乙醇處理對鮮切荸薺黃化及相關酶的影響

姜 悅,何鳳平,鐘慧玲,王藜穎,潘永貴

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

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乙醇處理對鮮切荸薺黃化及相關酶的影響

姜 悅,何鳳平,鐘慧玲,王藜穎,潘永貴*

(海南大學食品學院,海南?？?570228)

以荸薺為試材,研究10%、20%、30%和40%乙醇處理對鮮切荸薺黃化及相關酶的影響。結果表明:在貯藏期間,不同濃度乙醇處理均不同程度地抑制了鮮切荸薺L*值的下降。隨著乙醇濃度增加,b*值和C*值上升幅度均逐漸減小。與此相對應,鮮切荸薺組織內柚皮素和圣草酚含量的增加均隨乙醇濃度增加而減小。同時,鮮切荸薺內苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase,PAL)、查爾酮異構酶(Chalcone isomerase,CHI)和類黃酮3′-羥化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)活性變化趨勢隨乙醇濃度增加均逐漸減緩?？傊?不同濃度乙醇對控制鮮切荸薺組織黃化均有一定效果。其中,10%和20%的乙醇處理在短期內作用效果顯著(p<0.05),而30%和40%乙醇作用維持時間較長且效果顯著(p<0.05)。

鮮切荸薺,乙醇處理,黃化,柚皮素,圣草酚

荸薺(Eleocharistuberose),又稱馬蹄、水栗等。味甜多汁,營養(yǎng)豐富。荸薺經去皮、切分和包裝等預處理可以大大方便消費者食用,滿足現代人們快節(jié)奏生活的需要。但是,經過鮮切的荸薺在短時間內會出現表面變黃現象,影響產品外觀。目前針對鮮切荸薺的護色保鮮,主要方法有熱處理法[1]、乙醛熏蒸處理[2]、涂膜保鮮[3-4]等,但是熱處理溫度和貯藏時間的交互作用會顯著影響鮮切荸薺的色澤,乙醛熏蒸處理加速鮮切荸薺中還原性抗壞血酸降解,特殊化學藥劑容易存在安全隱患[5]。為此,需要尋找控制鮮切荸薺黃化更為安全有效的措施。

乙醇被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認定為安全性物質,具有良好的護色功效,可作果蔬安全性保鮮劑[6-7]。研究表明,乙醇處理可有效地降低鮮切西蘭花貯藏期多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,改善產品感官品質,延長貨架期[7];在鮮切山藥中,采用乙醇處理同樣可有效地抑制其褐變相關酶活性和褐變的發(fā)生[8];還可有效延緩蘋果果肉衰老,抑制果肉表面氧化變色等[9]。但是,尚未發(fā)現關于乙醇處理對黃化控制方面的報道,因此,本研究以鮮切荸薺為對象,分別采用不同濃度乙醇處理,以研究貯藏過程中乙醇處理對鮮切荸薺組織黃化及相關酶的影響,為鮮切荸薺產品保鮮技術的發(fā)展提供一定的理論依據。

1 材料及方法

1.1 材料與儀器

荸薺 海南大學南門果蔬店購得,選取新鮮且形狀、大小比較一致的荸薺,剔除爛、蟲、病果和機械傷果,于4 ℃下預冷過夜;次氯酸鈉、L-苯丙氨酸 西亞試劑公司,分析純;β-巰基乙醇、查尓酮、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、二硫蘇糖醇(DTT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、還原型輔酶Ⅱ(NADPH)、牛血清蛋白 Solarbio公司;抗壞血酸鈉、亞硫酸鈉 上海麥克林生化試劑公司;柚皮素、圣草酚(純度98.0%) 西力生物公司;甲醇、乙腈 美國TEDIA公司,色譜純;無水乙醇、鹽酸、冰醋酸、甲酸、磷酸 廣州化學試劑廠,分析純。

