號(hào)小種HZ3542的性子器為雄性親本，與秦嶺火地塘落葉松上2號(hào)小種HF2369性子器為雌性親本進(jìn)行人工有性雜交，初步獲得F1代銹孢子堆。通過(guò)對(duì)太白楊離體葉片接種反應(yīng)型統(tǒng)計(jì)，分析松楊柵銹菌2號(hào)生理小種無(wú)毒基因型，并根據(jù)亞麻銹菌無(wú)毒基因AvrL567(accession： AAS66952)設(shè)計(jì)和篩選引物，利用同源擴(kuò)增技術(shù)，對(duì)松楊柵銹菌無(wú)毒基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序、比對(duì)后構(gòu)建最大似然系統(tǒng)樹(shù)?！窘Y(jié)果】 2號(hào)生理小種無(wú)毒基因表現(xiàn)型符合孟德?tīng)柗蛛x定律，來(lái)自秦嶺厚畛子太白楊不親和性親本為Aa無(wú)毒基因型，來(lái)自秦嶺火地塘的親和性親本為aa基因型。在F1代銹孢子堆群體(P=0.01)和F1代夏孢子堆群體(P=0.05)中，抗∶感表現(xiàn)型均按1∶1分離。無(wú)毒基因型以壞死斑有無(wú)和褪綠斑大小為重要標(biāo)準(zhǔn)，潛育期長(zhǎng)短和夏孢子堆密度、直徑大小等數(shù)量性狀為輔助標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，并在PCR擴(kuò)增中得到檢驗(yàn)和證實(shí)。篩選引物對(duì)AvrPr1(5′-TAATCCTCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCGCTC-3′，Tm=53.5 ℃)可以穩(wěn)定擴(kuò)增出800～900 bp的產(chǎn)物。ML系統(tǒng)樹(shù)表明，真菌無(wú)毒基因序列總體上同源性較低，但本研究所供試的17條序列可分為2個(gè)群，柵銹菌無(wú)毒基因序列聚在一個(gè)分支上，其中5條中國(guó)松楊柵銹菌無(wú)毒基因序列同加拿大2條MLP無(wú)毒基因序列聚在同一個(gè)亞分枝上，另一條序列與法國(guó)松楊柵銹菌、美國(guó)亞麻銹菌等菌聚在另一個(gè)亞分支上?！窘Y(jié)論】 中國(guó)松楊柵銹菌2號(hào)小種無(wú)毒基因?yàn)閱物@性遺傳，其無(wú)毒基因序列同加拿大的小種無(wú)毒基因序列同源性高。

