基于適配體的熒光納米探針在食品安全檢測中的研究進展

劉秀英,崔瑩瑩,蘇麗紅,朱力杰,湯軼偉,高 雪,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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基于適配體的熒光納米探針在食品安全檢測中的研究進展

劉秀英,崔瑩瑩,蘇麗紅,朱力杰,湯軼偉,高 雪,勵建榮

(渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

適配體因其高特異性、高親和力、易于修飾和功能多樣化等優(yōu)點而被備受關(guān)注。熒光納米材料因具有獨特的光學(xué)特性,已成為一種極具應(yīng)用潛力的標記材料。將核酸適配體的結(jié)合特異性和熒光納米材料特有光學(xué)特性有機結(jié)合,開發(fā)選擇性好、穩(wěn)定性強、靈敏度高的熒光探針,基于該探針構(gòu)建簡單高效的檢測技術(shù)已成為食品安全檢測與分析領(lǐng)域的研究熱點。本文概述了適配體熒光納米探針的檢測原理、分類,重點介紹了近幾年該技術(shù)在有害化學(xué)物質(zhì)和致病性微生物兩類食品安全因子檢測方面的應(yīng)用,并對發(fā)展趨勢進行了展望。

適配體,熒光納米探針,食品安全檢測

近年來,食品安全檢測技術(shù)發(fā)展迅速,其中分子識別元件是關(guān)鍵。適配體(Aptamer)是利用體外篩選技術(shù),“指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化”技術(shù)(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),從核酸分子文庫中得到的一類單鏈寡核苷酸片段(DNA或RNA)[1]。作為一種新型生物分子識別元件,在食品安全檢測領(lǐng)域顯示了巨大的應(yīng)用前景。與抗體相比,適配體篩選無需動物實驗,可根據(jù)需要進行全化學(xué)合成,且篩選周期短,避免了抗體存在批次差異大的問題,可實現(xiàn)批量生產(chǎn)[2-3]。此外,適配體還具有易于修飾的優(yōu)點,可根據(jù)不同分析目的有選擇性地在適配體末端修飾上各種活性基團(如氨基、磷酸基、巰基、熒光標記物、電化學(xué)標記物等)[4-5]。最為重要的是,適配體能夠與靶分子發(fā)生特異性結(jié)合,且親和力高、特異性強[6-7]。據(jù)報道,適配體可以與金屬離子[8]、小分子[9]、生物大分子[10]、微生物[11-13]、甚至是細胞[14]等多種靶標相結(jié)合,因而被廣泛用于食品安全檢測領(lǐng)域。

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展,熒光納米材料因具有熒光強度高、光穩(wěn)定性優(yōu)越、靈敏度高和設(shè)計多樣化等特點,受到越來越多研究者們的關(guān)注。將適配體特異性識別和熒光納米材料高效信號轉(zhuǎn)換、放大功能互補結(jié)合,研發(fā)適配體熒光納米探針,無疑為食品危害因子監(jiān)測提供了一種新型、高效和快速的分析技術(shù)保障。本文總結(jié)了適配體熒光納米探針在食品安全檢測中的最新研究進展,重點綜述了適配體熒光納米探針的主要分類及其在食品安全檢出領(lǐng)域中的應(yīng)用,并對其未來發(fā)展趨勢進行了展望。

1 適配體熒光納米探針的檢測原理

適配體熒光納米探針是基于適配體的結(jié)合特異性,通過對合成方法的巧妙設(shè)計,將熒光納米材料與適配體結(jié)合所構(gòu)建的復(fù)合型熒光探針,其最卓越的優(yōu)點之一就是可以實現(xiàn)分子識別與信號轉(zhuǎn)化過程的同時進行。該探針的合成通常需要:對熒光材料引進表面修飾(如氨基化、硅烷化等)以提高其生物親和性;再通過一定的相互作用(如親和素與生物之間、適配體與互補鏈DNA之間的相互作用等),將適配體直接或間接地鏈接到熒光材料表面,形成探針。

