缺氧通過刺激胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素分泌促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外侵襲

常凱凱， 楊慧麗， 周文潔， 李明清， 謝 鋒

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所生殖免疫研究室，上海 200011

·論 著·

缺氧通過刺激胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素分泌促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外侵襲

常凱凱， 楊慧麗， 周文潔， 李明清， 謝 鋒*

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院研究所生殖免疫研究室，上海 200011

目的： 探討缺氧誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞體外侵襲的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。方法： 用ELISA法分析常氧和缺氧培養(yǎng)對宮頸癌細(xì)胞株HeLa和CaSki細(xì)胞的胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)分泌水平及TSLP對侵襲相關(guān)分子基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloprotein-2, MMP-2)、MMP-9和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8, IL-8)表達(dá)水平的影響。Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測重組TSLP、缺氧和TSLP中和性抗體對宮頸癌細(xì)胞侵襲力的影響。結(jié)果： 與常氧環(huán)境相比，缺氧培養(yǎng)下HeLa、CaSki細(xì)胞TSLP分泌水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。重組TSLP(100 ng/mL)體外刺激顯著促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞的侵襲力(P<0.001)，并促進(jìn)其分泌MMP-2、MMP-9和IL-8(P<0.01)。缺氧培養(yǎng)可顯著促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞的侵襲力(P<0.001)；TSLP中和性抗體(5 μg/mL)能抑制HeLa、CaSki細(xì)胞侵襲(P<0.05)，且可明顯抑制缺氧對HeLa、CaSki細(xì)胞侵襲力的促進(jìn)作用(P<0.05)。結(jié)論： 缺氧可通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌TSLP，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外侵襲。

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素；缺氧；宮頸癌；侵襲

宮頸癌嚴(yán)重威脅婦女健康，每年全球有超過273 000人因?qū)m頸癌而死亡，約占女性癌癥死亡總數(shù)的9%[1-4]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(thymic stromal lymphopoietin, TSLP)是一種主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生的造血細(xì)胞因子，在皮膚、肺、胸腺、心臟、胃腸道、肝臟等器官高表達(dá)[5]。腫瘤細(xì)胞，如纖維母細(xì)胞瘤、肺癌、乳腺癌和胰腺癌細(xì)胞等，均分泌高水平TSLP。TSLP/TSLP受體(TSLPR)信號參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程，如調(diào)節(jié)天然和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，并在呼吸道疾病、過敏性皮膚病、寄生蟲感染和腸道免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞高水平表達(dá)TSLP，而TSLP可在體外增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞活力[6]、促進(jìn)癌灶血管形成[7]，并可通過募集和調(diào)節(jié)癌灶嗜酸性粒細(xì)胞功能來促進(jìn)宮頸癌進(jìn)展[8]。但其是否參與調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的侵襲仍不清楚。因此，本研究通過觀察體外缺氧環(huán)境對TSLP表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及TSLP對宮頸癌細(xì)胞株HeLa及CaSki細(xì)胞的侵襲力和相關(guān)分子表達(dá)的影響，探討缺氧和TSLP在調(diào)節(jié)宮頸癌侵襲和轉(zhuǎn)移效應(yīng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；人TSLP ELISA試劑盒、人重組TSLP蛋白(rhTSLP)、抗人TSLP中和性抗體(aTSLP)和對照IgG抗體均購自R&D公司；人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9和白細(xì)胞介素-8(IL-8)ELISA試劑盒購自吉泰生物科技有限公司；Matrigel購自BD公司。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) 人宮頸癌細(xì)胞株(HeLa和CaSki細(xì)胞)均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。分別對HeLa和CaSki細(xì)胞進(jìn)行常氧或缺氧培養(yǎng)。常氧培養(yǎng)的細(xì)胞放置于常氧培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)條件：21% O2、74% N2、5% CO2)培養(yǎng)；缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞放置于缺氧培養(yǎng)箱中(培養(yǎng)條件：1% O2、94% N2、5% CO2)培養(yǎng)。

1.3 ELISA法測定上清生化指標(biāo)水平 用經(jīng)正常培養(yǎng)和缺氧培養(yǎng)后的HeLa、CaSki細(xì)胞上清進(jìn)行TSLP濃度檢測，將HeLa和CaSki細(xì)胞分別以每孔2×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，同上法常氧或缺氧培養(yǎng)48 h。實(shí)驗(yàn)終止后收集各組培養(yǎng)上清，按照TSLP的ELISA試劑盒說明書中的操作步驟，檢測各組上清中TSLP濃度。每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