松楊柵銹菌； 無(wú)毒基因； 遺傳分離； 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

無(wú)毒基因在病原物-寄主互作中，是影響寄主對(duì)小種垂直抗病性選擇的關(guān)鍵因子。無(wú)毒基因編碼激發(fā)子，與寄主抗病基因編碼蛋白直接或間接識(shí)別和結(jié)合后產(chǎn)生信號(hào)分子，從而引起或誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生過(guò)敏性壞死反應(yīng)(Flor, 1971)，使寄主細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、消解，或產(chǎn)生活性氧，或產(chǎn)生病程相關(guān)蛋白誘導(dǎo)寄主防衛(wèi)基因表達(dá)(Dangl, 1994)。也有人認(rèn)為無(wú)毒基因直接編碼毒性因子，殺死寄主細(xì)胞從而獲取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(Laugeetal., 1998)。在丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的Ⅲ型誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)中(Haucketal., 2003)，AvrPto與Pto相結(jié)合并改變接受蛋白空間結(jié)構(gòu)，從而激發(fā)包括活性氧爆發(fā)、基因表達(dá)、細(xì)胞壁加固等一系列防衛(wèi)反應(yīng)。在已分離的300余種無(wú)毒基因效應(yīng)蛋白分子中，大多數(shù)分子都含有NB-LRR結(jié)構(gòu)域，在調(diào)節(jié)和傳導(dǎo)信號(hào)上發(fā)揮重要作用，其中主要有水楊酸途徑、茉莉酸途徑和乙烯途徑等途徑中的20多種信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)因子(Innesetal.， 1993)。無(wú)毒基因蛋白并無(wú)功能同源性(Attardetal., 2002; Vivianetal., 2002)，在序列結(jié)構(gòu)上，部分無(wú)毒基因表現(xiàn)為高度保守的重復(fù)序列(Linningetal., 2004； 張德水等, 1997)，如稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)的無(wú)毒基因高度保守，已被成功地用于該菌種內(nèi)系統(tǒng)學(xué)的研究(王建飛等， 2006)。在亞麻銹菌(M.lini)的F2代銹菌群體中，Dodds等(2004)發(fā)現(xiàn)一個(gè)與亞麻(Linumusitatissimum)抗銹性L5、L6、L7相關(guān)聯(lián)的復(fù)合無(wú)毒基因位點(diǎn)AvrL567，編碼銹菌吸器細(xì)胞中大小為127個(gè)氨基酸的分泌蛋白，可在亞麻和煙草(Nicotianatabacum)細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)過(guò)敏性壞死。在已報(bào)道的1 184個(gè)松楊柵銹菌(M.larici-populina)的小分泌蛋白中，84%具有家系特異性并以基因家族形式出現(xiàn)(Duplessisetal., 2011)。Hacquard等(2012) 發(fā)現(xiàn)已描述的20個(gè)松楊柵銹菌小分泌蛋白具有63個(gè)同源性蛋白，其中8個(gè)與亞麻銹菌的AvrM同源，13個(gè)與AvrP4同源，1個(gè)與AvrL567同源，1個(gè)與AvrP123同源，3個(gè)與Uromycesfabae的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)TP1同源，其余大多數(shù)為夏孢子侵染時(shí)分泌的效應(yīng)蛋白。AvrM具有3個(gè)串聯(lián)子，基因間隔區(qū)為Pfam轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。AvrP4的C-端除包含6個(gè)絲氨酸殘基，其余部分高度變異。它與黃枝孢梅(Cladiosporiumfulvum)的Avr9蛋白(van den Hoovenetal., 2001)、一些毒蛋白或抑制子蛋白結(jié)構(gòu)相似(Pallaghyetal., 1994)。松楊柵銹菌的AvrL567同源基因蛋白同亞麻銹菌的AvrL567蛋白空間結(jié)構(gòu)相似，但在26-50氨基酸區(qū)域沒(méi)有RFYR傳導(dǎo)信號(hào)肽(Rafiqietal., 2010)，序列結(jié)構(gòu)較亞麻銹菌的保守。松楊柵銹菌的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)TP1與亞麻銹菌的吸器分泌蛋白HESP-327/RTP1相同，C-端保守而N-端高度變異，行使細(xì)胞核信號(hào)定位功能(Fernandezetal., 2012)。

大多數(shù)無(wú)毒基因以基因家族形式出現(xiàn)，并表現(xiàn)為連鎖顯性遺傳(Duplessisetal., 2011; Laugeetal., 1998)。Lawrence(2010)發(fā)現(xiàn)亞麻銹菌中有4個(gè)無(wú)毒基因家族，分別包含4，3，3,2個(gè)無(wú)毒基因。Dodds 等(2004)對(duì)亞麻銹菌的2個(gè)親本菌系雜交及F1代自交后代，用AvrL567片段探針的cDNA與RNA雜交結(jié)果顯示，AvrL567家族的A、B、C 3個(gè)基因總是連鎖遺傳分離，在對(duì)煙草、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的轉(zhuǎn)染中，表現(xiàn)為單顯遺傳。Zambino等(2000)通過(guò)分子標(biāo)記及圖譜技術(shù)，掌握了禾柄銹菌(Pucciniagraminis)無(wú)毒基因數(shù)量、顯隱性表達(dá)方式、連鎖遺傳及變異規(guī)律，并認(rèn)為禾柄銹菌無(wú)毒基因有8個(gè)，其中6個(gè)主要表現(xiàn)為單顯性遺傳，2個(gè)表現(xiàn)為雙顯性自由分離，但其中一個(gè)表現(xiàn)為偏分離遺傳，可能和抑制子基因連鎖有關(guān)。Newcombe (1998)發(fā)現(xiàn)M.medusaef.sp.deltoidae的無(wú)毒基因Mmd1在Populusdeltoides×P.trichocarpa的自交F2代中表現(xiàn)為3∶1的分離方式，但抗病楊樹(shù)個(gè)體上夏孢子堆的直徑、密度有顯著差異，在變量主成分(PCA)分析中，夏孢子堆直徑、密度占了66.6%的貢獻(xiàn)率，超過(guò)壞死反應(yīng)、夏孢子堆周長(zhǎng)，并推測(cè)與AvrMmdl連鎖的QTLs基因在夏孢子堆直徑和密度大小等方面發(fā)揮作用。松楊柵銹菌中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象，在MER無(wú)毒基因家族中串聯(lián)的微效基因控制著小種數(shù)量性狀(Lefevreetal., 1998)。