Agilent 1260高效液相色譜儀 美國Agilent公司;TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;TGL-16M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司;Konica Minolta CR-10色差儀;塑料膜、塑料淺盒 海南右道貿易有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 材料處理 將預冷荸薺清洗、去皮后,立即放入100 μg/L的次氯酸鈉溶液中殺菌10 min后撈出晾干。然后隨機分成5組,分別用0%(CK)、10%、20%、30%和40%的乙醇溶液浸泡10 min,撈出瀝干。隨后用塑料膜結合淺盒(20.5 cm×13 cm×1.5 cm)包裝,每組15盒。然后于(10±1) ℃、相對濕度85%±1%的恒溫箱內貯藏。分別于第0、3、6、9和12 d對不同濃度處理的鮮切荸薺表層組織進行隨機取樣,共5組,每組取樣品50 g置于樣品袋中,并于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 相關指標測定

1.2.2.1 荸薺色度 用色差儀測定。

1.2.2.2 柚皮素和圣草酚含量 參照何鳳平等[10]的方法進行測定。

1.2.2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性 參照崔彥玲、劉亞光等[11-12]的方法,略作修改。稱取鮮切荸薺組織表層樣品1.0 g,于4 ℃預冷研缽中,加入0.05 mol/L硼酸緩沖液(pH8.8,內含5 mmol/Lβ-巰基乙醇、0.1% Triton X-100和1% PVP)5 mL及少量石英砂,冰浴中研磨,離心20 min(12000 r/min,4 ℃),上清液即為粗酶液。取0.5 mL粗酶液,加入3.5 mL硼酸和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯丙氨酸,于37 ℃水浴中保溫60 min后,立即加入0.2 mL 6 mol/L的HCl終止反應。其中,對照以0.5 mL PAL樣品提取液代替。隨后于290 nm下測定PAL活性,以每分鐘OD值變化0.01為一個PAL活性單位(U),酶活力單位為U/(g FW·min)。

1.2.2.4 查爾酮異構酶(CHI)活性 參照趙習武[13]和Lister等[14]的方法略作修改。取鮮切荸薺組織表層1.0 g,放入4 ℃預冷研缽中,加入5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5,內含1% PVP、50 mmol/L抗壞血酸鈉、10 mmol/L DTT和0.1% Triton X-100)和少量石英砂,冰浴中研磨,離心20 min(4 ℃,12000 r/min),上清液即為CHI粗酶提取液。取0.4 mL粗酶液,加入4 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L、pH7.5,內含7.5 mg/mL牛血清蛋白和50 mmol/L NaHSO3),100 μL 1 mg/mL查尓酮溶液引發(fā)反應,45 ℃恒溫水浴中保溫30 min。其中,空白以0.4 mL蒸餾水代替酶液。于381 nm波長處測定CHI活性,以每分鐘OD變化0.01為一個CHI活性單位(U),酶活力單位為U/(g FW·min)。

1.2.2.5 類黃酮3′-羥化酶(F3′H)活性 參照Larson、Schwinn等[15-16]的方法,略作修改。取鮮切荸薺組織表層1.0 g,放入4 ℃預冷研缽中,加入5 mL Tris-HCl緩沖液(0.1 mol/L、pH7.65,內含2.5 mmol/L DTT和1% PVP和0.1% Triton X-100)和少量石英砂,冰浴研磨為勻漿,離心20 min(4 ℃,12000 r/min),上清液即為F3′H粗酶提取液。取0.4 mL粗酶液,加入4 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液、10 μL NADPH和0.8 mL柚皮素(1 mg/mL),振蕩混勻后,30 ℃恒溫水浴30 min。通過加入100 μL飽和EDTA溶液引發(fā)反應。以0.4 mL蒸餾水代替,其余反應體系相同為空白。于290 nm波長處測定F3′H活性,以每分鐘吸光度變化0.01來表示一個F3′H活性單位(U),酶活力單位為U/(g FW·min)。