HeLa、CaSki細(xì)胞經(jīng)rhTSLP處理后，檢測上清中MMP-2、MMP-9和IL-8濃度。將HeLa和CaSki細(xì)胞分別以每孔1×105個(gè)細(xì)胞接種于24孔板，給予溶媒或rhTSLP(100 ng/mL)刺激48 h后，收集培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒的操作步驟檢測上清中MMP-2、MMP-9和IL-8的濃度。每次設(shè)3復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 Matrigel體外細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 按照細(xì)胞密度1×104/200 μL，將HeLa和CaSki細(xì)胞接種于Transwell培養(yǎng)小室(購自Corning公司，小室直徑為8 μm)，分別給予aTSLP或?qū)φ誌gG抗體(5 μg/mL)，并于37℃、5%CO2常氧培養(yǎng)箱或缺氧培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育48 h后，用棉簽輕輕拭去培養(yǎng)小室的上室濾膜內(nèi)面細(xì)胞，同時(shí)保留定向遷移至小室濾膜下表面的腫瘤細(xì)胞。隨后用4%多聚甲醛固定15 min，經(jīng)PBS清洗后用蘇木精染色30 min。然后采用Olympus BX51+DP70熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，高倍顯微鏡(×200)計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)量(每孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù))。侵襲指數(shù)=每高倍鏡視野中缺氧組遷移至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)/常氧組遷移至濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)×100%。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 缺氧升高HeLa和CaSki細(xì)胞的TSLP分泌水平 相對于常氧條件，缺氧培養(yǎng)可明顯上調(diào)HeLa(圖1A，P<0.001)和CaSki細(xì)胞(圖1B，P<0.01)TSLP的分泌水平。結(jié)果提示缺氧可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌TSLP，宮頸癌組織高表達(dá)TSLP可能與癌灶局部缺氧有關(guān)。

圖1 缺氧培養(yǎng)促進(jìn)HeLa(A)、CaSki細(xì)胞(B)分泌TSLP

2.2 重組TSLP促進(jìn)HeLa和CaSki細(xì)胞侵襲 結(jié)果(圖2)表明：與對照組相比，重組TSLP蛋白刺激后，HeLa和CaSki細(xì)胞的侵襲力顯著升高(P<0.001)。

2.3 重組TSLP促進(jìn)HeLa和CaSki細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8 結(jié)果(圖3)表明：相對于對照組，重組TSLP蛋白刺激后，HeLa和CaSki細(xì)胞上清中MMP-2、MMP-9和IL-8濃度均顯著上升(P<0.01或P<0.001)。

2.4 缺氧通過上調(diào)TSLP分泌促進(jìn)HeLa和CaSki細(xì)胞的侵襲力 結(jié)果(圖4)表明：相對于常氧組，缺氧組HeLa(P<0.001)和CaSki(P<0.001)細(xì)胞的侵襲力均顯著升高。但aTSLP處理抑制了HeLa(P<0.05)和CaSki(P<0.05)細(xì)胞的侵襲力，且aTSLP可明顯抑制缺氧培養(yǎng)對HeLa和CaSki細(xì)胞侵襲力的促進(jìn)作用。

圖2 重組TSLP促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞侵襲

圖3 重組TSLP促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8

圖4 缺氧通過上調(diào)TSLP分泌促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞的侵襲力

3 討 論

缺氧是多種實(shí)體瘤的固有特征之一[9]。在腫瘤的形成過程中，一方面，腫瘤細(xì)胞的失控性增殖和生長使腫瘤細(xì)胞與周圍間質(zhì)中血管間的距離逐漸增加；另一方面，腫瘤組織中新生血管結(jié)構(gòu)和功能尚不完善且分布紊亂，使得腫瘤細(xì)胞不能獲得足夠的營養(yǎng)和氧氣。這些因素共同導(dǎo)致腫瘤組織存在缺氧微環(huán)境。研究[10]已證實(shí)，缺氧與宮頸癌低凋亡、高侵襲力、復(fù)發(fā)和不良預(yù)后等相關(guān)。我們的前期研究[11]發(fā)現(xiàn)，缺氧可通過促進(jìn)IL-8分泌而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞體外生長。缺氧還可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對放療的抵抗力[12]。如缺氧可通過促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子1α、血管內(nèi)皮生長因子和p53的表達(dá)，引起放療后癌灶血管生成增多和腫瘤細(xì)胞自身凋亡水平降低[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件下，宮頸癌細(xì)胞株HeLa、CaSki細(xì)胞分泌的TSLP水平均顯著升高，缺氧可能通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌TSLP來進(jìn)一步調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。結(jié)合我們前期研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織和細(xì)胞高表達(dá)TSLP，提示宮頸癌組織高表達(dá)TSLP可能與局部缺氧有關(guān)。