青楊銹病(M.larici-populina)是青楊(Populuscathayana)、黑楊(P.nigra)和它們的雜交種楊樹(shù)上危害嚴(yán)重的一種病害。歐洲、北美地區(qū)先后選育出了許多針對(duì)該銹病的歐美楊(Populus×euramericana)垂直抗病性無(wú)性系，如‘Hoogvorst’，‘Hazeendans’，‘Luisa’，‘Donk’，‘Ghoy’，‘Beaupre’等(Pinonetal., 1997)，能對(duì)E3、E4小種具有垂直抗病性，極大地促進(jìn)了歐美地區(qū)楊樹(shù)速生豐產(chǎn)林的發(fā)展。但栽植過(guò)程中，最嚴(yán)重的問(wèn)題是銹菌小種毒性變異和楊樹(shù)品種抗性的喪失。至今北美、歐洲已相繼報(bào)道了MLP的5個(gè)生理小種(E1—E5)，7種毒性基因(Vir1—Vir7)(Pinonetal., 1997; Steenackersetal., 1998)，我國(guó)也報(bào)道了MLP的5個(gè)生理小種(曹支敏, 2005)。目前，中國(guó)松楊柵銹菌小種與歐美小種在遺傳上的差異還未見(jiàn)報(bào)道，小種無(wú)毒基因多樣性、結(jié)構(gòu)與功能并不清楚。本研究采用同源擴(kuò)增技術(shù)和公共分子信息數(shù)據(jù)，試圖分析中國(guó)生理小種無(wú)毒基因序列與歐美小種無(wú)毒基因序列之間的差異和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

松楊柵銹菌2號(hào)生理小種(MLP2，HF2369)來(lái)自秦嶺火地塘太白楊(Populuspurdomii)(No.2369，海拔1 700 m)，親和型； 2號(hào)生理小種(MLP2，HZ3542)采自秦嶺厚畛子太白楊(No.3542，海拔670 m)，不親和型。歐美菌系參考相關(guān)公共數(shù)據(jù)庫(kù)，取其無(wú)毒基因序列進(jìn)行比對(duì)(表1)。

1.2 人工雜交方法

取太白楊(No.2369)附近長(zhǎng)白落葉松(Larixolgensis)上銹菌HF2369的性子器[雌性(♀)]，取太白楊(No.3542)附近落葉松上銹菌HZ3542的性子器[雄性(♂)]，待HZ3542的性子器成熟并有橘黃色的性孢子擠出時(shí)，將性子器連同落葉松針葉取下放在裝有無(wú)菌水保濕的濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置冰盒中帶到火地塘，并用HZ3524性子器涂抹HF2369的性子器，修剪枝條使涂抹針葉不受其他葉片銹菌干擾，用透明密封袋將枝條連體密封保濕，5天后，取成熟銹子器葉片按上面方法帶回溫室接種太白楊。