1.2.3 數據統(tǒng)計分析 所有數據重復測定3次,取平均值。運用SPSS軟件進行數據分析,采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行差異顯著性分析(p<0.05 有顯著差異,p<0.01 有極顯著差異)。

2 結果與分析

2.1 乙醇處理對鮮切荸薺黃化的影響

由圖1(A)可見,經過乙醇處理的鮮切荸薺表面亮度隨貯藏時間延長,均呈下降趨勢。未經乙醇處理的鮮切荸薺在貯藏結束(第12 d)時L*值降低了30.2%,表面顏色變暗。而不同濃度乙醇處理均不同程度地抑制了鮮切荸薺表面亮度的下降。其中,10%乙醇處理組在前9 d可保持有較高的亮度值,之后顯著下降,表面顏色變暗。20%、30%和40%乙醇處理組鮮切荸薺在12 d后L*值僅分別降低了9.93%、7.81%和10.1%,抑制效果顯著,且三組間亮度變化差異不顯著(p>0.05);與L*值變化相反,b*值和C*值在貯藏過程中均呈上升趨勢(圖1(B)和(C))。隨著乙醇濃度的增加,b*值和C*值上升幅度均逐漸減小。而與其相對應,鮮切荸薺表面變黃并逐漸加深,組織色澤飽和度逐漸增加,這與潘永貴等[12]的報道一致。其中,未經乙醇處理的鮮切荸薺在第12 d時,b*值增加了2.8倍,表面黃化顯著。10%乙醇處理組b*值變化雖然低于對照組,但與對照間無顯著差異(p>0.05)。20%和30%的乙醇處理對鮮切荸薺表面黃化具有明顯的抑制效果。尤其是40%乙醇處理組b*值在貯藏結束時(第12 d)與貯藏初期相比僅增加了0.2倍,表明40%乙醇處理對延緩鮮切荸薺表面黃色加深有極顯著效果(p<0.01)。

圖1 乙醇處理鮮切荸薺L*值(A),b*值(B),C*值(C)的變化Fig.1 Changes of L* value(A),b* value(B),C* value(C) in ethanol treated fresh-cut Chinese water chestnut

2.2 乙醇處理對柚皮素和圣草酚含量影響

與大部分鮮切果蔬不同,鮮切荸薺在貯藏過程中呈現出黃化現象。對鮮切荸薺黃化物質分離鑒定表明,鮮切荸薺表層組織黃化中主要物質是黃酮類化合物中的柚皮素和圣草酚[17-18]。由圖2可見,隨著貯藏時間延長,未經乙醇處理的鮮切荸薺組織中柚皮素和圣草酚含量均大幅增加,且遠遠高于乙醇處理組。而不同濃度的乙醇處理均不同程度地抑制了二者的上升。對于柚皮素,40%乙醇處理組柚皮素含量在貯藏過程中基本維持不變,僅比貯藏初期增加了0.5倍,與對照組柚皮素含量增加了50倍相比,有極顯著抑制效果(p<0.01)(圖2A);對于圣草酚,不同乙醇濃度處理組之間,除了10%處理組從第6 d開始有所增加,并在第9 d后呈現下降趨勢外,其余乙醇處理組均極顯著地抑制了圣草酚含量上升(p<0.01),在整個貯藏過程中變化不顯著(圖2B)。本研究表明,隨著鮮切荸薺黃化的發(fā)生,鮮切荸薺組織中柚皮素和圣草酚含量(尤其在前9 d)同樣呈現上升趨勢,柚皮素和圣草酚含量與鮮切荸薺黃化之間呈現出明顯相關性。通過乙醇處理,伴隨著柚皮素和圣草酚含量上升受到抑制,鮮切荸薺黃化也明顯受到抑制。也進一步證明了鮮切荸薺黃化與柚皮素和圣草酚密切相關。