所構(gòu)建的適配體熒光納米探針在進行識別與檢測過程中,適配體作為識別單元,結(jié)構(gòu)靈活,與靶標分子結(jié)合后自身的空間結(jié)構(gòu)可以通過鏈內(nèi)某些互補堿基間的配對、氫鍵、范德華力等作用而發(fā)生變化,形成特異性的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)(如發(fā)夾和頸環(huán)結(jié)構(gòu)等),進而實現(xiàn)對目標分子的選擇性識別[15]。適配體與靶標分子結(jié)合的同時,會引發(fā)自身電荷分布、空間位阻等發(fā)生改變,并導(dǎo)致與適配體相結(jié)合的熒光納米材料的響應(yīng)信號發(fā)生改變,且熒光信號的變化程度與體系中存在的靶標分子濃度相關(guān)。因此,可通過監(jiān)測體系中熒光信號的變化,進而能將適配體的微觀變化進行信號轉(zhuǎn)換,實現(xiàn)對目標物質(zhì)的定量分析。

2 適配體熒光納米探針的主要分類

由于適配體具有易于標記的特點,將熒光方法與適配體識別功能進行結(jié)合是檢測分析領(lǐng)域的重要方向之一。起初,研究者利用異硫氰酸熒光素、羅丹明、香豆素等熒光基團修飾適配體[16],根據(jù)基團的熒光強度變化進而實現(xiàn)對目標物質(zhì)的實時檢測。然而,這些傳統(tǒng)的熒光材料存在吸收窄、發(fā)射寬、光漂白等缺點。為了改善這些問題,熒光納米材料被引入適配體探針的構(gòu)建。

2.1 量子點型探針

熒光納米材料多種多樣,量子點因具體熒光穩(wěn)定性強、壽命長、熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜寬且發(fā)射光譜窄等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于免疫分析、熒光傳感、化學(xué)成像等領(lǐng)域中[17-18]。其中基于量子點標記的適配體構(gòu)建的熒光納米探針成為廣大學(xué)者研究熱點之一,相關(guān)研究報道較多。例如,王成全嘗試制備了二氧化硅包覆大量CdTe量子點的核殼結(jié)構(gòu)的納米球(CdTe@SiO2@CdTe),以適配體偶聯(lián)的核殼型磁性微球為載體,以互補鏈DNA偶聯(lián)的CdTe@SiO2@CdTe為熒光來源,通過互補鏈DNA與適配體之間的雜化反應(yīng)構(gòu)建了一種磁控適配體傳感探針,并將其應(yīng)用于花生中赭曲霉毒素A的檢測[19]。又如,Weng等利用量子點和適配體設(shè)計了一種微流體傳感系統(tǒng)用于花生致敏原的測定。首先,通過親和素和生物素的選擇性相互作用將親和素修飾的量子點與生物素化的適配體進行偶聯(lián),再加入氧化石墨烯進行孵育,得到量子點-適配體-氧化石墨烯復(fù)合探針(Qdots-aptamer-GO complexes)。然后,根據(jù)該復(fù)合探針接觸目標過敏原時適配體發(fā)生構(gòu)象變化對熒光信號的影響程度,分析目標物的含量。該研究結(jié)果表明利用所建立方法僅需約10 min即可實現(xiàn)對花生中過敏原(Arah 1)的定量測定,且方法的靈敏度和選擇性均得到顯著提高[20]。此外,有研究者將量子點與其它發(fā)光納米材料結(jié)合,構(gòu)建檢測體系。郭佳佳將適配體與量子點-金納米粒子之間的熒光內(nèi)率效應(yīng)相結(jié)合,建立了一種新型的基于適配體的熒光方法檢測小分子,用于測定果蔬中啶蟲脒的殘留[21]。