1.3 接種反應(yīng)型測(cè)定

取葉齡10天左右的離體葉片，放在裝有濾紙的培養(yǎng)皿中，濾紙用100 mg·kg-1的氯霉素浸濕，葉片正面扣在濾紙上，噴灑無(wú)菌水后，用鉤針小心將銹孢子涂抹分散在葉背上，用Parafilm密封，光照恒溫培養(yǎng)并記錄潛育期，并用解剖鏡觀察測(cè)量夏孢子堆直徑大小、高度、數(shù)量，有無(wú)褪綠及壞死斑及周長(zhǎng)等，記錄親和型和不親和型，圖1A。待夏孢子成熟，小心收集單個(gè)夏孢子堆獲得F1代夏孢子群體20個(gè)。將無(wú)壞死斑但具有褪綠斑的單個(gè)夏孢子堆按同樣方法接種離體葉片，獲得F2′代無(wú)性夏孢子群體。F1、F2′代無(wú)性夏孢子群體均按上述方法離體接種葉片并記錄反應(yīng)型。反應(yīng)型標(biāo)準(zhǔn)參照曹支敏等(2005)。

1.4 無(wú)毒基因型統(tǒng)計(jì)及遺傳分析

不親和型為顯性無(wú)毒基因表現(xiàn)型，親和型為不含無(wú)毒基因表現(xiàn)型。不親和型表型為： 有褪綠斑或壞死斑、相同接種孢子濃度下夏孢子堆密度小(<10個(gè)·cm-2)，潛育期在10天以上，接種反應(yīng)型為0、1、1+、2-，圖1B； 親和性表型為： 無(wú)褪綠斑和壞死斑、相同孢子濃度接種下產(chǎn)生夏孢子堆密度大(>10個(gè)·cm-2),潛育期在10天以下，接種反應(yīng)型為3+、4、4+，圖1C； 中間型： 無(wú)褪綠斑和壞死斑、相同孢子濃度接種下產(chǎn)生夏孢子堆密度大(6～12個(gè)·cm-2),潛育期在11天以下，接種反應(yīng)型為2+、3、3-。中間型再結(jié)合夏孢子堆直徑大小、密度、潛育期、夏孢子堆高度分別劃歸親和型和不親和型，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。理論值根據(jù)公式(χ2=Σ實(shí)得數(shù)2/預(yù)測(cè)數(shù)-觀察總數(shù))計(jì)算，結(jié)果按孟德?tīng)柋壤?∶1、1∶3、3∶1、15∶1和偏分離3∶13進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)無(wú)毒基因數(shù)量和顯隱性。

1.5 DNA提取

收集無(wú)毒基因型夏孢子堆，在盆栽太白楊上進(jìn)行隔離繁殖，收集成熟夏孢子堆提取DNA。DNA提取方法參考余仲東等(2005)的銹菌夏孢子DNA微量快速提取法。用鉤針從每個(gè)菌樣中取3～5個(gè)夏孢子堆，加入提取液100 μL[100 mmol·L-1Tris-HCl(pH 7.8),40 μL 20% KOH]和2%(V/V)的chelex-100(Bio-Rad公司)于1.5 mL的離心管中充分研磨后，置90 ℃水浴中溫育30 min，冷卻后置冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

A： 離體葉片接種方法Inoculation methods for detached leaf;B： 不親和型Incompatible phenotype; C： 親和型Compatible phenotype.圖1 離體葉片接種及表現(xiàn)型Fig.1 Inoculation and phenotype on detached leaf

1.6 無(wú)毒基因序列同源擴(kuò)增

參考亞麻銹菌無(wú)毒基因AvrL576-A，AvrL576-B基因序列及末端串聯(lián)拷貝序列orf3(序列號(hào)： AAS66952)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物2對(duì)，AvrPr1： 5′-TAATCC TCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCG CTC-3′(Tm=53.5 ℃); AvrPr2∶5′-GTCGACCGATC TATATCGAG-3′,5′-GTCTCTTCGTCCTTCCAAG-3′(Tm=54.1 ℃)。按下面反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性2 min，退火50 s，延伸1 min 30 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，25 ℃終止反應(yīng)。反應(yīng)體系為： 模板DNA 2 μL，Taq酶1 U，dNTPs 2 μL (10 mmol·L-1),正反引物各1 μL(10 μmol·L-1),5.0 μL 10×buffer,2 μL 25 mmol·L-1MgCl2，雙蒸水配平至50 μL。

