一種化學(xué)誘變方法對(duì)黑曲霉發(fā)酵的影響

劉夢(mèng)涵(中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

一種化學(xué)誘變方法對(duì)黑曲霉發(fā)酵的影響

劉夢(mèng)涵(中糧生物化學(xué)(安徽)股份有限公司， 安徽 蚌埠 233010)

經(jīng)過不同濃度的抗霉素平板對(duì)菌株進(jìn)行化學(xué)誘變，通過透明圈、搖瓶篩選，獲得高產(chǎn)檸檬酸菌株。經(jīng)過穩(wěn)定性試驗(yàn)，最終確定一株穩(wěn)定性好的高產(chǎn)菌株。

誘變;透明圈;產(chǎn)酸

線粒體是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生能和控制細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，被認(rèn)為是細(xì)胞生存與死亡的調(diào)控中心。線粒體的膜電位及活性氧水平是衡量線粒體乃至細(xì)胞健康和損傷的關(guān)鍵活性參數(shù)之一。線粒體膜電位的崩潰或下降會(huì)導(dǎo)致腺苷三磷酸(ATP)的合成受阻，ATP酶功能逆轉(zhuǎn)，使得細(xì)胞內(nèi)ATP供應(yīng)不足，離子穩(wěn)態(tài)失衡等，最終可導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。使用抗霉素A處理細(xì)胞時(shí)，線粒體呼吸鏈的電子傳遞受到抑制，導(dǎo)致線粒體內(nèi)活性氧的增加以及ATP能量的虧損。

抗霉素A屬于電子遞體抑制劑，具有抑制電子從細(xì)胞色素b到細(xì)胞色素C1傳遞的作用，使氧化作用不能完成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP合成受阻，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致NADH不能被氧化脫氫，細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+水平升高。細(xì)胞內(nèi)的ATP濃度的下降，減輕了ATP對(duì)磷酸果糖激酶(PFK酶)的反饋抑制,使EMP代謝流量增加，丙酮酸和草酰乙酸生成水平提高，使檸檬酸大量積累，增加檸檬酸的生物合成(黑曲霉生長(zhǎng)時(shí)EMP:HMP=2:1，產(chǎn)酸時(shí)EMP:HMP=4:1)。

1 萌發(fā)率試驗(yàn)

表1

表2

從孢子(表1)在抗性平板上的生長(zhǎng)現(xiàn)象可以看出，孢子生長(zhǎng)對(duì)抗霉素A敏感。由于抗霉素A屬于電子遞體抑制劑，具有抑制電子從細(xì)胞色素b到細(xì)胞色素C1傳遞的作用，使氧化作用不能完成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP合成受阻，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致NADH不能被氧化脫氫，細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+水平升高。在抗霉素A低濃度時(shí)可通過細(xì)胞內(nèi)底物水平磷酸化作用生產(chǎn)ATP,供細(xì)胞生長(zhǎng)需要。

當(dāng)抗霉素A濃度大于0.3mg/L后，隨著抗霉素A的濃度增加，孢子萌發(fā)率快速下降，當(dāng)抗霉素A濃度為1.1mg/L時(shí)，孢子萌發(fā)率僅為1.02%。而且隨著抗霉素A濃度的增加，孢子萌發(fā)時(shí)間及產(chǎn)孢子時(shí)間都有不同程度的推遲。所以我們確定在下一步抗性篩選中，抗性平板培養(yǎng)基中的抗霉素A的濃度為0.5mg/L、0.7 mg/L、0.9 mg/L。

2 透明圈篩選結(jié)果

根據(jù)萌發(fā)率試驗(yàn)結(jié)果，我們選擇抗霉素A的濃度為0.5mg/L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培養(yǎng)基的作為抗性篩選的培養(yǎng)基。抗性平板培養(yǎng)43.5h，挑選菌落形態(tài)較好、大小均勻的84個(gè)單菌落轉(zhuǎn)移清液平板，進(jìn)行透明圈篩選，每個(gè)清液平板放置3個(gè)單菌落。清液平板培養(yǎng)24h，測(cè)量菌落及透明圈直徑。

根據(jù)菌落形態(tài)不發(fā)散(表2)，且H/C的值大于84個(gè)單菌落的H/C的平均值(2.92)這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，挑選29個(gè)單菌落轉(zhuǎn)移小斜面，進(jìn)行產(chǎn)孢試驗(yàn)。而這29個(gè)單菌落的H/C值在2.32～3.9之間，他們?cè)谡植紙D中的分布頻率也較高。

3 抗性菌株搖瓶篩選

根據(jù)萌發(fā)率試驗(yàn)結(jié)果，我們選擇抗霉素A的濃度為0.5mg/ L、0.7mg/L、0.9mg/L的PDA培養(yǎng)基的作為抗性篩選的培養(yǎng)基?？剐云桨迮囵B(yǎng)43.5h，挑選菌落形態(tài)較好、大小均勻的84個(gè)單菌落轉(zhuǎn)移清液平板，進(jìn)行透明圈篩選，每個(gè)清液平板放置3個(gè)單菌落。清液平板培養(yǎng)24h，測(cè)量菌落及透明圈直徑。根據(jù)比值及菌落形態(tài)共挑選84個(gè)單菌落進(jìn)行搖瓶篩選?？剐跃険u瓶發(fā)酵結(jié)果如(表3)，根據(jù)搖瓶篩選結(jié)果，優(yōu)選0.7A-5、0.9A-1、0.9A-3三珠菌株進(jìn)行發(fā)酵性能穩(wěn)定性試驗(yàn)。

表3

表4

4 抗性菌株穩(wěn)定性試驗(yàn)

FC216菌種在添加抗霉素A的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過清液平板篩選、搖瓶篩選，選育出能利用玉米原料快速產(chǎn)生檸檬酸，而不利用和分解檸檬酸的菌株，菌株的產(chǎn)酸性能較出發(fā)株至少提高5%，而且菌株性能穩(wěn)定。菌株的穩(wěn)定性是衡量一株優(yōu)良菌種的重要標(biāo)志，抗性菌株由于基因突變，往往失去生理特性的平衡，同時(shí)也降低了與原來環(huán)境的適應(yīng)能力，所以菌株在傳代過程，發(fā)酵產(chǎn)酸等各項(xiàng)性能不穩(wěn)定。所以我們計(jì)劃對(duì)抗性菌株進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。考察菌株穩(wěn)定性一般需要對(duì)菌株進(jìn)行傳代10次，然后挑選第2、4、6、8、10代分別與第一代進(jìn)行搖瓶對(duì)比試驗(yàn)并加以判斷。

通過對(duì)搖瓶發(fā)酵結(jié)果分析，從表(四)可以看出，0.9A-1的菌株產(chǎn)酸偏差變化范圍最小，在2.0左右，變化比較平穩(wěn)。這說明該菌株隨著傳代次數(shù)的增加產(chǎn)酸性能比較穩(wěn)定。0.9A-3菌株產(chǎn)酸偏差雖然在1.0左右，變化范圍也較小，但是從第六代開始產(chǎn)酸偏差是負(fù)偏差，這說明該菌株性能開始向退化的方向進(jìn)行，穩(wěn)定性差。0.7A-5菌株產(chǎn)酸偏差雖然較高，但是產(chǎn)酸偏差變化幅度相對(duì)較大，這說明該菌株隨著傳代次數(shù)的增加，穩(wěn)定性較差。