2.2 上轉(zhuǎn)換納米粒子型探針

稀土摻雜上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子(Upconversion nanoparticles,UCNPs)是一類重要的發(fā)光材料,它可以在較低能量的長波輻射激發(fā)下,發(fā)射出較高能量的短波輻射。與傳統(tǒng)有機熒光基團或染料材料相比,該類材料的激發(fā)光為紅外光,可以有效避免生物體自體熒光的干擾,從而提高檢測的靈敏度及信噪比[22-24]。紅外光對生物組織還有良好的穿透能力,對生物樣品造成光損傷也較小。此外,UCNPs還具有毒性低、發(fā)光強度高、穩(wěn)定性好、Stokes位移大、量子產(chǎn)率高以及毒性低等優(yōu)點,在生物標記和分析檢測等領(lǐng)域有著非常好的應(yīng)用潛力。

目前,上轉(zhuǎn)換發(fā)光型適配體納米探針對食品中有害化學(xué)物質(zhì)、致病性微生物的檢測已有報道。例如,我們課題組曾將恩諾沙星適配體和其互補DNA單鏈分別偶聯(lián)到磁性納米粒子和UCNPs表面,通過適配體與其互補DNA單鏈的雜交作用,構(gòu)建一種集光、磁和分子識別三功能于一體的復(fù)合型納米探針(UCNPs-Aptamer-Fe3O4)。當(dāng)樣品溶液中存在目標分子恩諾沙星時,UCNPs標記的適配體優(yōu)先與目標分子結(jié)合,于是從復(fù)合探針上解離脫落。此時利用外界磁場分離收集余下的納米復(fù)合探針,測定探針在與目標分子接觸前后的熒光信號變化,據(jù)此實現(xiàn)對恩諾沙星的定量測定。檢測原理示意過程見圖1[25]。我們還將該方法應(yīng)用于鱸魚、黑魚、鯰魚和鲅魚等實際水產(chǎn)樣品的分析檢測,得到的回收率范圍為85.1%～98.5%,表明該方法檢測結(jié)果準確。

圖1 上轉(zhuǎn)換發(fā)光型適配體納米探針檢測恩諾沙星[25]Fig.1 UCNPs luminescence-based aptasensor for the selective detection of ENR[25]

此外,上轉(zhuǎn)換的發(fā)射過程是非常復(fù)雜的過程。上轉(zhuǎn)換納米粒子合成過程中,可以通過改變摻雜元素的種類和比例來調(diào)節(jié)上轉(zhuǎn)換發(fā)光光譜,進而獲得多色上轉(zhuǎn)換熒光材料?；谠擃惒牧?構(gòu)建的多色可調(diào)控型適配體熒光探針,為食品中多種安全因子同時檢測提供了新思路。例如,Duan等人選擇兩種不同稀土元素摻雜的上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm分別與沙門氏菌和金黃色葡萄球菌適配體進行偶聯(lián),得到熒光探針。最后在同一激發(fā)波長下可以同時得到兩種上轉(zhuǎn)換材料的不同發(fā)射峰,通過發(fā)射峰的熒光強度對各自標記的靶標進行同時定量檢測[26]。

2.3 貴金屬納米粒子

貴金屬(Au,Ag,Pt等)納米簇指的是由若干原子組成的一般具有納米級尺寸的分子聚集體。與較大粒徑的金屬顆粒相比,納米簇的尺寸接近于傳導(dǎo)電子的費米波長時,由于獨特的分裂能級和量子尺寸效應(yīng),就可受激發(fā)生電子躍遷而產(chǎn)生較強熒光。例如有人以納米Pt增敏魯米諾發(fā)光為信號源構(gòu)建適配體熒光探針。Miao等人將含有適配體的雙鏈DNA抗體固定在磁性納米材料表面得到捕獲磁微球,再用含有適配體的雙鏈DNA和氯化血紅素/G-四鏈體標記納米Pt-魯米諾得到示蹤組件,通過雙鏈適配體與其抗體的相互作用將以上兩種材料偶聯(lián)構(gòu)建了一種復(fù)合探針。當(dāng)復(fù)合探針體系中有氯霉素存在時,雙鏈DNA中的適配體優(yōu)先與氯霉素結(jié)合,復(fù)合探針結(jié)構(gòu)被破壞,示蹤組件從捕獲磁微球表面脫落。由于示蹤組件中氯化血紅素/G-四鏈體和納米Pt可催化魯米諾-H2O2體系發(fā)出熒光,收集體系中解離的示蹤組件并測定其熒光信號,進而可根據(jù)熒光信號的強弱來判斷氯霉素的含量[27]。