1.7 無(wú)毒基因序列分析

PCR產(chǎn)物純化后，利用ABI 3730型 DNA 分析儀進(jìn)行雙向測(cè)序 (生工，上海)。 序列經(jīng)Chromas.exe修訂后，用軟件Clustalx 1.81進(jìn)行比對(duì)。去除序列中堿基缺失形成的空格(Gap)，根據(jù)Kimura 雙參數(shù)模型進(jìn)行遺傳距離計(jì)算，并參考NCBI (http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/)，Melampsoralarici-populinaV1.0 (http： //genome.jpi-psf.org), Basidomycetes yeast genomic (http： //www.tigr.org/)等數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)毒基因序列信息 (表1)，構(gòu)建最大似然系統(tǒng)樹(shù)(maximum likehood,ML)，1 000次Bootstrap重抽樣統(tǒng)計(jì)評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工雜交結(jié)果

人工涂抹20個(gè)性子器，其中10個(gè)性子器正常發(fā)育并在徑向面形成銹子器，取相對(duì)成熟、無(wú)污染的銹子器7個(gè)，即雜交F1代銹孢子堆群體；F1代銹孢子涂抹離體太白楊葉片后，獲得20個(gè)夏孢子堆，即F1代夏孢子堆群體(表2)。F1代夏孢子堆群體中的FA2接種離體太白楊葉片后，獲得5個(gè)夏孢子堆群體，即F2′代夏孢子堆群體(無(wú)性系)(表2)。

2.2 家系群體接種反應(yīng)型及無(wú)毒基因表型統(tǒng)計(jì)

表1 供試無(wú)毒基因序列Tab.1 Tested avirulence gene sequences

表2 孢子接種太白楊反應(yīng)型 ① Tab.2 Reaction type of inoculation on P.purdomii by spores

續(xù)表Continued

菌系Isolate潛育期Latent/d孢子堆直徑Diameter/mm密度Density/cm-2壞死斑Necrosis壞死斑周長(zhǎng)Necrosisperimeter/mm褪綠斑Chlorisis褪綠斑周長(zhǎng)Chlorisisperimeter/mm孢子堆高度Pustuleheight/mm葉片正面夏孢子堆Uredinialonadaxialsurface反應(yīng)型Reactiontype F2'代無(wú)性夏孢子F2'urediosporesAE80.0523-0-00.05-4BE70.19-0-00.1-4CE80.028-0+0.10.02-3DE80.17-0-00.1-4FE50.1～0.29-0+0.30.15-3+

① +:有該表型Dominate phenotype； -：無(wú)該表型Recessive phenotype； ×:免疫 Immunity reaction.

2.3 無(wú)毒基因序列分析

在供試的2對(duì)引物中，引物對(duì)AvrPr1擴(kuò)增產(chǎn)生穩(wěn)定的單一條帶，大小800～900 bp, 如圖2，AvrPr2擴(kuò)增產(chǎn)物特異性不強(qiáng)而放棄使用。所有供試無(wú)毒基因型夏孢子堆均有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，中間型菌系FC8也有微弱PCR產(chǎn)物，親和型FA3和中間型FC1無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。部分PCR產(chǎn)物測(cè)序后獲得6條無(wú)毒基因序列(GenBank接收號(hào)： JQ665873-78)。ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，供試的17條無(wú)毒基因序列可以分為2個(gè)大類(lèi)群。第1類(lèi)群包括了Melampsora,Puccinia，Ustilago等擔(dān)子菌真菌無(wú)毒基因序列， 第2群為黑粉菌、柄銹菌、新型隱球菌等無(wú)毒基因序列?？偟目磥?lái)，無(wú)毒基因序列間同源性較小，2個(gè)分支類(lèi)群鞋帶值僅20%。中國(guó)松楊柵銹菌的5條無(wú)毒基因(JQ665873-8)同加拿大該菌2條無(wú)毒基因具有更高的相似性，被聚在同一個(gè)亞分支上，但二者之間仍然存在較大的差異,分支長(zhǎng)度大(圖3)。另一條中國(guó)的無(wú)毒基因序列JQ665876.1與亞麻銹菌的AvrL567(AAS66952)，美國(guó)的M.medusaef. sp.deltoidae(DQ404337),法國(guó)的MLP(HG529590)等聚在另一個(gè)亞分支上。Blastn結(jié)果表明松楊柵銹菌無(wú)毒基因可能編碼銹菌RTP和NBP蛋白，在抗病信號(hào)傳導(dǎo)和夏孢子細(xì)胞壁骨架形成中發(fā)揮作用。