圖2 乙醇處理鮮切荸薺柚皮素(A)和圣草酚(B)含量變化Fig.2 Changes of naringenin(A)and eriodictyol(B)content in ethanol treated fresh-cut Chinese water chestnut

2.3 乙醇處理對鮮切荸薺黃化過程中關鍵酶活性的影響

2.3.1 乙醇處理對PAL活性影響 柚皮素和圣草酚均屬于黃酮類化合物。黃酮類化合物主要通過次生代謝途徑生成,其中PAL是次生代謝途徑——苯丙烷代謝途徑中的關鍵酶,連接初級代謝和苯丙烷類代謝,催化苯丙氨酸生成肉桂酸,進而生成黃酮等次生代謝產物[19]。如圖3所示,未經乙醇處理的和經10%乙醇處理的鮮切荸薺組織內PAL活性在整個貯藏過程中均一直呈上升趨勢;而20%～40%乙醇處理組中PAL活性在貯藏前3 d均呈現出下降趨勢,且乙醇處理濃度越高,下降幅度越大,3 d后與貯藏初期相比分別下降了5.1%、15.6%和21.8%。隨后均開始上升,但其活性始終低于對照和10%乙醇處理組。表明不同濃度的乙醇處理對PAL活性的增加有不同程度抑制效果。其中，30%和40%的乙醇作用效果更為顯著(p<0.05),且兩組間無顯著差異(p>0.05)。其中,對照組PAL活性在第9 d后突然顯著上升,可能與貯藏過程中微生物的侵染有關[19]。

圖3 乙醇處理鮮切荸薺在貯藏過程中PAL活性變化Fig.3 Changes of PAL activity in ethanol treated fresh-cut Chinese water chestnut during storage

2.3.2 乙醇處理對CHI活性影響 CHI是合成黃酮類化合物的關鍵酶之一,是柚皮素和圣草酚直接相關酶。CHI是位于類黃酮代謝途徑第二個限速酶,植物體內合成查爾酮后,通過CHI的催化作用,可以進一步轉化生成二氫黃酮類化合物,如柚皮素[20-21]。如圖4所示,所有鮮切荸薺中CHI活性均呈現出先上升后下降的趨勢。其中,在貯藏前6 d,各組上升幅度均較低,但從第6 d開始上升幅度增加。尤其是對照組和10%乙醇處理組,到第9 d CHI活性分別變?yōu)橘A藏初期的3.9倍和3.8倍,而在貯藏后期呈現下降趨勢(第9 d開始)。并且,乙醇處理組鮮切荸薺CHI活性的變化始終低于對照組。其中,10%和20%乙醇處理組CHI活性在前6 d內處于較低狀態(tài),之后均顯著上升,說明低濃度乙醇在短期內可對CHI活性的增加有抑制作用。30%和40%乙醇處理組CHI活性在貯藏過程中始終處于平緩狀態(tài),到第9 d僅增加為初期的1.3倍和1.2倍,顯著低于對照組(p<0.05),說明較高濃度的乙醇抑制鮮切荸薺組織內CHI活性增長效果顯著。

圖4 乙醇處理鮮切荸薺在貯藏過程中CHI活性變化Fig.4 Changes of CHI activity in ethanol treated fresh-cut Chinese water chestnut during storage