2.4 其它

適配體熒光納米探針發(fā)展迅速,除了以上分類,還有學(xué)者將本不具有發(fā)光特性的納米材料與熒光物質(zhì)結(jié)合,構(gòu)建出熒光納米材料,并將這些材料應(yīng)用于適配體探針的開發(fā)。例如,二氧化硅基熒光納米粒子是將光學(xué)性能相匹配的熒光物質(zhì)富集于一個二氧化硅納米粒子內(nèi)部得到的具有特定熒光特性的納米材料。與普通有機染料相比,這類熒光硅納米粒子的信號顯著提高,一個納米粒子的熒光信號是其內(nèi)部染料分子的成千上萬倍。在實際分析應(yīng)用過程中,二氧化硅陣列作為一個保護殼,能有效保護內(nèi)部熒光染料免受外界環(huán)境的干擾,有效提高光學(xué)穩(wěn)定性。此外構(gòu)建探針所選用的二氧化硅介質(zhì)具有易于修飾、生物相容性好等優(yōu)點,有助于將適配體偶聯(lián)在其表面,作為生物分析探針應(yīng)用[28]。He等人通過反相微乳液法制得聯(lián)釕吡啶摻雜的二氧化硅熒光納米粒子,再將金黃色葡萄球菌的適配體修飾到二氧化硅熒光納米粒子表面,發(fā)展了基于適配體功能化二氧化硅熒光納米探針的雙色流式術(shù),并將該方法用于金黃色葡萄球菌的檢測。研究結(jié)果表明所建立的方法兼具適配體探針的高特異性、二氧化硅熒光納米粒子信號放大效應(yīng),以及雙色流式細胞術(shù)減少假陽信號等特點。利用該方法對緩沖液和牛奶樣品進行測定,得到檢出靈敏度為1.5×102cells/mL和7.6×102cells/mL[29]。

此外,近年來有研究者們發(fā)現(xiàn)一些碳納米材料經(jīng)過一定修飾與處理后能夠表現(xiàn)出發(fā)光特性,并將這一特性引入到光學(xué)生物傳感分析的相關(guān)研究中。例如,單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes,SWNTs)是由一層或多層石墨層片按照一定螺旋角卷曲而成的,直徑為納米級的一維納米無縫管。起初研究者們主要集中于利用SWNTs能夠猝滅有機染料、量子點等的高猝滅特性開發(fā)傳感分析技術(shù)[30-31]。然而近年來有報道表明,這種材料經(jīng)過表面活性劑、核酸等功能化后,隨著表面DNA二級結(jié)構(gòu)從B型轉(zhuǎn)變?yōu)閆型,SWNTs的介電環(huán)境發(fā)生變化,導(dǎo)致其熒光譜帶紅移,進而產(chǎn)生近紅外熒光[32]。Cha等人以胰島素為靶標分子,將SWNTs的近紅外熒光特性與適配體的特異性識別相結(jié)合,開發(fā)了一種針對活細胞信號分子的無創(chuàng)實時監(jiān)測平臺。他們把胰島素適配體功能化的SWNTs置于細胞培養(yǎng)液中,當(dāng)細胞代謝產(chǎn)生的胰島素與適配體結(jié)合后,引發(fā)SWNTs的熒光信號猝滅,據(jù)此實現(xiàn)定量分析。與基于能量轉(zhuǎn)移或電子遷移過程猝滅SWNTs共價范圍內(nèi)π堆疊構(gòu)建的傳感方法不同的是,實驗中的猝滅現(xiàn)象是由于光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移機制所導(dǎo)致的,這也為碳納米粒子更廣泛的應(yīng)用于傳感分析領(lǐng)域提供保障[33]。雖然Cha等人所構(gòu)建的方法是針對于醫(yī)療領(lǐng)域中胰島素的測定分析,但該研究為新型食品安全檢測技術(shù)的開發(fā)提供了新的思路,研究者們可以利用該機制,將胰島素適配體替換為以食品安全因子為靶標的適配體,開發(fā)出更多靈敏度高、檢測快速的適用于食品安全檢測的新型熒光納米探針。