圖2 夏孢子堆無(wú)毒基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of avirulence gene by urediniaM：Marker；FA3(反應(yīng)型4 Reactive type 4)：親和型菌系Compatible with P. purdomii ； FC1(反應(yīng)型3Reactive type 3)、 FC8(反應(yīng)型3+Reactive3+)：中間型菌系，其余為不親和型菌系Middle type of compatible strains，the other lanes are of imcompatible strains； A-E、A-F、A-G：雜交后獲得銹孢子堆家系Progenies of cross-fertilization of pycnia by pycniospores； FA2、FA3、FA4、FA5、FA7、FC1、FC3、FC7、FC8、FC9：F1代夏孢子堆家系F1 progenies of urdinia； CE、FE：F2′代無(wú)性夏孢子堆家系A(chǔ)sexual F2′uredinia； FA3、FC1：無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物Without PCR products；A-G、FC8：擴(kuò)增產(chǎn)物弱With weak product band in respectively lane.

3 討論

圖3 無(wú)毒基因序列ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Maxium likehood phylogeny tree of tested averence genes

在“基因?qū)颉睂W(xué)說(shuō)中，植物的1個(gè)抗病基因?qū)?yīng)著病原菌的1個(gè)無(wú)毒基因，無(wú)毒基因效應(yīng)蛋白和抗病基因產(chǎn)物結(jié)合引發(fā)植物過(guò)敏性壞死(Flor, 1971)。無(wú)毒基因是銹菌侵染時(shí)重要的小分泌蛋白基因之一，常以基因家族的形式出現(xiàn)和發(fā)揮作用(Doddsetal.， 2004； Linningetal., 2004； Nemnetal., 2014)。亞麻銹菌AvrL567包含AvrL567-A、AvrL567-B、AvrL567-C編碼蛋白基因，Avr567-A、Avr567-B基因是串聯(lián)重復(fù)拷貝基因，3′端含有2個(gè)重復(fù)子Sec14和Orf-3。它們?cè)谘抗芪髦斜磉_(dá)，編碼一個(gè)127個(gè)氨基酸的分泌蛋白，可誘導(dǎo)寄主細(xì)胞過(guò)敏性壞死反應(yīng)，但需要和亞麻L(zhǎng)5、L6或L7抗病基因共表達(dá)。AvrL567-C在串聯(lián)重復(fù)子3′末端，單拷貝，編碼致病蛋白，進(jìn)化較快，與人工選擇壓力大小相關(guān)。本研究采用同源克隆技術(shù)獲得的6條avr基因序列均為AvrL567-A的同源序列，主要編碼銹菌細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(RTP1)和核酸結(jié)合蛋白(NBP)，N段含有保守的短肽氨基酸序列，可能和抗病信號(hào)的傳遞有關(guān)。Hacquard等(2012)在研究MLP小分泌蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，MLP的AvrL567同亞麻銹菌的AvrL567有較大差異，本研究中也發(fā)現(xiàn)MLP的5條無(wú)毒基因序列同亞麻銹菌都不在同一個(gè)亞分支上。無(wú)毒基因家族中各拷貝在接種表現(xiàn)型上發(fā)揮著不同的作用，AvrL567-C發(fā)揮致病性作用而與寄主選擇壓力相協(xié)調(diào)(Doddsetal., 2004)，往往具有更高的變異性； 禾柄銹菌(P.graminis)無(wú)毒基因中有一個(gè)抑制子，在壞死反應(yīng)中表現(xiàn)出抑制作用(Zambinoetal., 2000)。無(wú)毒基因在接種抗病反應(yīng)中通常表現(xiàn)出過(guò)敏性壞死，這些串聯(lián)因子有可能調(diào)控著壞死反應(yīng)的程度和數(shù)量。