多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌和肺癌細(xì)胞均高水平表達(dá)TSLP，而TSLP水平與腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲密切相關(guān)[13-14]。乳腺癌細(xì)胞通過表達(dá)TSLP可誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(DCs)表達(dá)OX40L。原發(fā)性乳腺癌的浸潤灶中存在OX40L+DCs。這群OX40L+DCs可在體外誘導(dǎo)炎性Th2細(xì)胞分泌IL-13和腫瘤壞死因子(TNF)。我們既往已經(jīng)報(bào)道TSLP可在體外增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞增殖和侵襲力[6]。本研究證實(shí)重組TSLP蛋白可明顯促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞侵襲。此外，缺氧亦促進(jìn)HeLa和CaSki細(xì)胞侵襲，而且這一效應(yīng)可以被TSLP中和性抗體所抑制，提示缺氧通過上調(diào)TSLP分泌促進(jìn)宮頸癌體外侵襲。

前期研究[15]顯示，TSLP可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分泌單核細(xì)胞趨化蛋白-1和IL-8，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞體外增殖。除了IL-8[16]，大量的研究已經(jīng)證實(shí)MMP-2和MMP-9可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[16-17]，被認(rèn)為是評估宮頸癌預(yù)后的重要分子。研究[18-20]顯示，缺氧可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞分泌MMPs。本研究發(fā)現(xiàn)TSLP可以促進(jìn)HeLa、CaSki細(xì)胞分泌MMP-2、MMP-9和IL-8，提示缺氧及TSLP可通過調(diào)節(jié)這些侵襲相關(guān)分子的表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌的體外侵襲，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)缺氧可在體外通過促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞分泌TSLP，刺激MMP-2、MMP-9和IL-8產(chǎn)生，進(jìn)一步增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞的侵襲力，促進(jìn)宮頸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。結(jié)果提示TSLP可能與宮頸癌體內(nèi)侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是宮頸癌靶向治療潛在的藥物靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Hypoxia promotes the invasion of cervical cancer cellsinvitroby stimulating secretion of TSLP

CHANG Kai-kai, YANG Hui-li, ZHOU Wen-jie, LI Ming-qing, XIE Feng*

Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital & Institute of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, Shanghai 200011, China

Objective： To explore the effects of hypoxia and thymic stromal lymphopoietin (TSLP) on the invasion of cervical cancer cellsinvitro. Methods： Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to analyze the effects of normoxia and hypoxia on the secretion level of TSLP, and to analyze the effects of recombinant human TSLP (rhTSLP) protein on the expression levels of matrix metalloprotein-2 (MMP-2), MMP-9， and IL-8 in cervical cancer cell lines HeLa and CaSki. Matrigel invasion assay was used to investigate the effects of rhTSLP, hypoxia, and anti-human TSLP (aTSLP) neutralizing antibody on the invasiveness of HeLa and CaSki cellsinvitro. Results： Under hypoxia exposure, the levels of TSLP secretion in HeLa and CaSki cells were significantly increased (P<0.01). RhTSLP (100 ng/mL) stimulationinvitrosignificantly enhanced the invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.001), and promoted the productions of MMP-2, MMP-9， and IL-8 (P<0.01). The invasiveness of HeLa and CaSki cells can be promoted significantly under hypoxia exposure (P<0.001). In contrast, aTSLP (5 μg/mL) inhibited the invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.05), and partly inhibited the stimulatory effect of hypoxia on invasiveness of HeLa and CaSki cells (P<0.05). Conclusions： Hypoxia facilitates the invasion of cervical cancer cellsinvitroby up-regulating the secretion of TSLP.

thymic stromal lymphopoietin; hypoxia; cervical cancer; invasion

2017-02-14 [接受日期] 2017-02-24

國家自然科學(xué)基金(81302260)，上海市自然科學(xué)基金(17ZR1403200). Supported by National Natural Science Foundation of China (81302260) and Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1403200).

常凱凱，博士，住院醫(yī)師. E-mail: cc405@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-33189900, E-mail: ylxiefeng@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170114

R 737.33

A