3 在食品安全檢測方面的應(yīng)用

隨著納米傳感技術(shù)的快速發(fā)展,國內(nèi)外已有文獻對基于適配體的光學(xué)探針在化學(xué)、環(huán)境、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域進行綜述。相對而言,其在食品安全檢測方面的應(yīng)用仍處于起步階段。將適配體特異性識別和納米材料修飾技術(shù)互補結(jié)合,構(gòu)建熒光傳感探針,無疑為食品中有害化學(xué)物質(zhì)、食源性致病菌等危害因子的監(jiān)測提供了一種新型、高效和快捷的檢測分析平臺。以下重點介紹了適配體熒光納米探針技術(shù)在有害化學(xué)物質(zhì)和致病性微生物兩類食品安全因子檢測方面的應(yīng)用。

3.1 有害化學(xué)物質(zhì)

農(nóng)藥、獸藥、非法添加物、微生物毒素等有害化學(xué)物質(zhì)一直是食品安全的重點檢測對象。例如氯霉素屬于酰胺醇類廣譜抗生素,已禁止應(yīng)用于食品動物,美國FDA、歐盟、中國等相關(guān)標準都規(guī)定動物性食品中不得檢出氯霉素。但養(yǎng)殖業(yè)中的濫用導(dǎo)致動物性產(chǎn)品中仍有氯霉素殘留現(xiàn)象。Miao等以氯霉素適配體為識別元件,CdSe/ZnS型量子點為熒光信號源構(gòu)建了具有囊泡結(jié)構(gòu)的復(fù)合探針。利用該探針對食品中微量抗生素殘留進行定量分析,得到方法的線性范圍0.001～10 nmol/L,檢測限達0.3 pmol/L。此外,研究者還將該方法與傳統(tǒng)的ELISA方法進行比較,證明其方法選擇性高,檢測準確[34]。

由于微生物毒素引起的食物中毒事件次數(shù)和中毒人數(shù)始終位于首位,已被公認為屬于食品安全重點關(guān)注領(lǐng)域。例如,金黃色葡萄球菌腸毒素,是一種典型的微生物毒素,能夠引起包括食物中毒和中毒性休克綜合癥等重大食源性疾病。黃玉坤將適配體和多色鑭系摻雜KGdF4納米顆粒構(gòu)建熒光納米探針,利用該探針實現(xiàn)對三種金黃色葡萄球菌腸毒素(SEA、SEB和SEC1)的同時檢測。得到的SEA的線性范圍為0.08～10 ng/mL,檢測限為0.062 ng/mL;SEB的線性范圍為0.10～9 ng/mL,檢測限為0.069 ng/mL;SEC1的線性范圍為0.05～5 ng/mL,檢測限為 0.040 ng/mL[35]。

食品中有害化學(xué)物質(zhì)種類繁多,利用不同類型的適配體熒光納米探針對食品中(如孔雀石綠[36]、雙酚A[37]、土霉素[38]、赭曲霉素A[39-40]等其它有害物質(zhì))的檢測也有報道。這些研究為其在食品安全檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用提供積極的推動作用。