太白楊是松楊柵銹菌的天然寄主，通常被認(rèn)為是高度感病的而在研究中作為擴(kuò)繁寄主使用(曹支敏等， 2005)。但在Burdon等(1997)的研究中，天然寄主黑楊是最容易發(fā)現(xiàn)銹菌致病性變異的地方，天然雜交后形成的銹菌家系群體首先在天然寄主上發(fā)生性狀分離。本研究在嚴(yán)格控制接種條件下獲得的家系群體，在太白楊上也發(fā)生了性狀分離，無(wú)毒基因型表現(xiàn)為單基因顯性遺傳，和Avr9(van Kanetal., 1991)、UhAvr1(Linningetal., 2004)等無(wú)毒基因的遺傳規(guī)律相似。但本研究中的MLP的F1代銹孢子堆家系接種時(shí)有明顯的壞死反應(yīng)且孢子堆直徑大，而F1和F2′代夏孢子堆家系壞死反應(yīng)不顯著而且褪綠斑大小出現(xiàn)分化，夏孢子堆的直徑和周長(zhǎng)等也發(fā)生較大的變化，推測(cè)有QTLs基因發(fā)揮作用，或在家系分化中無(wú)毒基因部分片段發(fā)生重組或消失，需要進(jìn)一步研究。

在對(duì)TD系列自交F2代接種反應(yīng)型研究中,Newcombe(1998)認(rèn)為抗病基因Mmd1的QTLs性狀來(lái)自于祖父的隱性遺傳，M.medusaef.sp.deltoidae接種時(shí)的壞死反應(yīng)是對(duì)應(yīng)無(wú)毒基因的顯性表現(xiàn)，夏孢子堆的直徑大小是無(wú)毒基因型的最重要QTLs性狀。在大多數(shù)文獻(xiàn)中，寄主抗病表現(xiàn)型定義為人工接種反應(yīng)型0，1，2-等(田呈明等， 2002)，很難區(qū)分2+、3-等中間表現(xiàn)型和既無(wú)壞死也無(wú)褪綠斑但潛育期長(zhǎng)的表現(xiàn)型。本研究以壞死斑、褪綠斑的有無(wú)和大小為主，結(jié)合密度、夏孢子堆直徑、潛育期等來(lái)判別無(wú)毒基因型，并通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)表明這種方法是可行的，對(duì)中間反應(yīng)型也是適用的。

單個(gè)夏孢子堆中夏孢子群體通常被認(rèn)為是同質(zhì)的，在人工接種致病反應(yīng)型中可能會(huì)發(fā)生性狀數(shù)量大小的變化，但一般不會(huì)形成新的致病型(馬娥嬌等， 2014)。本研究中F1代夏孢子堆群體致病型類(lèi)群和F1代銹孢子堆群體相似，是有性交配后第1代群體，均有性狀分離。而F2′夏孢子堆中孢子群體為無(wú)性群體，接種反應(yīng)型分化不明顯，卡方檢驗(yàn)不顯著。Steenacker等(1998)報(bào)道松楊柵銹菌在寄主選擇壓力下或在夏孢子堆混合接種下，容易出現(xiàn)新的致病型。在沒(méi)有轉(zhuǎn)主寄主情況下，松楊柵銹菌可進(jìn)行準(zhǔn)性生殖，通過(guò)芽管融合和細(xì)胞核流動(dòng)而產(chǎn)生新的致病菌系(Yuetal., 2009)。但新性狀形成需要較強(qiáng)的選擇壓力和較長(zhǎng)的時(shí)間，試驗(yàn)中采用的天然寄主太白楊葉片離體培養(yǎng)技術(shù)，可以保證家系群體接種致病性的穩(wěn)定，為無(wú)毒基因型的測(cè)定奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，該方法可減少傳統(tǒng)葉盤(pán)接種法對(duì)葉片的傷害，最大限度地延長(zhǎng)離體葉片的生命力和防止孢子分散造成污染。