2.3.3 乙醇處理對F3′H活性影響 F3′H同樣是柚皮素和圣草酚直接相關酶。F3′H作為生成類黃酮物質的核心酶,位于黃酮生物合成途徑重要的分支上,為生成柚皮素等黃酮代謝途徑提供前體物。同樣在類黃酮合成途徑中起關鍵作用[22],其中柚皮素是F3′H最適底物[23],柚皮素通過F3′H的催化進一步生成圣草酚。如圖5所示,在貯藏期間,未經乙醇處理的鮮切荸薺組織內F3′H活性在貯藏前3 d有所增加,隨后開始下降。各乙醇處理組F3′H活性均低于對照組,表明不同濃度乙醇處理對F3′H活性增加均有一定抑制效果。其中,10%和30%乙醇處理組F3′H活性在達到峰值后下降迅速,后期保持在較低的穩(wěn)定狀態(tài)。20%和40%乙醇處理組F3′H活性下降趨勢雖有所減緩,但仍有良好抑制效果。貯藏結束時(第12 d),對照組F3′H活性比貯藏初期降低了19.8%,而在30%的乙醇作用下,F3′H活性比貯藏初期降低了36.7%,顯著低于對照組(p<0.05)。說明較高濃度乙醇,尤其是30%的乙醇處理對F3′H活性的抑制效果顯著。對鮮切荸薺組織中F3′H分離純化和性質研究也表明,F3′H活性明顯受到乙醇抑制[24]。

圖5 乙醇處理鮮切荸薺在貯藏過程中F3′H活性變化Fig.5 Changes of F3′H activity in ethanol treated fresh-cut Chinese water chestnut during storage

乙醇處理可以有效地抑制苯丙氨酸酶(PAL)、查爾酮異構酶(CHI)和類黃酮3′-羥化酶(F3′H)活性,尤其是30%和40%的乙醇處理可以較長時間抑制這些酶的活性。從而說明,在鮮切荸薺組織中黃化以及柚皮素和圣草酚的抑制,正是這些酶活性受到抑制的結果。

3 結論

本研究表明,不同濃度乙醇處理均可不同程度地抑制鮮切荸薺組織黃化的發(fā)生。與此相對應,鮮切荸薺組織內兩種主要的黃化物質——柚皮素和圣草酚含量的增加也均隨乙醇濃度增加而受到抑制。同時,隨乙醇濃度增加,鮮切荸薺內苯丙氨酸酶、查爾酮異構酶和類黃酮3′-羥化酶(F3′H)活性上升趨勢均逐漸減緩。其中,10%和20%的乙醇處理在短期內作用效果顯著,而30%和40%乙醇作用維持時間較長且效果顯著,但二者間差異不顯著。

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Effect of ethanol treatment on fresh-cut Chinese water chestnut etiolation and the related enzymes

JIANG Yue,HE Feng-ping,ZHONG Hui-ling,WANG Li-ying,PAN Yong-gui*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Chinese water chestnut was used as material to investigate the effect of 10%,20%,30% and 40% ethanol on fresh-cut Chinese water chestnut etiolation and the related enzymes. The results showed that during storage,ethanol treatment of different concentrations inhibited the decrease ofL*value in varying degree. And the rising amplitude ofb*value andC*value gradually decreased with ethanol concentration increasing. Correspondingly,the increase of naringenin and eriodictyol content in etiolation tissues of fresh-cut Chinese water-chestnut decrease with increasing ethanol concentration. At the same time,with increasing ethanol concentration,the activity change trends of Phenylalanine ammonia lyase(PAL),Chalcone isomerase(CHI)and Flavonoid 3′-hydroxylase(F3’H)in fresh-cut Chinese water-chestnut were gradually slow down. All in all,different concentrations ethanol had a certain effect on controlling fresh-cut Chinese water chestnut tissue etiolation. Among them,the 10% and 20% ethanol treatment had significant effects just in a short term(p<0.05),but the 30% and 40% ethanol treatment could maintain for a long time and the effects were significant(p<0.05).

fresh-cut Chinese water-chestnut;ethanol treatment;etiolation;naringenin;eriodictyol

2016-12-20

姜悅(1995-)，女，大學本科，研究方向：食品科學與工程，E-mail:Jiangy6978@126.com。

*通訊作者:潘永貴(1970-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理和貯運保鮮技術，E-mail:yongui123@126.com。

國家自然科學基金項目(31360414)。

TS255.3

A

1002-0306(2017)10-0326-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.054