3.2 致病性微生物

致病性微生物(Pathogenic bacteria)是指能引起疾病的微生物,也稱病原微生物。金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌是食品中常見的兩種致病菌。Kurt等人分別用金黃色葡萄球菌適配體和鼠傷寒沙門菌適配體標記量子點和上轉(zhuǎn)換納米粒子兩種不同的熒光材料,然后再將其連接到磁性納米粒子表面,得到復(fù)合探針。當(dāng)體系中存在目標物時,根據(jù)該探針在325 nm和980 nm下的激發(fā)光下的信號變化,可實現(xiàn)對食品中兩種致病菌的同時測定。研究結(jié)果得到金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門菌的檢出限分別為16 cfu/mL和28 cfu/mL。Kurt等人的研究為進一步開發(fā)高通量型適配體熒光探針提供了理論依據(jù)[41]。

4 結(jié)論與展望

近年來,適配體作為一種新興分子識別元件備受關(guān)注,已成為分析檢測領(lǐng)域的研究熱點。隨著納米科技的興起,將熒光納米材料與適配體有機結(jié)合構(gòu)建的適配體熒光納米探針因具有靈敏度高、特異性強、制備和操作過程簡單、快速等優(yōu)點,在食品安全檢測領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。基于該類探針構(gòu)建的傳感檢測技術(shù)被廣泛研究和開發(fā)。然而,能夠應(yīng)用于食品檢測中的適配體種類仍然有限,針對一些重點檢測的食品安全因子如抗生素、重金屬離子等開發(fā)出更多高效的適配體,將對該類探針技術(shù)在食品安全檢測領(lǐng)域的發(fā)展具有積極的推動作用。此外,如何實現(xiàn)食品中有害化學(xué)物質(zhì)、致病性微生物等有害目標因子從單一識別向多元化檢測也是該技術(shù)的未來重要發(fā)展方向。其中建立高通量、集成化、多功能、復(fù)合型探針傳感技術(shù)是難點,可通過篩選廣譜型適配體序列、制備多色可調(diào)控?zé)晒馓结樀仁侄螖U展檢測范圍,進而攻克這一難點。總之,隨著適配體熒光納米探針理論研究和技術(shù)進步,適配體熒光納米探針技術(shù)將為復(fù)雜食品基質(zhì)中有害物質(zhì)的高通量快速分析帶來新的思路與發(fā)展契機,在保障食品安全方面發(fā)揮巨大作用。

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Research progress of fluorescent nano probe based
on aptamer in food safety detection

LIU Xiu-ying,CUI Ying-ying,SU Li-hong,ZHU Li-jie,TANG Yi-wei,GAO Xue,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province, National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

In recent years,the aptamer has attracted much attention due to their advantages including high specificity,high affinity,and easy to modify and functional. Additionally,fluorescent nanomaterials have been widely investigated as novel marking materials for their unique luminescent properties. A novel fluorescent probe with good selectivity,high stability and high sensitivity can be developed by combining the specific binding ability of aptamer with luminescent properties of fluorescent nanomaterials. Recently,the establishment of simple and efficient detection technology based on the above probe has become a hot spot in the field of food safety detection and analysis. In this review,the detection principle and classification of the probe were summed up. Its application in quantification of harmful chemical substances,and pathogenic microorganisms in food safety and detection were then emphatically introduced. Finally,the future development trends of this technique were prospected.

aptamer;fluorescent nano probe;food safety and detection

2016-11-04

劉秀英(1987-),女,博士,講師,研究方向:食品質(zhì)量與安全,E-mail:xiuyingliu727@126.com。

遼寧省自然科學(xué)基金指導(dǎo)計劃(20170540017);國家自然科學(xué)基金項目(31601510)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)10-0395-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.068