4 結(jié)論

MLP2小種無(wú)毒基因型表現(xiàn)為單顯性遺傳，雜合子(HZ3542)親本在F1代銹孢子堆、F1代夏孢子堆群體中性狀分離均為1∶1，符合孟德?tīng)栠z傳分離定律。無(wú)毒基因序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)樹(shù)表明，真菌無(wú)毒基因序列間總體上同源性較低，但同類(lèi)群真菌無(wú)毒基因序列間具有更高的同源性，柵銹菌屬(Melampsoraspp.)無(wú)毒基因序列聚在同一個(gè)分支上，中國(guó)松楊柵銹菌無(wú)毒基因序列與加拿大菌系無(wú)毒基因序列聚在一個(gè)亞分支上，顯示出較高的同源性。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Segregation Patterns and Phylogeny Analysis ofAvrL567 Gene inMelampsoralarici-populina

Yu Zhongdong1Chen Zujing2Cao Zhimin1Ren Zhengzheng3Feng Shiqiang4Zhang Yaoqi5

(1.Forestry College, Northwest A&F University Yangling 712100； 2.College of Forestry and Landscape Architecture,South China Agricultural University Guangzhou 510642； 3.Science College, Northwest A&F University Yangling 712100； 4.Liaoning Province Forest Pest Control and Quarantine Bureau Shenyang 110804； 5.Hunnan District Forestry Bureau of Shenyang Shenyang 110163)

Rust fungus ofMelampsoralarici-populina(abbr. MLP) is a great enemy of poplar industry in China, and it threatened short rotation forest seriously, including poplars of Sect.Tacamachacae, and Sect.Aigerios, and their hybrids. 【Objective】To understand the genetics of avirulence genes in their family, and to detect the phylogenic relationship of avirulence gene sequences between Chinese MLP and the other races in European and USA.【Method】 Population of F1aecia of MLP was harvested by cross-fertilization with spermogonia of physiologic race 2 (MLP2) collected from Houzhengzi (in which, isolate HZ3542 as a male maternal，incompatible withPopuluspurdomii) and Huoditang (in which, isolate HF2369 as a female maternal, compatible with purdomii poplar) in Qinling Mountain, and segregation pattern of avirulence genes in MLP2family as detected and inoculating aciospores and urediospores onP.purdomiileavesinvitro. Primers were designed and selected by referring toAvrL567(accession： AAS66952) inMelampsoralini. Avirulence genes were amplified by PCR homogenized technology and then sequenced. All putative sequences were revised and aligned with other avirulence genes in the related public molecular information data, and a maximum likehood (abbr.,ML) phylogeny tree was then constructed. 【Result】 Segregation of avirulence genes in MLP2was coincident to the Mendel′s law, and showed a single dominant heterozygous phenotype (Aa) in the incompatible isolate, and homozygote phenotype (aa) in the compatible isolate. Their F1population in both aeciospores (P=0.01) and urediospores (P=0.05) segregated by following 1∶1 with dominant to recessive phenotype. The certification for dominant avr phenotype is revised and confirmed by combination with quality traits of necrosis and chlorosis, quantitative trait loci (QTLs) including latent days, both diameter size and density of uredinia. PCR productions were also used to test and confirm avirulence phenotype under annealing by selected primer pair AvrPr1 (5′-TAATCCTCGTTGACATCAGTC-3′,5′-AAGCTTGAGAGCTCCGCTC-3′). ML phylogeny tree differentiated two groups from all tested sequences at a low bootstrap data. Among them, allMelampsorasequences were grouped together with a relatively high homology, and five of sixAvrL567 sequences from China MLP2isolates grouped into a sub-clad together with two Canada MLP sequences, and another one was grouped into another sub-clad with French MLP, USAM.lini, etc.【Conclusion】 Incompatible race 2 of MLP in China was a phenotype of Aa, and its avirulence gene sequences showed a high homology with that of tested Canada isolates.Key words：Melampsoralarici-populina; avirulence gene; segregation law; phylogeny tree

10.11707/j.1001-7488.20170511

2015-01-05；

2016-11-14。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31670650);科技新“十三五”重點(diǎn)專(zhuān)項(xiàng)(SQ2017YFNC030122);高校科研基本業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(ZL09021005)。

S718.81

A

1001-7488(2017)05-0088-09